Sec-1位点缺失对1BL/1RS易位系籽粒品质的影响

昝香存，李正玲，常莹莹，董海滨，高 崇，韩留鹏，郭 瑞，赵明忠，胡 琳，许为钢

(河南省农业科学院作物分子育种研究院/河南省小麦生物学重点实验室/河南省麦类种质资源创新与改良重点实验室，河南郑州 450002)

1BL/1RS易位系在中国小麦品种中分布广泛[1]。黑麦1R染色体短臂(1RS)上携带有很多抗病基因[2-4]，同时具有很好的丰产性和适应性[5-6]；然而，由于1RS上Sec-1位点编码的γ-黑麦碱、ω-黑麦碱会引起小麦面团耐揉性减弱、面团发黏、加工品质变劣等问题[7-9]，在一定程度上限制了1BL/1RS易位系在小麦遗传改良中的广泛应用。

为提高1BL/1RS易位系在小麦育种中的应用价值，可通过三种途径来改良和提高1BL/1RS易位系的加工品质：一是通过优质高分子量谷蛋白亚基(HMW-GS)的导入、聚合，可在一定程度上弥补由Sec-1位点造成的不良影响[10-12]，如HMW-GS 5+10对与1RS易位相关的面团强度损失有一定的补偿作用[13]；二是通过染色体工程技术，在1RS染色体中去除引起面团发粘的Sec-1基因位点，引入有利品质的Glu-B3/Gli-B1基因位点，保留抗病基因和与丰产性连锁的基因。Koebner等[14]利用Ph1b突变体和5B染色体缺失体诱导1DL/1RS、1BL/1RS易位，使1RS、1DS发生重组产生二级重组体，获得1DS中Gli-D1和Tri-D1分离以及1BS中Sec-1和SrR分离的重组体，产生的新易位系中携带叶锈抗性基因，还具有GLi-D1位点，取代了1RS上的Sec-1位点，对面团质量产生正向效应。Lukaszewski[15]通过同源重组法，在Attila和Hahn小麦品种中成功导入与面团强度相关的Gli-B3/Gli-B1位点，并去除了引起面团发粘的Sec-1位点，获得了1RS/1RSWW(不含Sec-1，含Glu-B3/Gli-B1)近等基因系，又通过1RS与1RSWW杂交获得1RSWR(不含Sec-1和Glu-B3/Gli-B1)/1RSRW(含Sec-1和Glu-B3/Gli-B1)近等基因系，研究结果显示，在正常灌溉条件和水分胁迫条件下，1RS易位系的籽粒产量、冠层水分状况、光合能力、生物产量均高于或优于1RSWW、1RSRW，而与1RSWR易位系之间没有差异；三是通过遗传工程沉默ω-黑麦碱基因。柴建芳等[16]构建了ω-黑麦碱基因沉默表达载体,并通过农杆菌介导转化小麦品种金禾9123，在获得的ω-黑麦碱基因沉默的转基因株系中面筋指数、沉降值和稳定时间均显著提高,而其千粒重和产量均未受到不良影响。这些研究表明，聚合优质亚基，去除黑麦碱基因Sec-1位点、导入Gli-1和Glu-3位点以及沉默黑麦碱编码位点Sec-1，都是改良1BL/1RS小麦易位系品质的可行性技术 途径。

1RS携带的抗病基因具有重要的农艺价值，因此提高和改良1BL/1RS易位系的品质一直是小麦育种研究的重要课题。通过染色体工程去除Sec-1位点以及去除后对抗病性和农艺性状影响的研究颇多，但国内外鲜见去除Sec-1位点后对品质影响的研究。本研究利用本课题组育成的郑麦7698与Sec-1位点缺失的衡观35突变体轮回杂交获得的BC3F4和BC3F5代姊妹系为材料，研究Sec-1位点缺失易位系和正常1BL/1RS易位系之间的品质效应差异，以期为改良1BL/1RS 易位系的品质，提高其在品质育种中的利用价值提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

郑麦7698是本课题组选育的高产优质小麦品种，综合抗性较好，聚合了品质优异基因Ax1/Bx7+By9/Dx5+Dy10、条锈病抗性基因Yr9/YrZH84、白粉病抗性基因Pm2/Pm4b/Pm8，是1BL/1RS易位系。Sec-1位点缺失的衡观35突变体由中国科学院遗传发育所分子农业生物学研究中心王道文课题组创制。2012年从中国科学院遗传发育所分子农业生物学研究中心引进了Sec-1位点缺失的衡观35突变体与郑麦7698杂交的F1代。通过分子标记在F2代筛选获得缺失Sec-1位点的易位系，后又2次与郑麦7698回交，经过连续多代选择，获得本研究中的BC3F4代和BC3F5代基因纯合的姊妹系。2017年和2018年分别将获得的稳定遗传的基因纯合的株系种植在河南省农科院试验基地，采用随机区组设计试验，2次重复，每个株系种植2行，行长4 m，株距 0.03 m，行距0.20 m，同时种植郑麦7698作为对照。田间栽培管理措施一致，保证肥水条件，并适时防治虫害及田间杂草，不进行任何病害防治。

1.2 分子标记检测

越冬期进行田间叶片取样，每个株系取10株。参照CTAB法[17]提取植株叶片的基因组DNA。利用SSR标记Bmac0213,对材料进行黑麦碱编码基因Sec-1位点进行检测[18-19]。引物序列为Bmac0213-F：ATGGATGCAAGACCAA AC；Bmac0213-R：CTATGAGAGGTAGAGC AGCC，目的片段为524 bp。PCR反应体系为10 μL，含模板DNA(50 ng·μL-1)1 μL，Taq酶 (5 U·μL-1)0.2 μL(北京天根生化科技公司)，上、下游引物(20 mmol·L-1)各0.2 μL，dNTP(10 mmol·L-1)0.2 μL，10×PCR缓冲液1 μL，用ddH2O补充反应体系至10 μL。PCR扩增程序：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性45 s，50 ℃退火40 s，72 ℃延伸40 s，35个循环；72 ℃延伸 10 min。用1.2%琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物。

1.3 抗病性鉴定和农艺性状调查

条锈病采用接种鉴定的方法，从甘肃天水农科所订购条锈菌混合菌种(条中32、条中33、贵22-9、贵22-4、水4和水5)，于2018年3月上旬将小麦条锈菌与滑石粉按1∶500的比例混合均匀，用抖粉法接种在株系行头，接种后第2 d开始喷水保湿3 d；于2018年4月28日发病盛期，按照GB/T15795-200X“小麦条锈病测报技术规范”调查条锈病的发病情况，并计算病情指数。河南省农科院原阳试验基地为白粉病常年高发区域，因此白粉病是在自然发病条件下，按照NY/T 613-2002“小麦白粉病测报调查规范”于2018年5月15日调查白粉病的发病情况，并计算病情指数。

每个株系随机选取10个单株调查其株高和穗粒数，成熟期适时收获，每个株系各收1 m进行脱粒，将种子晒干后称千粒重和总重，并计算株系的千粒重和产量。收获的种子不进行药剂熏蒸，经后熟后进行品质测定。

1.4 品质性状测定

根据籽粒水分含量和硬度计算润麦加水量，将样品的水分含量都调整至16%。按照AACC26-20方法，用3皮3心的布勒实验磨制粉。出粉率控制在60%～70%之间。将所得面粉装入保鲜袋，放置两周后进行品质测定。

蛋白质含量按照NY/T3-1982方法测定。

湿面筋含量和面筋指数用瑞典Perten公司的Glutomatic 2200面筋自动分析仪，按GB/T5506.2-2008方法测定干、湿面筋含量及面筋指数；粉质参数用德国Brabender公司的粉质仪(Farinograph)按GB/T14614-2006方法测定。

采用美国National MFG公司生产的揉面仪按照AACC54-40A方法测定和面时间、衰落值、中峰值高度、中峰值宽度、8 min尾宽等面团流变学特性。

1.5 统计分析

用Excel对品质指标在Sec-1位点缺失易位系和正常易位系之间进行成组数据的平均数比较，并进行T测验分析。

2 结果与分析

2.1 育成材料 Sec-1位点的PCR检测结果

对不同的回交转育后代群体进行PCR检测，早代进行单株PCR检测，连续多代选择后在2017年BC3F4代选育出40个品系，其中Sec-1位点缺失易位系有26个，正常易位系有14个(图1)。2018年对BC3F5代的40个株系进行PCR检测，结果与2017年的一致，表明这些株系是稳定纯合的品系。

2.2 Sec-1位点缺失易位系和正常易位系间蛋白质含量和面筋品质的差异

2017年和2018年连续二年，分别对26个Sec-1位点缺失易位系和14个正常易位系的蛋白质含量、面筋品质进行测定。从表1可以看出，2017年Sec-1位点缺失易位系的蛋白质含量和湿面筋含量分别为14.06%和33.74%，均略高于正常易位系；2018年Sec-1位点缺失易位系的蛋白质含量和湿面筋含量分别为13.87%和33.86%，均略低于正常易位系。两年的成组数据T测验结果显示，Sec-1位点缺失易位系和正常易位系之间的蛋白质含量和湿面筋含量差异均不显著，P值分别为0.297和0.656。2017年和2018年Sec-1位点缺失易位系与正常1Bl/1RS易位系之间的干面筋含量差异均不显著，P值分别为 0.198和0.872。表明Sec-1位点的缺失对蛋白质含量、干面筋含量和湿面筋含量均无显著影响。

2017年和2018年Sec-1位点缺失易位系面筋指数分别为81.16%和80.73%，正常易位系面筋指数分别为68.07%和67.55%，两年的变化趋势一致，均为Sec-1位点缺失易位系面筋指数高于正常易位系，且成组数据T测验结果显示，二者之间的差异均达极显著水平(P<0.01)。说明Sec-1位点的缺失有利于面筋指数的提高。

2.3 Sec-1位点缺失易位系和正常易位系间粉质参数的差异

从表1可以看出，2017年Sec-1位点缺失易位系和正常易位系的吸水率分别为 64.51%和65.78%，前者极显著低于后者；2018年Sec-1位点缺失易位系和正常易位系的吸水率分别为 64.68和65.68%，二者之间的差异达显著水平 (P<0.05)。

表1 Sec-1位点缺失易位系和正常易位系之间的品质性状差异Table 1 Difference of grain quality traits between the Sec-1 deletion and normal translocation lines

2017年Sec-1位点缺失易位系和正常易位系的形成时间分别为8.96和7.48 min，二者之间的差异达显著水平(P<0.05)；2018年Sec-1位点缺失易位系和正常易位系的形成时间分别为 9.39和6.76 min，差异达极显著水平(P< 0.01)。

2017年和2018年Sec-1位点缺失易位系的稳定时间分别为9.32和9.50 min，正常易位系的稳定时间分别为7.32和6.37 min，两年度Sec-1位点缺失易位系的稳定时间均极显著高于正常易位系(P<0.01)。

2017年和2018年Sec-1位点缺失易位系的粉质质量指数分别为129.11和131.11，正常易位系的粉质质量指数分别为 102.19和95.14，Sec-1位点缺失易位系均高于正常易位系，且二者之间的差异均达极显著水平(P<0.01)。

从粉质参数的测定结果来看，Sec-1位点缺失对粉质参数的正向效应作用明显，吸水率显著降低，面团形成时间、稳定时间和粉质质量指数均显著升高。

2.4 Sec-1位点缺失易位系和正常易位系间揉面参数的差异

2018年对26个Sec-1位点缺失易位系和14个正常易位系的揉面参数进行测定。从表1可以看出，Sec-1位点缺失易位系的和面时间极显著高于正常易位系；Sec-1位点缺失易位系的峰值高度为47.16 cm,略高于正常易位系，但二者之间差异不显著；Sec-1位点缺失易位系的衰落角显著低于正常易位系，而中峰值宽度和8 min尾宽均显著大于正常易位系(P<0.05)。这说明Sec-1位点缺失后，面团耐柔性增强、品质明显 改善。

2.5 Sec-1位点缺失易位系和正常易位系间抗病性和农艺性状的差异

2018年对26个Sec-1位点缺失易位系和14个正常易位系的抗病性和农艺性状进行鉴定。由表2可知，Sec-1位点缺失易位系和正常易位系的条锈病病情指数分别为21.24和16.88，二者之间差异不显著； 但Sec-1位点缺失易位系的白粉病病情指数显著高于正常易位系(P<0.05)。说明Sec-1位点缺失使白粉病抗性显著降低，而对条锈病抗性的影响不显著。

表2 Sec-1位点缺失易位系和正常易位系之间抗病性和农艺性状差异(2018)Table 2 Difference of disease resistance and agronomic traits between the Sec-1 deletion translocation lines and normal translocation lines (2018)

Sec-1位点缺失易位系和正常易位系的株高分别为79.48和78.20 cm，前者显著高于后者 (P<0.05)。而Sec-1位点缺失易位系的千粒重、穗粒数、产量水平均略低于正常1BL/1RS易位系，但两者之间差异均未达到显著水平，P值分别为 0.081、0.675和0.055。说明Sec-1位点缺失对株高的影响显著，而对千粒重、穗粒数和产量水平的影响不显著。

3 讨 论

3.1 Sec-1位点缺失对蛋白质含量和面筋品质的影响

面筋指数是衡量面筋强度的一个重要指标，众多研究表明，蛋白质组分和面筋强度的变化与1RS相关[20-22]。在1BL/1RS易位系与非1BL/1RS系的品质对比研究中，发现1BL/1RS易位主要影响蛋白质(面筋)质量，而对蛋白质(面筋)数量的影响较小[7]。本研究利用Sec-1位点缺失突变体与郑麦7698(1BL/1RS易位系)三次回交，系谱法辅助分子标记连续多代选择，建立了Sec-1位点缺失易位系和正常易位系的近等基因系，品质测定结果表明，Sec-1位点缺失易位系与正常易位系之间的蛋白质含量、湿面筋含量和干面筋含量无显著差异，而Sec-1位点缺失易位系面筋指数明显提高，且与正常易位系之间差异达极显著水平，说明Sec-1位点去除后，面筋强度明显增强。这与柴建芳等[16]利用ω-黑麦碱基因沉默株系研究蛋白质含量和面筋品质的变化结果一致。Graybosch等[21]研究表明，1RS的存在可显著改变蛋白质组成的变化。面粉中蛋白质组成比例的改变是造成品质不良、面筋强度减弱的主要原因[20-21]，尤其是不溶性谷蛋白大聚体含量的减少是引起面筋强度减弱的关键因素[20,23-24]。在本研究所获得的Sec-1位点缺失的易位系中，可能由于Sec-1位点缺失导致水溶性Secalin蛋白的含量降低，不溶性谷蛋白大聚体的含量升高，最终导致面筋指数明显升高。本研究的不足之处是没有测定不同品系之间的Secalin蛋白和不溶性谷蛋白大聚合体的含量，因此，关于ω-黑麦碱对面筋强度的弱化作用机理值得进一步研究。

3.2 Sec-1位点缺失对粉质参数和揉面参数的影响

1RS臂的引入使得1BL/1RS易位系的吸水率增加[7]，而吸水率的增加与粘性面团的形成有关[25]。本研究所获得的Sec-1位点缺失易位系比正常易位系的吸水率显著降低，这可能会在一定程度上消除易位系的面团粘性，从而改善面团机械化加工操作性能。Sec-1位点缺失后，其编码的γ-黑麦碱和ω-黑麦碱受到抑制，而黑麦碱是一种水溶性单体蛋白[25]，大量吸水后又很快溶解，使面团的吸水性增大、持水性降低，致使面团发粘。从本研究结果来看，Sec-1位点缺失后，可改善1BL/1RS易位系面团发粘的加工品质缺陷。

1BL/1RS易位对粉质参数和揉面参数的影响明显，尤其是对稳定时间、和面时间、衰落角、峰值宽度等指标影响大[7,26-27]。本研究所获得的Sec-1位点缺失的易位系，其面团形成时间、稳定时间、粉质质量指数、和面时间、峰值宽度和8 min尾宽等指标均显著提高，可见Sec-1位点缺失后，易位系的面团品质得到提高和改善，正向作用显著。

3.3 Sec-1位点缺失对抗病性和农艺性状的影响

1RS臂携带抗病基因Lr26、Sr31、Yr9和Pm8[2-3]，对提高小麦产量有积极影响[1,15]。前人利用诱导同源重组技术开展了Sec-1位点缺失易位系的创制和遗传应用研究[14，28]，尝试多位点易位重组改良1BL/1RS易位系，缓解由于1RS的导入带来的关于小麦加工质量下降的问题。本研究利用Sec-1位点缺失的突变体与郑麦7698(1BL/1RS易位系)多次回交，目的是想获得既要去除Sec-1位点，又要保留抗病基因的新材料，对所获得的Sec-1位点缺失易位系的抗病性和农艺性状进行了鉴定，结果表明，Sec-1位点缺失易位系的条锈病和白粉病抗性均降低，但条锈病抗性与正常易位系之间差异不显著，而白粉病抗性差异则达显著水平；对农艺性状的鉴定结果表明，Sec-1位点缺失对千粒重、穗粒数、产量水平的影响均不显著。此外，本研究中Sec-1位点缺失易位系的不同株系间条锈病和白粉病的表型存在差异，条锈病病情指数变异范围为11.37～38.12(文中未列出)，白粉病病情指数的变异范围为19.48～38.99(文中未列出)，这可能与缺失编码抗病基因的Sec-1片段大小，或遗传交叉重组过程中易位断点有关[28-29]。这也说明通过有效的筛选，可以得到既有Sec-1位点缺失，也有条锈病和白粉病抗性基因的易位系材料。

本研究选用的郑麦7698聚合了品质优异基因Ax1/Bx7+By9/Dx5+Dy10、条锈病抗性基因Yr9/YrZH84、白粉病抗性基因Pm2/Pm4b/Pm8，利用Sec-1位点缺失的突变体与郑麦7698多次回交来进一步提高和改善其加工品质，既消除和减少1RS带来的加工品质缺陷，同时保留易位系的固有优点，其结果对小麦品质遗传改良具有一定的指导意义。

4 结 论

Sec-1位点的缺失对面筋指数、面团形成时间、稳定时间、粉质质量指数、和面时间、中峰值宽度和8 min尾宽的正向作用明显，对改善和提高品质效果显著，而对产量的影响不明显，这说明Sec-1位点缺失突变体是研究和改良小麦籽粒品质的优良遗传材料，利用其进行品质遗传改良是可行的技术途径。