小麦不同进化材料叶与非叶器官C4光合酶活性及δ13C值差异

魏爱丽，杨 茂，黄 琴，张英华，王志敏

(1.中国农业大学农学院，北京 100193；2.山西太原师范学院生物系，山西太原 030031)

植物稳定碳同位素比率(δ13C)是辨别鉴定植物光合代谢途径、水分利用效率等生理生态特性的有效指标[10-11]。在植物光合作用过程中，由于光合羧化酶(RuBP羧化酶与PEP羧化酶)及其羧化作用在时空上的差异对13C有不同的识别和排斥能力，导致C3、C4、CAM植物具有显著不同的δ13C值，C3植物的δ13C值为-20‰～ -35‰(平均为-26‰)，C4植物为-7‰～-15‰(平均为-12‰),CAM植物为-10‰～-22‰(平均为-16‰)[11-12]。因此，依据δ13C值可区分C3、C4、CAM植物，也可分析不同器官的光合特征差异。

普通小麦在进化过程中经历了由2n经4n到6n的染色体异源多倍化过程，不同倍数染色体组小麦种的遗传背景不同，光合特性表现出较大的差异[13-17]，有关进化过程中叶片RuBP羧化酶活性的变化已有研究[15-17]，但在进化过程中不同绿色器官的C4途径酶活性如何变化？其活性及其变化与光合速率的种间差异有何关系？这些问题却很少有报道。本研究对不同染色体倍数小麦种的不同器官PEP羧化酶等C4途径光合酶的活性及δ13C值进行了考察，以期明确小麦进化过程中C4代谢酶活性的变化趋势，为发挥不同器官的光合作用潜力、挖掘和利用高光效种质资源提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

所选材料为进化过程中不同染色体倍数小麦种及其近缘种(表1)。材料种植于中国农业大学科学园内，每材料种4行，重复3次，越冬期地膜覆盖，安全越冬。在小麦出苗后，在各重复小区选择12株主茎进行标记。在各材料开花盛期选生长一致的标记主茎，从茎基部剪断后插入盛水桶中立即带回实验室，在室内冰台上分器官进行取样，取样器官包括旗叶(叶片中部)、旗叶鞘(叶鞘中部)、穗下节间(伸出叶鞘部分)及穗中部小穗(5个小穗)的护颖、成花外颖和芒，各器官鲜样一部分立即用于酶活性测定，一部分烘干后用于稳定碳同位素δ13C测定分析。

1.2 测定方法

1.2.1 酶活性测定

取各器官新鲜样品(0.5 g)按Camp等[18]的方法进行酶液的提取，提取缓冲液为0.1 mol·L-1Tris-HCl(pH 7.4)，含1 mmol·L-1EDTA，7 mmol·L-1巯基乙醇，10%(w/v)甘油和1%PVP。按1∶6冰浴研磨，15 000 g离心15 min，上清液即为酶提取液。粗提液中可溶性蛋白含量的测定采用考马斯亮兰法[19]；RuBP羧化酶和PEP羧化酶活性测定按陈根云[20]和查静娟[21]方法，反应体系为1 mL，用紫外分光光度计追踪340 nm 处光密度的下降值，并计算酶活力；苹果酸酶和苹果酸脱氢酶的测定按Sayre等[22]的方法稍作改进，反应体系为1 mL。

1.2.2 稳定碳同位素δ13C分析

按Samejima[23]的方法测定。将上述开花盛期所取各器官样品在80 ℃下烘干至恒重，研磨粉碎并过80目筛。取各器官3～5 mg 粉样封入燃烧管中，加少量的氧化铜，以铂(Pr)做催化剂，真空密闭后，800 ℃下反应半小时。释放出的CO2用MAT-251质谱仪测定稳定碳同位素δ13C和δ12C，以PDB化石的碳同位素为基准(标准)，按公式δ13C=(R样品/R标准-1)计算样品的δ13C值，其中R为样品或标准的13C/12C比率。

表1 试验材料 Table 1 Experimental materials

1.3 数据分析方法

采用Excel 2010进行数据处理，用DPS数据处理系统进行方差分析，用Duncan新复极差法检测差异显著性。

2 结果与分析

2.1 不同绿色器官PEP羧化酶活性的变化

从表2可以看出，小麦不同种的各器官中均含有PEP羧化酶。在不同器官间，二倍体小麦和四倍体小麦的各非叶器官PEP羧化酶活性均高于旗叶，各器官PEP羧化酶活性平均值表现为外颖>护颖>穗下节间、叶鞘>芒>旗叶；六倍体小麦穗颖的PEP羧化酶活性也高于旗叶。随着染色体倍数从二倍体增加到六倍体，旗叶PEP羧化酶活性呈现明显增加的趋势，而各非叶器官PEP羧化酶活性则多表现为显著降低。

2.2 小麦进化过程中不同绿色器官RuBP羧化酶活性的变化

不同小麦种间各器官的RuBP羧化酶活性存在差异(表3)。在不同器官间，各小麦种均表现为旗叶RuBP羧化酶活性高于非叶器官；在不同种间，尽管RuBP羧化酶活性的种间变异性较大，但随着小麦染色体倍数的增加，旗叶与非叶器官的平均RuBP羧化酶活性均呈增加的趋势，六倍体普通小麦品种各器官RuBP羧化酶活性均显著高于二倍体野生一粒小麦。

2.3 不同绿色器官PEP羧化酶/RuBP羧化酶(PEPC/RuBPC)活性比值的变化

PEPC/RuBPC活性比值可反映C4代谢酶和C3代谢酶的相对活性大小及其变化。由表4可知，从二倍体到四倍体再到六倍体的进化过程中，小麦旗叶PEPC/RuBPC平均活性比值趋向增加，而各非叶器官均趋向降低；二倍体小麦种各非叶器官的PEPC/RuBPC平均活性比值显著高于六倍体小麦，特别是二倍体小麦穗颖的PEPC/RuBPC平均活性比值高于1，显示其器官中C4代谢活性明显高于C3代谢活性。

2.4 不同绿色器官C4途径其他酶活性的变化

从表5～表7可以看出，除六倍体小麦种芒的NAD苹果酸酶活性稍低于旗叶，其余小麦种所测非叶器官(叶鞘、芒、穗下节间、护颖、外颖)的NAD(P)苹果酸酶(NADP-ME)、NADP-苹果酸脱氢酶(NADP-MDH)活性均高于旗叶。随着小麦染色体倍数的增加，旗叶平均NADP-ME、NADP-MD活性显著增加，而非叶器官的这些C4酶活性均呈下降趋势。

表2 小麦进化过程中不同器官PEP活性的变化 μmol·mg-1·h-1

表3 小麦进化过程中不同器官RuBP羧化酶活性的变化 μmol·mg-1·h-1

表4 小麦进化过程中PEPC/RuBPC活性比值的变化Table 4 Change of PEPC/RuBPC ratio in different organs in wheat evolution materials with various ploidy

表5 小麦进化过程中NAD苹果酸酶活性的变化 U·mg-1·min-1

2.5 稳定碳同位素(δ13C)值的变化

对野生一粒麦、野生二粒麦和普通小麦品种京411的叶片及穗器官稳定碳同位素(δ13C)值进行了测定,结果(图1)表明，穗器官的δ13C值高于旗叶，前者为-23.8‰～-25.4‰，后者为 -25.5‰～-26‰，六倍体栽培品种与野生一粒麦和野生二粒麦比较，旗叶δ13C值增高，而非叶器官的δ13C值降低。

3 讨 论

本试验结果表明，小麦不同种的C3、C4途径酶活性在不同器官间均存在差异，所有进化阶段的小麦的C3途径酶活性均表现为旗叶显著高于非叶器官，而二倍体和四倍体小麦C4途径酶活性表现为非叶器官显著高于旗叶，当小麦进化至六倍体时，旗叶的PEPC酶活性显著提高，仅次于颖片。有关C3植物不同绿色器官中，PEPC和RuBPC的存在及其活性差异已有报道，小麦穗器官中PEP羧化酶活性明显高于旗叶，而RuBPC的活性则以旗叶大于穗器官[8-9，24-25]，这些结果均与本试验的结果相类似。值得注意的是，不同进化材料比较，非叶器官C4途径酶(PEPC、NADP-MDH、NADP-ME、NAD-ME)活性以二倍体和四倍体较高，而叶片的C4途径酶活性却随着染色体倍数的增加而有增加趋势，这表明在小麦进化和染色体倍性增加过程中不同器官的C4途径代谢活性呈现出不同的变化趋向，二倍体小麦及其近缘种的非叶器官具有较强的C4代谢活性。

表6 小麦进化过程中NADP苹果酸脱氢酶活性的变化 U·mg-1·h-1

表7 小麦进化过程中NADP苹果酸酶活性的变化 U·mg-1·h-1

图1 小麦不同种不同器官稳定碳 同位素(δ13C)值Fig.1 Stable carbon isotope (δ13C) values of different organs in various species of wheat

δ13C的生理学意义已被确认为鉴别植物光合途径的准确方法[12]。C3植物的δ13C值平均为-26‰，C4植物为-12‰，CAM植物为-16‰。这种分辨作用直接反映了碳同位素质量差异对RuBPC和PEPC的羧化反应阻抗与CO2在叶内阻抗的不同。利用碳同位素技术区分C3、C4和CAM植物已经是很成熟的方法，而δ13C的小范围变化是研究者最为感兴趣的。

Zicgler-Jons[25]指出，小麦穗的所有苞叶、燕麦和大麦的内外颖可能属于C3-C4中间型。 Sanchez-Bragado 等[27]研究表明，穗器官的δ13C值在C3植物的范围内。Bont 等[9]通过碳同位素和稳定碳同位素等试验证明，C3植物的穗器官中可能不存在C4途径，但是δ13C的增加说明PEPC可能对初始羧化作用有一定贡献[9-10]。

本试验结果表明，旗叶和穗器官的δ13C值均在C3途径表现的数值范围内，但器官间有明显差异，不同倍性材料穗器官的δ13C值均高于叶片，穗器官中以外颖大于护颖大于芒，可见，穗颖片比叶片更趋近于C4光合途径。但随着染色体倍数的增加，旗叶δ13C值有增高的趋势，而非叶绿色器官却呈逐渐下降趋势。这说明在进化过程中旗叶C4型碳同化活性趋向增强，而非叶绿色器官的C4活性趋向减弱，这与同化酶活性测定的结果趋势相一致。二倍体小麦非叶器官表现出较高的C4同化酶活性和PEPC/RuBPC的相对活性，其与器官光合作用的关系有待进一步探讨。

尽管对小麦非叶器官是否具有C4光合途径存在争议[7,9]，但最近仍有报道显示小麦籽粒C4光合途径的证据[28]。从本试验结果看，C4途径代谢酶在不同种的不同器官中均有一定的表达，特别是非叶器官表现出较强的C4光合酶活性。非叶器官中C4途径酶的生理作用需要深入研究，其具有较高的C4代谢酶活性也可能与后期适应高温干旱等逆境有关，在逆境下RuBPC活性易下降，PEPC可能有代谢补偿功能[8，25]。随着染色体倍数的增加，叶片和非叶器官C4代谢酶活性呈现不同的变化趋向性，其原因尚待探索，其意义尚待明确。由于穗及其他非叶绿色器官是小麦生长后期重要光合器官，其对产量形成具有重要贡献[8，10，27]。从进一步提高小麦光合耐逆性和产量的角度出发，我们认为，改良和充分发挥C3植物中C4途径代谢酶的功能作用是有意义的[29-30]，小麦绿色器官特别是非叶器官C4代谢酶活性应该进一步强化，因此野生种和原始栽培种非叶器官C4途径高活性资源值得利用。