小麦-玉米轮作体系中土壤细菌菌群结构及多样性分析

郭丰源，王博文，李文鹏，牛秋红

(1.河南郑州外国语学校,河南郑州 450006；2.南阳师范学院生命科学与技术学院，河南南阳 473061)

冬小麦和夏玉米轮作是我国北方地区传统的种植方式，在实际农业生产实践中应用非常广泛。土壤微生物是土壤生态系统中最为活跃的部分,参与90%左右的土壤反应过程，如有机质降解、腐殖质合成和养分循环等，在土壤物质循环、能量流动及维持土壤生态系统多样性与稳定性方面发挥至关重要的作用[1-4]。研究表明，合理的轮作可以有效改善土壤微生物菌群结构和丰度，有利于提高土壤微生物群落的多样性和稳定性，改善土壤肥力，减少作物病虫害的发生[5-7]。微生物不仅广泛存在于土壤，而且可以栖息在植物表面及内部组织上，在植物生长与发育过程中发挥着重要作用[8-10]。植物与微生物在长期的协同进化过程中，相互并存，相互制约，形成了一种动态平衡关系[11]。然而，土壤中的微生物只有少部分可以通过筛选、纯培养的方法获得，大部分微生物在现有的条件下极难或者无法培养成功，使得许多土壤微生物包含的大量遗传信息难以被发现[12]。

20世纪80年代以来，由于PCR克隆文库、RAPD、SSCP、RFLP、AFLP、DGGE/TGGE和T-RFLP等微生物分子生态学研究方法的逐步建立，可以避开传统的分离培养过程，直接探讨土壤微生物的菌群结构及其与环境的关系[13-15]，使土壤根际微生物多样性、微生物菌群结构和功能、系统发育与分类、土壤微生物与土壤的相互作用及其影响等多领域的研究得以突破[13-14]。近年来，以454和Illumina Miseq为代表的高通量测序以其测序通量高、分析平台方便快捷，迅速成为研究土壤微生物多样性的最重要手段[16-17]。通过高通量测序技术对细菌16S rRNA基因进行测序和分析，已经使玉米、番茄、水稻、大豆等植物根际土壤和根内生细菌群体结构组成和多样性得到深入和全面了解[8,11,17-19]。常规的454和Miseq测序平台得到的序列长度一般在400～500 bp，只能覆盖细菌16S rRNA基因序列1～2个可变区，在分类鉴定上不足以精确鉴定到种属，多被用于植物细菌在门和目水平的分类及其多样性分析[15,20]。

河南是我国小麦和玉米主产区，小麦产量约占全国的27%，玉米约占14%[5]。为了解小麦-玉米轮作体系对土壤细菌及其多样性的影响，本试验采用PCR克隆文库构建、克隆测序并结合基于高通量测序的生物信息学分析技术以及校正的EzBioCloud 16S rRNA基因数据库[21-22]，研究河南典型的冬小麦-夏玉米轮作农田中土壤细菌菌落结构组成、核心菌群及其变化，以期深入了解农田土壤细菌菌群结构组成、动态变化及其与植物生长的关系。

1 材料与方法

1.1 样品的采集与处理

试验设于河南省鲁山县张官营镇白杜孙村，供试田块属于典型的小麦-玉米轮作农田，至少有20年以上的小麦-玉米轮作种植历史。分别在2015年3月14日(初春冬小麦返青期，记为516)、2015年6月6日(冬小麦收割后玉米刚播种，记为716)和2015年7月18日(夏玉米拔节期，记为816)采集土样。按S形在大田内随机选取5个位点,每个点采集5～8 cm土层距植物根2 cm左右的土样0.1 kg,混合后置于密闭塑料袋中,带回实验室备用。

1.2 细菌总基因组DNA的提取

称取1 g土样，利用土壤基因组DNA提取试剂盒(Catalog #12800-50,MOBIO,USA)，按试剂盒操作说明进行土壤细菌总基因组DNA的提取和纯化。提取的基因组DNA用1%琼脂糖凝胶100 V电泳45 min，检测其大小、纯度和浓度。提取的基因组保存于-80 ℃低温冰箱。

1.3 细菌16S rRNA 基因的扩增和文库构建

将1.2中提取的土壤细菌总基因组DNA稀释10倍为模板，采用细菌通用引物:27f(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492r(5′-GGYTACCTTGTKWCGACTT-3′)扩增土壤细菌16S rRNA基因[23]。PCR 扩增条件为：95 ℃ 5 min; 94 ℃ 30 s,59 ℃ 40 s,72 ℃ 2 min,30个循环; 72 ℃延伸10 min。PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳回收后，通过TA克隆技术连接至pMD18-T载体(购自TaKaRa)，转化至Escherichiacoli DH-5α感受态中(购自TaKaRa),涂于添加X-Gal、IPTG和氨苄青霉素的LB平板上，获得细菌16S rRNA基因文库。

1.4 16S rRNA 基因克隆文库的筛选、测序、数据处理和OTU聚类

从16S rRNA基因文库中随机挑取白色克隆,采用载体引物M13RV-P(5′-GGAAACAGCTATGACCATGATTAC-3′)和M13-20(5′-CGA CGTTGTAAAACGACGGCCAGT-3′)进行菌落PCR。挑取阳性克隆送至上海生工，以细菌16S rRNA基因上游引物27f为引物进行测序，测序后经DNASTAR Lasergene 8软件包的SeqMan程序trim，去除两端低质量序列和载体序列，获得的高质量16S rRNA基因序列，进一步参考原始测序图谱对序列中的非ATCG碱基进行人工校对并去除重叠峰序列。根据Chun等[21-22]的方法，通过QIIME分析除去嵌合序列。为了减小样品序列数目不同对分析结果的影响，以样品序列数目最小值为准对三个样品序列数目统一随机抽平。按QIIME要求的数据格式对抽取的序列进行标记和整理，以相似性≥97%的序列作为一个OTU，通过QIIME对所有样品的抽取序列进行OTU聚类。每一个OTU取最丰富序列作为该OTU的代表性序列。分别统计每个样品的OTUs数目和克隆数，并计算样品alpha多样性指数,包括样品的香农指数(Shannon)、Chao指数、辛普森指数(Simpson)以及饱和曲线等。

1.5 细菌的分类、比对和系统进化树构建

将每一个OTU对应的16S rRNA基因代表性序列与校正的EzBioCloud 16S rRNA基因数据库进行比较,鉴定其分类地位，计算每一样品的菌群结构组成。收集每一个OTU对应的代表性序列，通过SeaView的ClustalX 程序进行完全比对。编辑后用SeaView的tree程序构建PhyML系统进化树[24]，对比各个OTU的丰度值。

本研究中得到的所有细菌16S rRNA基因序列已提交到GenBank核酸数据库,序列号为MF002140～MF002365。

2 结果与分析

2.1 细菌16S rRNA基因文库克隆的测序和分析

分别从构建的细菌16S rRNA基因文库平板上随机挑取大约150个左右的白色菌落，经PCR验证为阳性后测序。最终从三个克隆文库中一共得到445个阳性克隆，其中，从样品516中得到148个阳性菌落，有102个测序成功；从样品716中得到144个阳性菌落，有89个测序成功；从样品816中得到153个阳性菌落，有73个测序成功。测序成功的16S rDNA序列长度主要分布在550～750 bp之间，最长为734 bp，最短549 bp，平均长度702 bp，覆盖了16S rRNA基因的V1-V4可变区。716、816样品测序成功率较低，很可能和购买的感受态细胞在低温冰箱保存一段时间后效率下降，或者PCR产物纯化不彻底导致构建文库中假阳性克隆增多有关。

2.2 细菌16S rRNA基因的OTU聚类分析

测序结果经人工校对后得到259条高质量序列，通过QIIME分析鉴定并除去嵌合序列15条，最终得到244条有效序列，其中，样品516有效序列90条，样品716有效序列85条，样品816有效序列有69条。对所有样品的全部有效序列进行OTU聚类，结果显示，三个土壤样品中总共得到190个OTUs，其中，样品516的OTUs数量为75，样品716的OTUs数量为76，样品816的OTUs数量为63。以样品数目最少的816为标准将三个样品的序列数目都按69条序列抽平，重新聚类后三个样品的OTUs数目分别为58、63和63(表1)。

随着被测序列数目的增加，Shannon指数曲线趋于平坦，表明本试验中测序深度基本可以反映样品中细菌多样性和结构组成的真实情况。三个样本的Chao指数表达的物种丰富度以及Shannon和Simpson表达的细菌多样性均存在一定的差异，其中，716和816的物种多样性和丰富度较516高，推测随着气温升高细菌在土壤中的多样性和丰富度逐渐升高。

表1 不同土壤样品的细菌菌群多样性指数Table 1 Diversity indices of bacteria from soil of different samples

516:冬小麦返青期样品；716:小麦-玉米间隔期样品；816:玉米拔节期样品。表中OUT数目是指三个样品序列数目均为抽平后(69条)观察得到的OTU数目。下同。

516:Sample at jointing stage of wheat; 716:Sample at rotation interval; 816:Sample at jointing stage of maize. Observed OTU listed in the table refers to the observed OTU numbers in the three samples after subsamples(69 sequences). The same below.

基于OTU数目的热图(图1)，三个样品之间的OTUs种类和分布具有较高的重叠和一致性，表明在小麦-玉米轮作体系中，不同时期土壤细菌的组成较稳定。但不同样品丰度最高的OTUs所属细菌种类及其丰度明显不同，样品816 OTUs种类和多样性最高，样品516次之，而样品716 OTUs种类和多样性最低。这可能与随着气温升高和农事活动增多细菌在土壤中的积累量增加有关，说明不同时期土壤细菌的优势菌群和物种多样性不同。

图1 不同土壤细菌的OTUs热图Fig.1 Heatmap indicating the abundant OUTs of bacteria from different soils

2.3 不同时期土壤细菌群落数量与组成

对细菌16S rRNA基因序列的分类鉴定结果(图2)表明，在门水平上，三个土壤样品细菌菌群组成基本一致，主要由变形菌门Proteobacteria(33.73%)、拟杆菌门Bacteroidetes(31.50%)、酸杆菌门Acidobacteria(9.28%)、疣微菌门Verrucomicrobia(5.84%)、浮霉菌门Planctomycetes(3.50%)和放线菌门Actinobacteria(1.96%)组成，但不同样品细菌类群的丰度和比例略有不同。在目水平上，主要的优势菌群包括拟杆菌门的Sphingobacteriales(鞘脂杆菌目)、Flavobacteriales(黄杆菌目)、Cytophagales(噬纤维菌目)，变形菌门的Steroidobacter、Rhodospirillales(红螺菌目)、Sphingomonadales(鞘脂单胞菌目)，以及其他酸杆菌门和疣微菌门的一些细菌目。核心OTUs分析表明，Sphingobacteriales、Flavobacteriales、Cytophagales、Steroidobacter、Sphingomonadales为小麦-玉米轮作体系中土壤细菌的核心菌群。总体而言，小麦-玉米轮作体系不同时期土壤细菌的优势菌群构成较稳定，Proteobacteria和Bacteroidetes是最主要的优势菌群，构成Proteobacteria的细菌目组成和比例变化较大，而Bacteroidetes相对稳定

冬小麦拔节期土壤样品(516)中，丰度最高的是Proteobacteria，占35.56%，其次为Bacteroidetes，占31.11%。构成Proteobacteria的细菌主要包括Alpha、Beta、Gamma、Delta -Proteobacteria下的十几个目，其中，Steroidobacter和Sphingomonadales为主要的优势细菌目，所占比例分别为7.78%和5.56%，其余目的细菌所占比例在1%～3%之间。构成Bacteroidetes的细菌菌群相对集中，主要包括三个目，以Sphingobacteriales丰度最高(21.11%)，其次为Flavobacteriales(4.44%)和Cytophagales(3.33%)(图3和图4)。Acidobacteria(14.44%)、Actinobacteria(4.44%)和Gemmatimonadetes(7.78%)三个门细菌在516样品中的占比明显高于其他两个样品。总的来说，样品516的优势菌群主要包括Bacteroidetes的Chitinophagaceae(噬几丁质菌科)、Flavobacteriaceae(黄杆菌科)、Sphingobacteriaceae(鞘脂杆菌科)，变形菌门的Steroidobacter、Caulobacteraceae(柄杆菌科)、Sphingomonadaceae(鞘脂单胞菌科)以及一个未知的酸杆菌菌群和Gemmatimonadales。

图2 不同土壤样品在门水平上细菌组成图Fig.2 Charts of major bacterial taxa at phylum level in different soil samples

图3 小麦-玉米轮作体系中不同土壤样品在目水平上细菌组成柱状图Fig.3 Bar charts of major bacterial taxa in wheat-maize rotation soil samples

在轮作间隔期土壤样品(716)中，主要优势菌仍为Proteobacteria和Bacteroidetes，所占总OTUs比例分别为32.94%和29.41%，其中，Proteobacteria中，Rhodospirillales(4.71%)、Steroidobacter(3.53%)、 Burkholderiales(伯克霍尔德目)(2.35%)三个目丰度最高；而Bacteroidetes的主要优势目仍为Sphingobacteriales(11.76%)、Flavobacteriales(10.59%)、Cytophagales(5.8%)，但是相对样品516，Sphingobacteriales OTUs所占比例下降明显。其他优势菌群依次为Verrucomicrobia(4.71%)、Acidobacteria(4.71%)、Parcubacteria(4.71%)和Planctomycetes(4.71%)等(图3和图4)。在科水平上，丰度较高的细菌类群为Cytophagaceae(噬纤维菌科)，占10.59%，Chitinophagaceae占9.41%，Steroidobacter占3.53%，Pedosphaera占3.53%，Rhodospirillaceae(红螺菌科)占3.53%，Flavobacteriaceae占2.35%。

在夏玉米拔节期样品(816)中，土壤优势菌为Proteobacteria和Bacteroidetes，所占比例分别占 36.63%和30.43%。Proteobacteria中丰度较高的目主要为Steroidobacter，占4.35%，Chromatiales(着色菌目)占 4.35%，Burkholderiales占2.35%，Xanthomonadales(黄色单胞菌目)占4.35%，Rhodospirillales占2.90%。Bacteroidetes主要为Sphingobacteriales占18.84%，Flavobacteriales占2.90%，Cytophagales占7.25%。其他主要的细菌门依次为Acidobacteria占8.70%， Verrucomicrobia占7.25%，Planctomycetes占5.85%等(图3和图4)。在科水平上主要的优势菌群为Chitinophagaceae，占18.84%，Cytophagaceae占7.25%，Steroidobacter占4.35%，Xanthomonadaceae(黄色单胞菌科)占4.35%，Pedosphaera占2.90%和Gemmatimonadaceae(芽单胞菌科)占2.90%等。

图4 三个土壤样品OTU代表性序列的系统聚类分析Fig.4 Phylogenetic analysis of OTU_based sequences in the three soil samples

2.4 小麦-玉米轮作体系中土壤细菌16S rRNA基因的系统发育分析

190个OTUs的代表性序列的聚类分析表明，Proteobacteria和Bacteroidetes是小麦-玉米轮作体系中土壤细菌的主要优势类群，多样性也最为丰富，其次为Acidobacteria、Gemmatimonadetes、Actinobacteria和Verrucomicrobia等(图5)。构成Bacteroidetes主要的三个目为Sphingobacteriales、Flavobacteriales和Cytophagales；构成变形菌门的十几个细菌目广泛分布在Alpha、Beta、Gamma、Delta4个变形菌纲中，三个不同时期丰度较高的菌群组成变化较大。

3 讨 论

近年来，454和Miseq高通量测序已经成为研究土壤微生物多样性的重要手段，以Mothur和QIIME为主的分析平台的完善和成熟，使不同环境下土壤微生物群落结构和多样性的认识越来越全面和深入[17-19,25-26]。目前，主流的二代测序读长已经可以做到400～500 bp，可以覆盖细菌16S rRNA基因的1～2两个可变区。但是由于读长较短，在分类鉴定的精确度上有较大的不足[20,27]。

目前，获得细菌较长16S rRNA基因序列的方法主要有两种，一是通过传统的构建分子克隆文库并挑单克隆测序，另外一个是基于三代测序的PacBio，后者由于错配率高目前尚无大规模应用。本研究在传统的构建16S rRNA基因克隆文库挑选克隆测序的基础上，利用QIIME生物信息学分析平台，以及经过校正的EzBioCloud 16S rRNA基因数据库[21-22]，对河南冬小麦-夏玉米轮作体系中土壤细菌群落结构组成、核心菌群变化以及多样性进行分析。根据对190条OTUs代表性序列的分析结果，发现187条序列可以注释到属的水平，根据对比这些序列在RDP数据库和NCBI数据库blast的结果，验证了注释的可靠性。证明传统的克隆文库测序结合有效的生物信息学分析方法和可靠地16S rRNA基因数据库可以有效地改善对土壤样品细菌分类的注释结果[21,27]。

在调查的三个不同时期玉米-小麦轮作体系土壤样品中，Proteobacteria、Bacteroidetes和Acidobacteria是主要的优势菌群，与Bulgarelli等[28]对不同土壤和不同品系拟南芥根际和田间土壤细菌组成的研究结果相似。Peiffer等[8]对27个玉米品种根际土壤细菌的研究结果也表明，Proteobacteria，尤其是Burkholderiales在玉米根际土壤中高度富集。Tian等[17]和Edwards等[18]对番茄和大豆的工作也表明Proteobacteria、Bacteroidetes和Acidobacteria细菌在植物根际和田间土壤细菌中的绝对优势地位。本研究中，三个不同时期土壤样品中细菌组成和多样性稍有不同，其中，Bacteroidetes细菌组成集中并且相对稳定，主要由Sphingobacteriales、Flavobacteriales和Cytophagales组成。而变形菌门细菌菌群组成差异较大，主要包括Steroidobacter、Sphingomonadales、Rhizobiales、Rhodospirillales和Burkholderiales等。研究表明，土壤微生物群落组成与多样性受植被类型影响，合理的轮作模式可以在很大程度上改善土壤微生物组成和多样性[5-6]。本研究证明，在冬小麦、玉米生长期内，细菌的丰度和多样性明显高于二者的间隔期，且在玉米种植期间细菌丰度和多样性更高。不同的微生物群落在土壤中担负不同的生态系统功能，丰富的微生物种类和多样性表明土壤内更为活跃的生理和代谢活性。深入了解细菌与植物生长之间的密切联系，寻找具有农药活性的次生代谢产物，研发新型无公害农药，对减少传统的农药使用、改善农业环境具有重要意义。

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