湖北麦区不同轮作模式下小麦赤霉病菌种群结构和毒素化学型分析

刘美玲，刘 悦，陈婷婷，龚双军，史文琦，曾凡松，杨立军，喻大昭

(湖北省农业科学院植保土肥研究所/农业农村部华中作物有害生物综合治理重点实验室/农作物重大病虫草害防控湖北省重点实验室，湖北武汉 430064)

小麦赤霉病是一种世界范围内危害极重的流行病害，随着全球气温升高、秸秆还田的普及以及免耕技术的推广，小麦赤霉病在全球各小麦产区呈迅速扩张趋势[1]，在近些年份造成小麦严重减产、品质下降，且会使感病麦粒分泌脱氧雪腐镰刀菌烯醇和玉米赤霉烯酮等毒素[2-3]，间接引发食品安全问题。2018年，我国小麦赤霉病发病面积 5.7×106hm2，超过小麦播种总面积的三分之一，其中湖北省发病面积超过40%[3]；2012年，我国小麦赤霉病流行区约发生面积9.3×106hm2[4]。2015 和 2016 两年全球赤霉病平均造成小麦产量损失7.35×108t，直接经济损失达1.45亿美元[5]。另外，病原菌还能产生多种真菌毒素，危害人畜健康及食品安全[6-7]，因此受到世界相关学者们的广泛关注。

小麦赤霉病由多种镰孢菌致病种引起，其中禾谷镰孢菌(F.graminearumsensu strict)是优势致病种。禾谷镰孢菌是一个进化宗系群，早在2008年就被分离和鉴定出24个种的镰孢菌[8]。致病种在不同地域麦区之间差异明显，华北、西北、黄淮流域及其以北麦区F.graminearum为优势致病种群；而长江中下游麦区F.asiaticum为优势致病种群[9-11]。赤霉病菌主要产生B型单端孢霉烯族(trichothecene)毒素，此类毒素主要分为脱氧雪腐镰刀菌烯醇(deoxynivalenol，DON)和雪腐镰刀菌烯醇(nivalenol，NIV)两类真菌毒素，其中DON又可进一步细分为3-ADON、15-ADON两种衍生物毒素[12]。温、湿度等气象条件、多样的种植方式在较大程度上影响着病原菌的地理分布[13]；此外，不同的小麦栽培品种和不同的轮作制度也与病原菌类型有着很大的关系[14]，如Lee等[15-16]研究表明，在朝鲜水稻-小麦轮作区的赤霉病菌以F.asiaticum为主，而玉米-小麦轮作区的赤霉病菌以F.graminearum为主。研究发现，小麦-玉米轮作田赤霉病发生较重，而将轮作植物由玉米换成大豆后赤霉病感染率显著下降；在常年种植非禾谷类农作物的大田中很难分离到赤霉病菌[17]。考虑到湖北小麦主产区以玉-麦轮作和稻-麦轮作为主，本研究拟在湖北襄阳主产麦区的襄州区和枣阳市分别选择长期水稻-小麦和玉米-小麦轮作田块取样分析，以明确不同轮作方式对小麦赤霉病菌种群和毒素化学类型的影响，为赤霉病的大田防治决策提供参考依据。

1 材料和方法

1.1 样品采集和分离

2019和2020 两年度从湖北省襄阳市襄州区和枣阳市不同轮作模式田块于小麦灌浆期分别采集小麦赤霉病病穗样品，其中，采样点襄州区原种场、牛首镇以及枣阳市太平镇为玉-麦轮作田块，襄州区张家集镇何岗村、枣阳市吴店镇蒋庄村为稻-麦轮作田块。每个采样田块棋盘式随机取 15～20株具有明显发病症状的小麦穗，用信封袋装好编号。采用组织分离法进行分离，即将小麦病穗的病健交接处剪成1～2 cm的短节，先置于2%次氯酸钠溶液中浸泡消毒1 min，再用75%酒精消毒1 min,无菌水冲洗3次，用灭菌滤纸吸干水分后将样品置于含100 ug·mL-1硫酸链霉素的PDA培养基中，置于25 ℃培养箱培养3 d，获得各分离物。

1.2 分离物形态学初步鉴定、菌株单孢纯化与 保存

镰孢菌的初步形态学鉴定是以分离物在PDA培养基上菌落颜色和形态以及在绿豆培养基中产生的分生孢子形态等为依据[18-19]。在PDA培养基上培养1 d后有绵白色细长菌丝，3 d后PDA培养基出现浅洋红色，7 d后菌丝长满整个培养基，培养基颜色变为紫红色，颜色呈辐射状由深到浅，即可初步判定其为镰孢菌。将这些初步鉴定为镰孢菌的分离物，用直径1 cm的打孔器打菌饼接种至5%的绿豆汁培养基中，在恒温摇床中26 ℃、180 r·min-1培养3 d；将镜检能观察到大量中间有隔的镰刀状分生孢子稀释到1×103个·mL-1；将3%水琼脂用灭菌刀片分割成边长3 mm的小块，点接1 μL孢子液，在显微镜16×10视野下观察，挑取只有一个孢子的水琼脂块。将该琼脂块移动到PDA培养基中， 25 ℃培养3 d后，挑取菌丝块于50%甘油中，-70 ℃长期保存。

1.3 镰孢菌致病种的分子鉴定

采用DNA试剂盒(Omega Bio-Tek公司)提取筛选的镰孢菌株基因组DNA。DNA用1.2 %的琼脂糖凝胶电泳检测后，放于-20 ℃冰箱中保存备用。利用引物 Fg16F/R对提取物进行PCR扩增，其中F.asiaticum扩增产物片段大小为 500 bp，F.graminearum扩增产物片段大小为 400 bp[20]。PCR反应程序：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，53 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35个循环；72 ℃ 10 min；10 ℃ +∞。试验用引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成,具体引物序列见表1。扩增产物均用1.2 %琼脂糖凝胶电泳检测、照相。

1.4 镰孢菌毒素化学型的鉴定

采用引物3CON、3NA、3D15A和 3D3A进行PCR检测，根据带型大小区分所产毒素的类型[28]，其中，产 NIV毒素扩增产物为 840 bp，产 15ADON 毒素为 610 bp，产 3ADON 毒素为 243 bp(图2)。PCR反应程序：94 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，53 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，35个循环；72 ℃ 10 min，10 ℃ +∞。试验用引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成,具体引物序列见表1。

表1 扩增引物Table 1 Primers for PCR amplification

2 结果与分析

2.1 不同轮作模式下小麦赤霉病菌种群结构

通过形态学和分子生物学鉴定，共从湖北省襄阳市、枣阳市稻-麦轮作田和玉-麦轮作田分离出191株赤霉病菌，通过PCR对其进行分类，结果见表2。其中，玉-麦轮作田共分离菌株62株，F.graminearum占62.90%，F.asiaticum占37.10%；稻-麦轮作田分离菌株129株，F.graminearum占6.98%，F.asiaticum占93.02%。说明玉-麦轮作田优势种是F.graminearum，稻-麦轮作田优势种是F.asiaticum。

表2 供试菌株的来源、种群类型Table 2 Sources and species composition of the tested strains

M: 100 bp DNA ladder; 1～5:分离菌株 Isolated strains

2.2 不同轮作模式下小麦赤霉病镰孢菌致病种与毒素化学型的关系

通过PCR检测NIV、3-AcDON、15-AcDON结果如表3所示。191株赤霉病菌中,11株产生NIV毒素，180株产生DON毒素;两种轮作模式均以产生DON毒素为主。稻-麦轮作田中，共检测到120个菌株产DON毒素，其中87.50%产生3-AcDON毒素，12.50%产生15-AcDON毒素。玉-麦轮作田中，共检测到60个菌株产DON毒素，其中31.67%产生3-AcDON毒素，68.33%产生15-AcDON毒素。稻-麦轮作田中，F.asiaticum以3-AcDON为主，占比86.67%；F.graminearum以15-AcDON为主，占比66.67%。玉麦轮作田中，F.asiaticum主要产生3-AcDON，占65.22%；F.graminearum既可能产生15-AcDON又可能产生3-AcDON。

表3 191株镰孢菌菌的来源、类型及其产毒素类型Table 3 Source of the 191 Fusarium，species and toxin chemical types strains

M: DL2000;1～10:产毒素样品 Samples of toxigenic

3 讨 论

多种镰孢菌可以引起小麦赤霉病，赤霉病菌优势种因地区及不同轮作方式而异。Qu等[21]和Zhang等[22]研究认为，赤霉病菌种群分布受气温、纬度影响，年平均气温低于15 ℃纬度高的凉爽省份以F.graminearum种群占比较大，而年平均气温高于15 ℃纬度低的省份以F.asiaticum种群占比较大。然而，温度并不是影响小麦赤霉病菌种群分布的决定因素，小麦的不同轮作方式对镰孢菌种群的分布影响更大。方兴州等[23]和Lee等[24]的研究表明，水稻-小麦轮作区F.asiaticum是主要的优势群体，玉米-小麦轮作区F.graminearum是主要的优势群体。卢丽斌[25]研究发现，安徽省同一经纬度、同一气候条件下，不同前茬作物对对镰孢菌种群具有明显影响。本研究中，襄阳和枣阳所选择的水稻-小麦和玉米-小麦轮作区的取样点分别只有10 km左右距离，平均气温、纬度相差不大，发现在玉米-小麦轮作区，镰孢菌分离株中F.graminearum的占比为66.67%，在水稻-小麦轮作区，镰孢菌分离株中F.asiaticum占比高达90%以上。与卢丽斌[25]结论一致。不同轮作方式对赤霉病菌优势种的影响可能与病原菌对前茬作物的偏好性有关。F.graminearum相对于镰孢菌的其他种对玉米具有寄主偏好性，稻茬对F.asiaticum具有一定的选择作用[26]。本研究结果表明，湖北省小麦赤霉病菌F.asiaticum和F.graminearum的分布与种植模式显著相关。

小麦赤霉病不仅影响其产量，更重要的是染病麦粒含有多种赤霉毒素，危害人畜健康，引发粮食安全问题。在一年一熟的水稻种植区，F.asiaticum主要产生NIV毒素[27-28]。在本研究中，产生毒素的差异可能是小麦对产生3-AcDON毒素的F.asiaticum选择而造成。我国长江中下游麦区是世界上唯一的一年两熟大范围稻-麦轮作区，赤霉病菌种群经过了水稻和小麦的选择，产生3-AcDON毒素的F.asiaticum在水稻和小麦上适应性强逐渐成为优势种，而一年一熟的水稻种植区没有小麦选择的压力，NIV又对水稻具有偏好性，因而成为优势种[26，29]。本研究中，湖北稻-麦轮作区F.asiaticum以产生3-AcDON毒素为主，仅检测到少量的NIV菌株，这与前人报道结论一致[10-11]，玉-麦轮作区15-AcDON毒素比例的上升与分离到的F.graminearum菌株上升有关。报道杨美欣[29]，产DON(3ADON和15ADON)的F.g和F.a菌株致病力要高于产 NIV的F.a菌株，这也说明湖北省相对于四川省小麦赤霉病重发的一个原因。本研究认为，湖北小麦赤霉病菌的种群组成与毒素化学型存在一定的相关性。除受温度、不同轮作模式等影响之外，不同生态区赤霉病菌毒素化学型的分布是否还受土壤、地质等其他因素影响尚需进一步研究。