不同施肥条件下的小麦籽粒代谢组学研究

贲蓓倍,徐维红,邹德玉,牟美睿,杨仁杰,刘海学

(1.天津农学院，天津 300384;2.天津市植物保护研究所，天津 300112)

肥料是影响农作物代谢过程的重要因素[1]。有研究表明，肥料能让小麦在生育期间保持较高的光合水平[2]，优化冠层结构[3]，使碳化合物积累量增加，并促使同化产物向穗部转运[4]，最终对籽粒中代谢物的含量和类型产生影响。氮肥是影响小麦生长发育的首要养分因子。孙丽敏等[5]发现，氮肥对4个类型生态区冬小麦产量效应最大。小麦蛋白质和淀粉的合成代谢在受氮影响显著[6]。目前，在小麦生产过程中存在滥用氮肥、氮肥利用率下降、施肥不合理等现象[7-8]，加之氮肥种类众多[9-10]，使农户难以抉择。合理的氮肥运筹对小麦生产极为重要。

代谢组学是一门新兴学科，主要是通过生物体受到环境影响后小分子代谢物的动态变化来反映生物体内的生化途径和潜在的分子机制[11]。多元统计学与气相色谱质谱联用技术(GC-MS)结合可以更直观地看到植物生长过程中代谢物的变化。代谢物种类及水平与农作物的营养成分具有相关性[12]。因此，利用代谢组学揭示肥料对作物代谢的影响是可行的。前人在研究小麦籽粒代谢物时，主要是通过化学方法测定糖类或氨基酸类物质的含量，有关代谢组学方法对代谢物的组成和含量研究较少。有关减氮施用多种类型肥料对小麦籽粒代谢物影响的报道更少。鉴于上述原因，本试验拟从代谢组学角度研究不同类型肥料对小麦籽粒代谢物的影响，旨在探究小麦响应肥料的代谢机理，为小麦生产提供施肥新思路。

1 材料与方法

1.1 试验材料与设计

供试小麦品种为中信麦99。试验于2018年10月至2019年6月在天津市武清区崔黄口镇进行。试验田土壤有机质17.23 g·kg-1，pH 8.10，全氮 1.03 g·kg-1，速效磷57.35 mg·kg-1，速效钾157.18 mg·kg-1。

采用随机区组设计，设置5种不同氮肥处理，分别为常规施肥CK和4个减氮施肥处理(缓控释肥一次性基施E，有机肥和缓控释肥配施A，缓控释肥与化肥配施B，专家系统推荐施肥NE)，具体见表1，磷肥、钾肥均为普通化肥。每个处理设置三个重复，每个重复面积为1 hm2。小麦15 cm等行距种植，播种量为375 kg·hm-2。田间管理与当地大田一致。

1.2 测定方法

1.2.1 样品处理

将收获的小麦籽粒经液氮研磨至粉末状，取150.0 mg样品于1 mL离心管，加入1 mL提取液(异丙醇-乙腈-水体积比1∶1∶1)，4 ℃超声提取30 min，4 ℃ 10 000 r·min-1离心1 min，取150 μL上清液吹氮后加入10 μL盐酸甲氧胺吡啶(40 mg·mL-1)，30 ℃水浴90 min；加入30 μL MSTFA+1%TMCS，37 ℃水浴30 min；加入1 mL含有内标物的正庚烷溶液(含20 μg·mL-1十一烷)，过0.22 μm滤膜，得到待 测液。

1.2.2 GC-MS条件

试验仪器为Aglient公司7890 A-5975 C型气相色谱质谱联用仪。色谱条件：Aglient HP-5MS色谱柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)，载气为氦气(纯度99.999%)，不分流进样。升温程序为常温升至60 ℃后维持1 min，以10 ℃·min-1升至280 ℃后维持5 min。质谱条件：电子碰撞内能70 eV，离子源温度230 ℃，四级杆温度 150 ℃，溶剂延迟4.5 min，扫描速度2 scan·s-1，范围50～500 m·z-1，全扫描模式。

1.3 数据处理

用Excel 2019计算小麦籽粒中代谢物含量，同时对保留时间(rt)及峰面积(intensity)进行预处理；利用SIMCA-P 13.1进行主成分分析(PCA)及偏最小二乘法判别分析(PLS-DA)，通过SPSS 26.0对代谢物进行方差分析(ANOVA)，筛选差异代谢物。利用Omicshare Tools对差异代谢物进行热图聚类分析。通过MetaboAnalyst平台对差异代谢物进行代谢途径分析。

2 结果与分析

2.1 GC-MS检测结果分析

用GC-MS检测到小麦籽粒中共有47种代谢物，分别为有机酸12种(26%)、氨基酸10种(21%)、糖类及其衍生物14种(30%)、酯类2种(4%)和其他有机物9种(19%)。

用差异倍数(FC)表示初始值到最终值的变化程度，对差异倍数取对数表示差异的相对变化。以CK为初始值，log2FC是正数为上调，是负数为下调。由表2可见，与CK相比，其他4种处理总代谢物含量均升高，表现为B>NE>E>A>CK。E、B、NE处理的各类代谢物含量与总代谢物含量趋势一致；A处理中，有机酸类和氨基酸类含量的变化与总代谢物呈相反趋势。代谢物对肥料的敏感程度表现为氨基酸类>有机酸类>其他有机物>糖类及其衍生物>酯类。这说明不同施肥处理对小麦籽粒代谢物的影响具有差异性。

表1 各处理施肥情况Table 1 Fertilization of each treatment

2.2 多元统计分析

2.2.1 PCA分析

2.2.2 PLS-DA分析

2.3 差异代谢物筛选

将PLS-DA分析获得的变量投射重要度(variable importance for the projection，VIP)结合方差分析(one-way ANOVA)筛选差异代谢物(VIP>1且P<0.05)[14]，最终得出20种差异代谢物(表2)，分别为糖类及其衍生物(6种，30%)、有机酸(5种，25%)、氨基酸(3种，15%)、酯类(2种，10%)、其他有机物(4种，20%)。

2.4 差异代谢物热图分析

将20种差异代谢物进行热图聚类分析，结果如图3，图3中每一列代表一个样本，每一个格子代表一种代谢物，颜色深浅代表代谢物的含量高低。由图3可见，NE和B聚在一支，CK和E聚在一支，A单独为一支，说明筛选出的差异代谢物能将各处理聚类区分开来。差异代谢物经过聚类也能聚成簇，说明每一簇代谢物可能参与了相同的代谢途径或者具有相似的功能。

表2 不同施肥条件下的小麦籽粒代谢物及差异倍数Table 2 Wheat kernel metabolites and the differences under different fertilization conditions

图1 不同施肥条件下小麦籽粒代谢物PCA得分图Fig.1 PCA score map of wheat grain metabolites under different fertilization conditions

2.5 代谢通路富集

将筛选出的20种差异代谢物导入MetaboAnalyst平台，进行通路分析。经分析映射出20条代谢途径(表3)，包括代谢途径11条，生物合成途径7条，转化途径1条，降解途径1条。其中9条与氨基酸有关，3条与糖类有关。可见肥料类型对小麦籽粒氨基酸类及糖类的代谢和生物合成影响较大。

筛选得出3条与差异代谢物具有显著相关的代谢途径(P<0.05或Impact > 0.2)，分别为氨酰基-tRNA的生物合成，苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成，异喹啉生物碱的生物合成，均与氨基酸代谢和生物合成有关。其中最明显的为氨酰基-tRNA的生物合成途径，有三种差异代谢物富集到此途径上，分别为色氨酸、丝氨酸和异亮氨酸，从差异代谢物热图分析结果(图3)上也能看出，这三种氨基酸被聚在一簇。

图2 不同施肥条件下小麦籽粒代谢物PLS-DA得分图及200次模型检验结果Fig.2 PLS-DA score map of wheat grain metabolites under different fertilization conditions and 200 model test results

表3 不同施肥条件下的小麦籽粒差异代谢物Table 3 Differential metabolites of wheat grains under different fertilization conditions

3 讨 论

3.1 不同施肥处理对小麦籽粒代谢物的影响

氨基酸是评价小麦籽粒营养价值的重要指标之一，氮肥是影响氨基酸合成的重要因素。本试验结果发现，与CK相比，B与NE处理对小麦籽粒中氨基酸含量的提升效果较优。王宜伦等[15]发现，控释氮肥可保证部分氮素在夏玉米生育后期释放，以满足氮素供应，提高氮肥利用率的同时提高籽粒氮积累量，进而促进了籽粒氨基酸的积累。与CK相比，NE处理优化了施氮量及施氮时期。贾良良等[16]研究发现，养分专家系统推荐施肥较农民习惯施肥，氮肥的偏生产力平均提高了93.3%，极大的提高了作物氮素吸收效率。

由此可见，高氮素效率是造成B、NE处理高氨基酸积累量的主要原因。A处理抑制了氨基酸的积累，但差异不明显，这可能与肥料中化肥和有机肥的比例有关[17]。刘树堂等[18]研究发现，在不同施肥条件下，小麦籽粒中各氨基酸的变异系数变化较大(5.27%～13.85%)。在本试验中也出现了类似结果，与CK相比，四个处理小麦籽粒中氨基酸log2FC为-1.01～ 2.42，说明不同施肥条件对氨基酸的影响较大。

可溶性糖作为淀粉的合成底物和蛋白质积累的碳架，具有重要的作用[19]。在本研究中，与CK相比，四个处理均提升了小麦籽粒中糖类的积累量。B处理对糖类含量的促进效果最优，log2FC为0.32。肖 强等[20]研究发现，经各种控释肥处理的小麦籽粒中可溶性糖含量均低于普通化肥，这与本试验结果不一的原因可能是缓控释肥在缓释氮素的同时也缓释了磷、钾素，养分释放高峰期与作物需肥期不一致。而本试验中仅控释了氮肥，磷、钾肥均为普通化肥，养分转化速率高，进而提高了糖类物质的含量。A处理效果次之，log2FC为0.22，有机肥和化肥配施能保障养分的供应，有利于碳水化合物的合成，进而促进了糖类物质的积累[21]。

图3 小麦籽粒差异代谢物的热图聚类分析Fig.3 Heat map of differential metabolites of wheat grains

表4 代谢通路富集结果Table 4 Enrichment results of metabolic pathways

3.2 不同施肥处理对小麦籽粒代谢通路的影响

本试验采用代谢组学方法对小麦籽粒代谢物进行了分析，共得出20条相关代谢通路。氨酰基-tRNA的生物合成、苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成和异喹啉生物碱的生物合成3条通路均与氨基酸合成有关，说明不同施肥条件对小麦籽粒中的氨基酸合成影响较大。其中，氨酰基-tRNA的生物合成通路差异最为明显，色氨酸、丝氨酸和异亮氨酸都被富集到了该通路上。色氨酸和异亮氨酸属于必须氨基酸，是小麦营养价值的一个重要体现[22]。张玉宁等[23]研究发现，在高硝态氮条件下，烟草根系中参与了苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成途径的相关基因表达量上升。本试验在同一氮素水平下，不同的氮肥类型也明显影响了该通路，说明氮肥的使用量和类型均是影响氨基酸生物合成的重要因素。异喹啉生物碱是一类含氮次生代谢物，其合成过程需要苯丙氨酸、色氨酸、赖氨酸和鸟氨酸的衍生物参与，可以累积在特定细胞中起到防御作用，是一种响应不良环境的自我调节机制[24]。

综上所述，不同施肥条件对小麦籽粒代谢物有明显影响，B与NE处理有利于氨基酸含量的积累，B与A处理有利于糖类含量的积累。因此，在生产过程中，若以提高氨基酸含量为目的时，可采取缓控释肥一次性基施或养分专家系统推荐施肥；以提高糖类含量为目的时，可采取缓控释肥一次性基施或有机肥缓控释化肥配施。代谢通路中氨基酸相关通路占比较大，说明通过氨基酸代谢途径研究不同肥料对小麦籽粒代谢物的影响具有可行性，可为进一步探究代谢机理提供理论基础。