小麦新型Avenin-like type b基因克隆、功能预测及品质相关分析

赵丹阳，王卫东，张嘉程，马翎健

(西北农林科技大学农学院，陕西杨凌 712100)

小麦新型Avenin-like type b基因克隆、功能预测及品质相关分析

赵丹阳，王卫东，张嘉程，马翎健

(西北农林科技大学农学院，陕西杨凌 712100)

为进一步明确Avenin-like type b基因的功能特性，以小麦品种西农188为材料，通过设计简并引物克隆小麦Avenin-like type b基因，对克隆得到的序列进行同源性比对，分析编码蛋白的理化性质、结构特点，结合系统发育树、亚细胞定位预测及结构域分析探讨其可能具有的功能特性，同时对该基因进行体外原核表达及品质功能相关分析。结果表明，从西农188克隆得到4条序列，Genbank登录号为KY794919～KY794922，其中KY794922在信号肽区段碱基缺失导致移码突变。KY794919～KY794921序列与Avenin-like type b家族中大麦、柱穗山羊草、二穗短柄草及节节麦的同源性较高。蛋白序列分析表明，Avenin-like type b编码氨基酸序列具有较高的保守性，其Cys的数目及位置也较为保守，具有两个典型的AAI结构域，推测其可能为一类具有α-淀粉酶抑制剂活性的蛋白。亚细胞定位显示，该类蛋白可能在合成加工后通过运输小泡转运至细胞外行使功能。SDS-PAGE分析表明，KY794919～KY794921体外原核表达成功。通过纯化表达产物及掺粉试验表明，KY794919～KY794921编码蛋白对小麦面粉品质均具有显著正向效应，但仅有KY794919可显著提高面粉吸水量进而延长面筋扩展时间，说明其可能在品质功能研究资源中更具有优越性。

Avenin-like type b；克隆；功能预测；原核表达

小麦(TriticumaestivumL.)是世界上最重要的粮食作物之一，具有独特的黏弹特性，在食品加工中应用广泛[1-2]。小麦籽粒贮藏蛋白是影响小麦加工品质的重要因素[3]，它主要由谷蛋白与醇溶蛋白两大类组成。谷蛋白是一种多链蛋白，依据SDS-PAGE中迁移率大小可将谷蛋白亚基进一步分为HMW-GS和LMW-GS，其组分氨基酸多为极性，可通过分子间二硫键交联聚合构成网状结构，赋予面筋弹性[4]。醇溶蛋白是一种单体蛋白，它通过分子间二硫键与氢键共同作用构成网状结构，由非共价键桥接在谷蛋白骨架上，从而赋予面筋黏性[5-6]。籽粒贮藏蛋白中二硫键的数量及类型与小麦加工品质密切相关[7-8]。

近年来，在小麦胚乳中发现了一种新型贮藏蛋白，其编码基因与燕麦蛋白基因相似，因此命名为Avenin-like蛋白。该类蛋白以其富含半胱氨酸(Cys)残基的特性被广泛关注。由于半胱氨酸(Cys)是形成蛋白质二硫键的基础，其位置及数量影响了二硫键的形成[9]，研究Avenin-like蛋白对小麦品质改良具有重要意义。依据蛋白结构差异可将其分为type a、type b两种亚型，其基因长度分别为450和855 bp，各含有148和265个氨基酸残基，分子量约为16 kDa 和 30 kDa[10]。有研究表明，b型Avenin-like蛋白比a型多一个中间重复区，可形成比a型Avenin-like蛋白更多的分子间二硫键，该类型蛋白对于小麦品质研究意义更大[11]。国内外关于Avenin-like type b蛋白的研究仍处于起步阶段，虽然目前已有研究对Avenin-like type b基因的时空表达特性、编码蛋白特点、Cys残基的分布等进行了阐述，证明了其在小麦近缘种中的广泛存在性[12-14]，但是对于小麦主栽培品种中Avenin-like type b遗传结构特性及功能特点的研究较少，因此有必要对其进一步探讨。

本研究以小麦主栽培品种西农188为材料，通过设计简并引物克隆小麦Avenin-like type b基因，结合生物信息学手段对克隆得到的基因进行序列分析、同源性比对，分析编码蛋白的结构特性，对编码蛋白进行亚细胞定位及结构域分析，探讨其可能具有的功能特性。同时，对该基因进行体外原核表达，通过纯化表达产物结合掺粉试验对其品质效应进行鉴定，以期为该基因的调控及作用机理的深入研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料及试剂

供试材料为小麦品种西农188及中国春，由国家小麦改良中心杨凌分中心品质实验室提供。

2×EasyTaqPCR SuperMix(+dye)、pEASY-T1 克隆载体、pEASY-Blunt E1表达载体、Trans1-T1 Phage Resistant克隆感受态细胞、Trans BL21(DE3)表达感受态细胞、KIO3溶液、DTT溶液、15 mmol·L-1咪唑以及Ni-IDA蛋白层析柱均购于北京全式金生物技术股份有限公司。OMEGA质粒小量提取试剂盒由美国OMEGA公司提供。Promega Wizard凝胶回收试剂盒由美国PROMEGA公司提供。Clear First-3000 Purifier系统由上海闪谱生物科技公司提供。Mixolab2混合实验仪购自法国Chopin Technologies公司。

1.2 克隆及表达引物

利用Primer premier 6.0软件，参照小麦7D染色体上的Avenin-like type b基因(EU096549)编码区序列[12]设计克隆引物avclongF/avclongR(avclongF:5′-ATGAAGGTCTTCATCCTGG CTC-3′，avclongR:5′-CTAGCACGCACCACC AGT-3′)。表达引物同克隆引物。所有引物均由南京金斯瑞公司合成。

1.3 方 法

1.3.1 基因组DNA的提取

取培养箱培养7～8 d的小麦嫩叶，采用CTAB法[15]提取基因组DNA。

1.3.2 Avenin-like type b基因的克隆

以基因组DNA为模版，利用特异引物avclongF/avclongR对Avenin-like type b基因片段进行PCR扩增。反应体系(25 μL)： DNA模版2 μL(包含90 ng目的基因片段)，2×EasyTaqPCR Super Mix(+dye) 12.5 μL，上下游引物(0.2 μmol·L-1)各1 μL，ddH2O 8.5 μL。反应条件：94 ℃预变性2 min；94 ℃变性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35个循环；72 ℃延伸10 min。

PCR产物经0.7%的琼脂糖凝胶电泳检测后，选择目的条带区域，切胶回收，再经Promega Wizard凝胶回收试剂盒进行纯化。纯化产物与克隆载体pEASY-T1连接过夜，并转化大肠杆菌Trans1-T1 Phage Resistant，于42 ℃水浴锅热激转化45 s，35 ℃、200 r·min-1摇床孵育1.5 h。取200 μL转化后菌液，均匀涂布于含AMP的LB固体培养基中过夜，使用克隆载体通用引物M13进行菌落PCR(反应条件同目的基因扩增)，最终选取阳性单克隆送南京金斯瑞生物公司进行测序。

1.3.3 基因序列分析

将所获得的基因序列登录至Genbank数据库，使用Gene Structure Display Server分析Avenin-like type b基因的结构[16]。用ORF Finder(NCBI工具：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)定位ORF信息。利用NCBI BLAST(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)对基因序列进行比对。

1.3.4 蛋白质序列分析及功能预测

利用DNAMAN 6.0进行蛋白质翻译及多序列比对。利用ProtParam(http://web.expasy.org/protparam/)及ProtScale(http://web.expasy.org/cgi-bin/protscale/protscale.pl)分析蛋白理化性质。利用SMART在线服务器(http://smart.embl-heidelberg.de/)与IBS(http://ibs.biocuckoo.org/index.php)分析蛋白结构域。利用Signal P(www.cbs.dtu.dk/services/signalp)进行蛋白质信号肽预测。利用TargetP(http://www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/)、WoLF PSORT(http://www.genscript.com/wolf-psort.html)及PSORTⅡ(http://www.genscript.com/psort.html)对编码蛋白进行亚细胞定位预测。利用NCBI蛋白数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/)进行BLAST分析。利用MEGA 7.0软件构建系统进化树。

1.3.5 原核表达载体的构建

使用引物avclongF/avclongR对含有阳性克隆的菌液进行PCR。反应体系为15 μL：菌液2 μL，上下游引物各1 μL，2×EasyTaqPCR Super Mix(+dye) 7.5 μL，ddH2O 3.5 μL。反应条件同基因克隆。

0.7%琼脂糖凝胶电泳检测回收目的片段，并与pEASY Blunt E1表达载体连接，PCR中25 ℃连接反应10 min。转化Trans1-T1 Phage Resistant感受态细胞， 热激(同1.3.2)，将产物于LB液体培养基培养12 h，使用OMEGA质粒小量提取试剂盒重组质粒。利用通用引物T7P与克隆引物avclongR对重组质粒进行PCR鉴定，挑选阳性质粒测序以确定目的片段插入方向的正确性及ORF的完整性。

1.3.6 Avenin-like type b蛋白的体外表达及SDS-PAGE分析

依据测序结果，选择目的片段插入方向正确且具有完整开放阅读框的重组质粒，转化BL21(DE3)感受态细胞，接种在含AMP的LB液体培养基中，于37 ℃恒温箱培养过夜。将过夜菌按1∶100扩大培养至OD600=0.6，取菌液1 mL作为对照，向其余菌液中加入IPTG诱导3～6 h。取对照及诱导样品各1 mL，通过12%SDS-PAGE分析表达结果。

1.3.7 原核表达产物分离纯化及品质相关功能鉴定

取诱导菌液500 μL，于4 ℃、8 000 r·min-1离心6 min，弃上清液。经4 ℃超声破碎处理，加入15 mmol·L-1低浓度咪唑洗涤，通过Ni-IDA柱过柱纯化。所得产物经ClearFirst-3000 Purifier系统透析24 h，低温冷冻干燥后，-20 ℃保存备用。用12% SDS-PAGE检测分离纯化效果。

按照国标GB/T14614-93用Mixolab2混合实验仪(法国Chopin Technologies)测定样品的相关粉质参数。具体步骤如下：以10 g中国春小麦粉为基础面粉，加入150 mg待测样品充分混匀，添加适量水及0.5 mL 50 μg·mL-1的DTT溶液，充分揉和2 min后，继续加入0.5 mL 50 μg·mL-1的KIO3溶液，揉和反应10 min，采集粉质仪数据，记录粉质曲线，并利用SPSS 21.0中文版对主要粉质参数进行差异显著性分析。

2 结果与分析

2.1 Avenin-like type b基因克隆及检测结果

利用引物avclongF/avclongR对西农188的基因组DNA进行PCR扩增，经0.7%的琼脂糖凝胶电泳检测后，得到800～1 000 bp的单一条带(图1)。目的片段经过回收、纯化，连接至pEASY-T1载体，转化Trans1-T1 Phage Resistant感受态细胞，经PCR扩增获得7个阳性克隆，测序后共获得4条序列。将序列提交至GenBank数据库，获得登录号KY794919～KY794922。

M：Trans2K DNA marker；1～7：7个阳性克隆；箭头所指为目的片段。

M：Trans2K DNA marker;1-7:Seven positive clones;Arrow indicates taget fragments.

图1Avenin-liketypeb基因的PCR扩增结果

Fig.1PCRamplificationresultsofavenin-liketypebgene

2.2 Avenin-like type b基因序列分析

核酸序列比对结果显示，克隆得到的4条序列除KY794922外，长度均为855 bp。序列KY794922在起始密码子处发生碱基缺失，导致整个基因移码突变，因此预测其不具有正常编码Avenin-like type b蛋白的能力。序列KY794920与KY794921相似度较高(99.88%)，仅在第55位出现T←→G碱基置换，而KY794919与KY794920及KY794921均存在多个位点的碱基置换。将KY794919、KY794920、KY794921序列进行Blast分析，结果(表1)发现，3条序列与大麦(Hordeumvulgare)、柱穗山羊草(Aegilopscylindrica)、二穗短柄草(Brachypodiumdistachyon)、节节麦(Aegilopstauschii)及普通小麦(Triticumaestivum)Avenin-like type b基因家族成员相似度较高(均大于95%)，与水稻(Oryzasativa)Avenin-like type b家族成员相似度低于93%；与小麦其他类型贮藏蛋白成员(HMW-GS、LMW-GS、醇溶蛋白)相比，一致性均低于50%。

2.3 Avenin-like type b蛋白质序列分析

2.3.1 蛋白质理化性质分析

利用DNAMAN 6.0推导 KY794919～KY794921所编码的氨基酸序列，并通过ProtParam分析其理化性质。结果表明，KY794919～KY794921所编码的蛋白质分子量在30 kDa左右，理论等电点为7.83～8.26，均编码284个氨基酸；在组成该类蛋白的20种氨基酸中，Gln的比例最高，而Asp的比例最小；KY794919编码Cys的数目为19个，较为少见，而KY794920与KY794921编码Cys的数目为18个；三者编码蛋白的脂肪指数较高，KY794919为76.26，KY794920与KY794921为79.68；蛋白不稳定系数大于80，说明该类蛋白属于不稳定蛋白；亲水性(GRAVY)值为-0.443～-0.374，为疏水性蛋白。

2.3.2 蛋白质信号肽及亚细胞定位分析

信号肽预测结果(图2)表明，KY794919～KY794921编码蛋白第10位的丙氨酸(Ala)残基具有最高的信号肽分值(S-score)：KY794919为0.981，KY794920与KY794921为0.987，第19位的谷氨酰胺(Aln)残基具有最高的酶切位点分值(C-score)以及综合酶切位点分值(Y-score)：KY794919分别为 0.684和0.807,KY794920分别为0.658和0.794，KY794921分别为0.543和0.720，最后推算所得信号肽平均值(S-mean)与D值(S-mean与Y-score的平均值)均大于0.5。因此，推测该类蛋白具有信号肽，第1位至第18位氨基酸为信号肽区域，成熟肽始于第19位氨基酸。

使用TargetP、WoLF PSORT及PSORTⅡ对编码蛋白进行亚细胞定位预测，其中，TargetP显示该类蛋白可能位于分泌通路，WoLF PSORT显示该类蛋白定位于细胞外的概率最大，PSORTⅡ显示该类蛋白可能存在于运输小泡中。因此，推测该类蛋白可能在合成后通过运输小泡转运至细胞外行使功能。

表1 本研究所得Avenin-like type b基因序列与GenBank数据库中其他基因序列的一致性Table 1 Similarity sequences between Avenin-like type b genes obtained in this study and other genes in Genbank database %

C-Score为酶切位点分值;S-score为信号肽分值;Y-Score为综合酶切位点分值。

C-Score,S-score and Y-Score indicated the scores of the digestion site,the signal peptide and the restriction site,respectively.

图2Avenin-liketypeb蛋白的信号肽预测结果

Fig.2PredictionresultofsignalingpeptideofAvenin-liketypeb

2.3.3 蛋白质结构分析

通过SOPMA软件预测KY794919～KY794921编码蛋白的二级结构发现，该类蛋白主要以α-螺旋、β-转角、无规则卷曲及延伸链组成，其中α-螺旋最多，其次是无规则卷曲，β-转角及延伸链所占比例较小。

将蛋白序列提交至SMART数据库，结合IBS(http://ibs.biocuckoo.org/index.php)分析其结构域。结果如图3所示，KY794919～KY794921所编码的Avenin-like type b蛋白第1至18位氨基酸为信号肽，第26至41位氨基酸上存在低复杂度结构域，在49至145及166至265位氨基酸位置存在典型的AAI结构域，该结构域属于AAI-LTSS超家族所特有。AAI-LTSS家族由α-淀粉酶抑制剂(AAIs)和种子贮藏蛋白亚家族(SS)组成，它们主要存在于各种植物的种子中。

2.3.4 蛋白质同源性比对及系统演化树分析

Sig、Low、AAI和Rep-region分别表示信号肽、低复杂度结构域、AAI-LISS家族典型结构域和重复区域；图中数字为氨基酸位点。

Sig,Low,AAI and Rep-region represent the signal peptide,the low complexity domain,the typical domain of the AAI-LISS famiy and the repeat region in the peptide chain;The numbers indicate the amino acid sites.

图3Avenin-liketypeb蛋白的结构域分析

Fig.3ProteindomainanalysisofAvenin-liketypeb

Signal、N-ter、Rep A、Rep B和C-terminal分别表示信号肽、N端、A重复区、B重复区、C端；三角形表示半胱氨酸(Cys)的位置。

Signal，N-ter，Rep A，Rep B and C-terminal indicate the signal peptide,the N-terminus,the repeating region A,the repeating region B and the C-terminal of the peptide chain,respectively;The triangle represtnts the position of cysteine(Cys).

图4Avenin-liketypeb家族序列的比对

Fig.4ComparisonoftheAvenin-liketypebfamilysequences

将KY794919～KY794921所编码的氨基酸序列与NCBI蛋白数据库中已知贮藏蛋白序列进行比对分析，结果(图4)显示，Avenin-like type b家族编码氨基酸数目较为稳定，克隆得到的三条序列与其他已知的Avenin-like type b蛋白序列半胱氨酸(Cys)位点均保持稳定。该家族序列可划分为5个区域：信号肽、N端、A重复区、B重复区和C端。信号肽区域最为保守，存在一个变异位点，仅KY794919在第12位氨基酸出现Ala→Tyr。N端存在4个变异位点，其中，二穗短柄草的编码序列KF933298.1出现了罕见的碱基缺失。重复区是序列变异的集中区域，变异类型主要为碱基替换，共存在56个变异位点，其中A重复区占78.6%，是变异的核心，B重复区占22.4%。C端存在14个变异位点，靠近C端末尾，KY794919有1处Tyr→Cys，从而导致KY794919所编码的Avenin-like蛋白包含19个半胱氨酸(Cys)残基，而在C端最末尾，KY400765发生了罕见的Cys→Tyr，导致该编码产物为仅含17个半胱氨酸(Cys)残基。通过半胱氨酸(Cys)的位置及数目发现，该家族成员编码Cys的位点主要集中于A重复区，信号肽部分无编码位点，N端、C端及B重复区只有1-4个编码位点，可以看出，Avenin-like type b蛋白家族具有较高的保守性。

将克隆序列与其他已知Avenin-like type b蛋白进行同源性分析，利用maximum法构建系统演化树(图5)。通过分析可知，克隆序列与已知Avenin-like type b家族中不同禾本科植物编码序列均可聚为一类。值得一提的是，KY794919蛋白序列相比KY794920、KY794921在进化距离上产生了差异，导致其被聚为另一小分支。就Avenin-like type b家族而言，与HMW-GS及Gliadin中的α亚基类型亲缘关系较近，可聚合为大的分支，与其他亚基类型的Gliadin亲缘关系较远。

2.4Avenin-liketypeb基因原核表达

利用引物avclongF/avclongR对含KY794919、KY794920、KY794921基因的单克隆菌液进行PCR扩增，将目的片段回收、纯化后连接至pEASY Blunt E1载体，导入Trans1-T1 Phage Resistant感受态培养。测序检验重组质粒，结果显示目的基因ORF片段保持完整且插入方向正确，表明克隆序列的原核表达载体构建成功，将其命名为“pEASY-KY794919”、“pEASY- KY794920”、“pEASY-KY794921”。

△表示本研究所得的Avenin-like type b蛋白。

△ indicates the Avenin-like type b protein obtained in this study.

图5Avenin-liketypeb蛋白系统发育树分析

Fig.5PhylogenetictreeofAvenin-liketypebprotein

M：Blue Plus protein marker；1：空载体pEASY；2～4:pEASY-KY794919、pEASY-KY7949120、pEASY-KY794921融合表达载体；箭头所示为目的蛋白。

M：Blue Plus protein marker；1：Empty vector pEASY;2-4:The fusion expression veetors pEASY-KY794919,pEASY-KY7949120 and pEASY-KY794921；The arrow indicates the target protein.

图6经IPIG诱导后KY794919～KY794921表达产物的SDS-PAGE分析

Fig.6SDS-PAGEanalysisoftheexpressedproductsofKY794919-KY794921inducedbyIPIG

利用OMEGA试剂盒提取质粒后，将重组质粒转入Trans-BL21(DE3)感受态细胞，以IPTG为诱导剂诱导基因表达，并通过SDS-PAGE检测表达情况。结果(图6)显示，本研究所诱导蛋白的分子量约为50 kDa。pEASY-E1表达载体含有His-Tag标签，分子量为20.4 kDa，除去标签蛋白，剩余表达产物分子量约为30 kDa，这与之前的分析结果相吻合，表明KY794919、KY794920、KY794921基因原核表达成功。

2.5 蛋白纯化及品质效应鉴定结果

针对pEASY Blunt E1载体具有His标签的特点，使用Ni-IDA柱对原核表达产物进行纯化，并通过12% SDS-PAGE进行检测。结果(图7)显示，电泳背景清晰，且在50 kDa附近出现单一条带，说明原核表达产物纯化成功。

向10 g 中国春基础面粉中加入KIO3及DTT，在氧化还原的基础上继续添加KY794919～KY794921表达纯化产物，记录粉质曲线(图8A～8D)及主要粉质参数(表2)。由结果可知，加入Avenin-like type b蛋白后，7个参数中除机械耐力指数和及线时间外均有提高。其中，面团形成时间、稳定时间、离线时间和粉质质量指数极显著提高，机械耐力指数极显著降低，及线时间中，仅KY794919诱导产物的加入引起参数极显著提高，其他两种产物的加入均导致参数极显著降低。值得一提的是，KY794919诱导蛋白在及线时间与离线时间上均与KY794920、KY794921诱导蛋白存在极显著差异。

M：Blue Plus protein marker；1～3：KY794919～KY794920的表达产物。

M：Blue Plus protein marker；1-3：The expressed products of the KY794919-KY794920.

图7纯化后的原核表达产物

Fig.7Prokaryoticexpressionproductsafterpurification

3 讨 论

小麦种子蛋白中二硫键的类型和数量影响着面筋的网络结构，进而影响其黏弹性及强度。Avenin-like type b蛋白中富含半胱氨酸(Cys)，其高含量的半胱氨酸(Cys)残基使分子内或分子间更易形成较多的二硫键[17]，因此，研究该基因对于小麦品质改良具有重要意义。

本文使用简并引物avclongF/avclongR成功地从小麦材料西农188中克隆出4条新型Avenin-like type b序列KY794919～KY794922，其中，KY794922因信号肽区段碱基缺失发生了移码突变，因而不具备编码Avenin-like type b蛋白的功能，这在已报道的Avenin-like序列中较为少见。通过与Avenin-like type b家族其他禾本科植物序列比对发现，KY794919～KY794921序列与水稻(Oryzasativa)的相似度最低，与大麦(Hordeumvulgare)、柱穗山羊草(Aegilopscylindrica)、二穗短柄草(Brachypodiumdistachyon)及节节麦(Aegilopstauschii)的相似度较高。通过氨基酸序列分析也发现，KY794919～KY794921序列与这些类型基因在Cys残基及位置排布上也高度相似，因此推测它们可能在品质等功能上也具有相似性。

A：中国春面粉中添加DTT和KIO3；B：中国春面粉中添加DTT、KIO3和KY794919诱导纯化蛋白；C：中国春面粉中添加DTT、KIO3和KY794920诱导纯化蛋白；D：中国春面粉中添加DTT、KIO3和KY794921诱导纯化蛋白；虚线为500 BU稠度标准线。

A:Basic flour added with DTT and KIO3; B:Basic flour added with DTT，KIO3and purified protein encoded by KY794919; C:Basic flour added with DTT，KIO3and purified protein encoded by KY794920; D:Basic flour added with DTT，KIO3and purified protein encoded by KY794921; Dotted lines are the consistency standard of 500 BU.

图8纯化的KY794919～KY794921编码蛋白对粉质曲线的影响

Fig.8EffectsofpurifiedproteinencodedbyKY794919-KY794921onthefarinographparameters

表2 纯化的KY794919～KY794921编码蛋白对粉质参数的影响Table 2 Effects of purified protein encoded by KY794919-KY794921 on the farinograph parameters

表中数据为3次重复的平均值；同列数据后不同大写字母表示差异在0.01水平上显著。

Values in the table are averaged from the three replicates；Values marked with different capital letters show significant difference at 1% probability level；DvT：Development time；ST：Stability time；MTI：Mixing tolerance index；AT：Arrival time；DT：Departure time；WC：Width of curve；FQN：Farinograph quality number.

通过蛋白同源性比对发现，Avenin-like type b家族编码氨基酸序列具有较高的保守性，信号肽区域的保守性暗示其亚细胞定位的保守，依据序列特点可将其明显划分为5个区域，变异的核心部分集中在重复区域，该区域中变异位点较为丰富，半胱氨酸(Cys)的数目较多且位置极为保守。小麦籽粒蛋白中的半胱氨酸(Cys)影响着二硫键的形成及分布，二硫键与小麦面筋品质关系密切[18]。因此对该区域的研究不仅是挖掘Avenin-like type b变异资源的重点内容，同时也是研究小麦加工品质的重要环节。本研究克隆得到的KY794919序列在C端末尾有一处Tyr→Cys的碱基突变，使其形成了19个半胱氨酸(Cys)，半胱氨酸(Cys)的增加促进了更多二硫键的形成，这会增加蛋白质分子结构刚性，进而影响面筋粘弹性[19-20]，因此该突变对于面筋品质可能会有正向效应。

本研究中，亚细胞定位预测结果显示，Avenin-like type b蛋白可能在合成加工后通过运输小泡转运至细胞外实现功能。此前，Yamagata等[21]的研究表明，小麦中的一些贮藏蛋白(如谷蛋白)，在内质网上以前体形式被合成后，在高尔基体经受体分类进入运输小泡，最终进入蛋白贮藏型液泡，如果受体缺失就会被分泌到细胞外。这与本研究结果相似，但其具体机理有待深入研究。通过对克隆基因编码的氨基酸系列进行结构域分析发现，本研究得到的Avenin-like type b蛋白具有两个典型的AAI结构域。AAI结构域往往与α-淀粉酶抑制剂的活性相关，α-淀粉酶抑制剂在植物对昆虫和病原体的天然防御中发挥着重要的作用，它们可以通过抑制α-淀粉酶和蛋白酶的活性,防止植物淀粉和蛋白质被消化[22-24]。推测Avenin-like type b可能是一类具有α-淀粉酶抑制剂活性的贮藏蛋白。此前，Kneen等[25]在研究中也表明，小麦种子中确实存在具有α-淀粉酶抑制剂活性的蛋白。

此外，本研究将KY794919～KY794921基因连接至pEASY Blunt E1载体后转化大肠杆菌BL21(DE3)，经IPTG诱导表达，获得分子量约50 kDa的融合蛋白，除去标签蛋白，基因编码产物为 30 kDa，与所推导的蛋白分子量一致，表明克隆基因在原核表达体系中成功表达。通过纯化诱导蛋白及掺粉试验，研究了该类蛋白对品质效应的影响。从试验获得的粉质参数来看，该类蛋白对小麦面粉流变学特性具有显著影响。(1)形成时间是小麦面粉加水揉和至其稠度为最大值时所需的时间，它反映了面筋的质量，时间越长表明面筋质量越高，KY794919～KY794921所诱导的新型Avenin-like type b蛋白的加入，显著提高了小麦面筋质量。(2)稳定时间是粉质曲线稠度值首次步入500 BU与首次离开500 BU的时间差，它反映了面团的韧性、稳定性和耐揉程度，添加KY794919～KY794921诱导蛋白后，面团的稳定性、韧性、以及对机械剪切力的抵抗性显著提高，这可能与该类型蛋白二硫键位置及数目的保守性密切相关。(3)机械耐力指数是粉质曲线峰稠度值与峰后5 min稠度值之差，数值越小表明面粉筋力越强，KY794919～KY794921诱导蛋白的加入使面团对过度搅拌的耐受力显著提高，显著增强了面粉筋力。离线时间的延长也反应了这一特性。(4)及线时间是面粉由开始加水揉和至稠度为500 BU经历的时间，其变化反映了面粉吸水量及面筋扩展时间的变化，KY794920与KY794921诱导蛋白的加入均导致面粉吸水量减少、面筋扩展时间缩短，但KY794919诱导蛋白的加入却截然相反。(5)带宽是粉质曲线的垂直宽度，带宽越长表明面筋弹性越大，外源蛋白KY794919～KY794921的加入均引起面筋弹性的显著增强。(6)粉质质量指数衡量了小麦面团的综合质量，该类型蛋白的加入均引起面团综合质量的显著提高。从整体上看，KY794919～KY794921诱导蛋白对小麦面粉品质具有显著的正向效应。而KY794919与KY794920、KY794921在品质效应上的差异，可能与其多余的Cys残基有关，因为二硫键的形成与Cys的数目及位置的等有很大的相关性，形成分子内及分子间二硫键有助于蛋白质的空间聚合，有助于蛋白质网络的形成，进而影响面筋的弹性、质量及延展性等[26]。相比KY794920、KY794921而言，KY794919在品质功能研究资源中更具有优越性。

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Cloning,FunctionalPredictionandQuality-RelatedAnalysisofNewAvenin-likeTypebGenesinWheat

ZHAODanyang，WANGWeidong，ZHANGJiacheng，MALingjian

(Agronomy College,Northwest A&F University, Yangling, Shaanxi 712100, China)

To further clarify the functional properties of Avenin-like type b gene, this experiment took the wheat cultivar Xinong 188 as the material. The Avenin-like type b genes were cloned from the material with degenerate primers. The possible functional properties of the genes were discussed by making a homologously comparison, analyzing physicochemical properties and structural characteristics of their encoded protein, predicting subcellular localization, constructing the phylogenetic tree and analyzing the particular domain. In addition, they were expressed in prokaryocyte and their quality related function was analyzed. The result showed that there were four sequences cloned from Xinong 188,with the Genbank accession number KY794919-KY794922,of which, the base deletion in signal peptide region leads to a frameshift mutation of KY794922. The sequences of KY794919-KY794921 have high homology with Avenin-like type b families inHordeumvulgare,Aegilopscylindrica,BrachypodiumdistachyonandAegilopstauschii.Protein sequence analysis showed that the amino acid sequences encoded by Avenin-like type b genes,as well as the number and position of the cysteine,are more conserative.The Avenin-like type b protein has two typical AAI structural domains, and it may be for a class of protein with alpha amylase inhibitor activity. Subcellular localization showed that the protein may be transported to the extracellular by transport vesicles after processing for functional implementation. SDS-PAGE analysis showed that the prokaryotic expressioninvitroof KY794919-KY794921 is successful. The results of the expression products purification and supple mentation experiment showed that the proteins encoded by KY794919-KY794921 have significant positive effects on wheat flour quality, however, only the protein encoded by KY794919 can significantly increase water absorption of flour and prolong extension time of gluten, which indicating that KY794919 might be more advantageous in quality and function research resources.

Venin-like type b；Cloning； Functional prediction；Prokaryotic expression

时间：2017-10-09

网络出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/61.1359.S.20171009.1148.002.html

2017-03-05

2017-06-05

国家科技支撑计划项目(2013BAD04B02)； “948”项目(K312021505)； 陕西省重点产业创新项目(K3320215198)

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马翎健(E-mail:mlingjian@126.com)

S512.1；S330

A

1009-1041(2017)10-1265-11