东农冬麦1号 TabZIP1基因的生物信息学分析及低温和ABA对其表达模式的影响

吕 岩，苍 晶，卢秋巍，杨 宁，冯明芳，孟德义，刘增兵，彭瞰看，徐庆华，张 达，于 晶

(东北农业大学生命科学学院，黑龙江哈尔滨 150030)

东农冬麦1号 TabZIP1基因的生物信息学分析及低温和ABA对其表达模式的影响

吕 岩，苍 晶，卢秋巍，杨 宁，冯明芳，孟德义，刘增兵，彭瞰看，徐庆华，张 达，于 晶

(东北农业大学生命科学学院，黑龙江哈尔滨 150030)

为探讨小麦中 TabZIP1应答低温胁迫及ABA调控信号的响应机制，以强抗寒性冬小麦品种东农冬麦1号(DN1)和弱抗寒性品种济麦22(JM22)为材料，在大田自然降温条件下，分别于5 ℃、0 ℃、-10 ℃、-25 ℃取样叶片和分蘖节，通过RT-PCR分析 TabZIP1的表达模式，于不同温度下探究ABA对DN1分蘖节 TabZIP1表达模式的调控，并对其生物信息学进行分析。结果表明， TabZIP1全长1 167 bp，编码388个氨基酸，其表达产物为疏水蛋白，定位于线粒体，无信号肽或跨膜结构域； TabZIP1蛋白二级结构为mixed型。DN1叶片和分蘖节中的 TabZIP1表达量均在-10 ℃时达到最高，且分蘖节中的表达量高于叶片；而JM22分蘖节中的 TabZIP1表达量在0 ℃时达到峰值，叶片中的表达量却在-10 ℃达到最高。综合分析，DN1分蘖节中的 TabZIP1表达量明显高于JM22。ABA处理后，DN1分蘖节中 TabZIP1的表达量随温度的降低呈明显升高趋势，在-25 ℃时达到峰值。可见，ABA正调控 TabZIP1的表达，有助于提高冬小麦的抗寒性。

东农冬麦1号；济麦22；低温胁迫；ABA； TabZIP1；表达模式

植物都有适宜的生长温度，温度过高或过低都会影响其生长发育，降低作物产量。转录因子(transcription factor,TF )可以与不同基因启动子区域的顺式作用元件结合或者与其他转录因子家族的成员及调控蛋白相互作用，从而达到对生物体内某些特定生理生化过程的调控[1]。

东农冬麦1号是首例在黑龙江省安全越冬的强抗寒冬小麦品种。植物抗寒的生理生化反应是由低温改变基因的表达所引起，目前已经克隆了许多抗寒相关基因。了解植物安全越冬的分子机制对提高其抵抗低温的能力具有重要的作用，在生产实际中也具有广泛的应用价值。bZIP是植物中比较大的一类转录因子家族，几乎参与调控植物的所有生命现象，如抗逆[2]。bZIP(basic-region leucine zipper)的结构域由碱性氨基酸域和亮氨酸拉链域组成，总长度60～80个氨基酸[3]。碱性氨基酸区域位于bZIP结构域的N 端，由18个富含碱性氨基酸(Rrg、Lys)、不变的 N-x7-R/K-x9基序组成；该区域负责与DNA顺式作用元件结合，决定了DNA结合的特异性，并具有核定位信号序列；该区域相比于亮氨酸拉链区域更加保守。亮氨酸拉链区域一般由7个或9个氨基酸组成一个重复单位，每个重复单位的第7或第9位一般是亮氨酸，但也有其他一些疏水性氨基酸 (Ile、Val、Phe 或Met)。该区域二聚化使富含亮氨酸区域形成亮氨酸拉链结构，然后结合DNA区。bZIP结构域的N端，也就是碱性区域负责与双链 DNA的大沟结合，而C端(亮氨酸拉链域)通过二聚化介导形成α-超螺旋结构，即亮氨酸拉链域[4-5]。在拟南芥和水稻中，与抗逆相关的bZIP转录因子的功能研究相对比较深入。目前，在模式植物拟南芥和水稻中已分别鉴定出127个和140个bZIP转录因子，六倍体小麦发现了102个bZIP转录因子[6]。小麦中与非生物胁迫相关的bZIP转录因子的研究相对较少，尤其是与低温相关的转录因子研究有限，所以在冬小麦抗寒过程中，转录因子起到一个什么样的作用，仍需深入研究。

小麦中与抗逆相关的bZIP转录因子基因( TabZIP)的转录水平表达受ABA、低温、高盐和机械伤害诱导，且参与条锈病菌的防卫反应[5]。相关文献中的低温胁迫一般为4 ℃左右，而在0 ℃以下低温胁迫时 TabZIP1的作用如何，尚未见报道。本研究对这方面进行了探讨，并对其进行生物信息学预测分析，同时通过定量方法测定其在低温下的相对表达水平，进而探索转录因子调控冬小麦抗寒性的机制。

1 材料与方法

1.1 材 料

试验在东北农业大学试验田进行，参试冬小麦为强抗寒性品种东农冬麦1号和弱抗寒性品种济麦22，于2015年9月7日播种，完全区组设计，3次重复，行长2 m， 行距0.2 m，10行区。播种量450粒·m-2，播深5 cm，常规田间管理。

待麦苗长至三叶期(2015年9月23日)时，对冬小麦叶片喷施10-5mol·L-1ABA(本课组前期试验得出大田试验的最适浓度)， 喷施量为4 m2·L-1，对照组喷施等量的蒸馏水。于大田自然降温至5 ℃、0 ℃、-10 ℃和-25 ℃(连续10 d最低温的平均值)时，分别取样分蘖节和叶片，-80 ℃保存备用。

1.2 实验方法

1.2.1 生物信息学分析

编码蛋白氨基酸序列的基本理化性质由ExPASy-ProtParam tool软件分析[7-8]；蛋白的保守结构域由Consevered Domains 工具预测；二级结构用SOPMA软件进行预测与分析；利用NCBI中的 Blastp 在线工具进行其他物种的同源氨基酸序列搜索；利用Clustal X(version 2.0)和DNAMAN(version 8.0)进行氨基酸序列同源比对[9]，用MEGA 6.0 软件构建系统进化树[10]；利用TargetP 1.1 Server和ChloroP 1.1 Server预测蛋白的亚细胞定位。

1.2.2 RNA提取及cDNA合成

Trizol法提取叶片及分蘖节总RNA。cDNA第一链的合成参照反转录试剂盒(购自TaKaRa公司)说明书进行。

1.2.3 RT-qPCR

根据已得到的 TabZIP1基因(GenBank登录号FJ194457)序列设计实时定量引物， TabZIP1转录因子基因的正向引物和反向引物分别为5′-TGGGAAGCAGTGAAGCAGAG-3′和5′-CCAC AGGAGAGGGAAAGAACC-3′。

实时荧光定量PCR反应系统为Mx-3000p Real-Time PCR System。以小麦中的Actin为内参基因，其扩增引物序列为5′-CCTTAGTACCTTCCA ACAGATGT-3′和5′-CCAGACAACTCGCAACTT AGA-3′。荧光实时定量PCR(RT-qPCR)反应体系为20 μL：SYBR○RPremix ExTaqTM II(2×) 10 μL，cDNA模板2 μL，正向及反向引物(10 μmol·L-1)各0.8 μL，ROX Reference Dye II (50×) 0.4 μL， ddH2O 6 μL。PCR反应条件为95 ℃预变性30 s，95 ℃变性5 s，60 ℃退火34 s，40个循环。采取2-△△Ct法计算待测基因的相对表达量[11]，Ct值即为达到检测阈值时的PCR循环数。3次生物学重复，数据显著性分析采用SPSS软件。

2 结果与分析

2.1 TabZIP1转录因子的生物学信息

2.1.1 TabZIP1的理化性质

NCBI中检索基因号(FJ194457)显示， TabZIP1基因全长1 167 bp，编码388个氨基酸。ExPASy-ProtParam tool预测其表达蛋白的相对分子质量为94 841.9 Da，理论等电点(pI)为5.03，是弱酸性蛋白；其不稳定系数(instability index)为50.66，属于不稳定型蛋白质(<40，蛋白稳定)；脂肪族系数(aliphatic index)为 31.88，总平均亲水系数(grand average of hydropathicity)为0.924(在2～-2范围内， 正值表明此蛋白为疏水蛋白， 负值表明为亲水蛋白)，表明该蛋白是疏水蛋白。该蛋白由4种氨基酸组成，分子式为C3451H5737N1167O1403S275，其氨基酸所占比例分别为 31.9%(Ala)、23.6%(Cys)、24.4%(Gly)和20.1%(Thr)。保守结构域预测显示，该蛋白具有保守的BRLZ基序，保守区域从第291～第355个氨基酸，保守区域全长65个氨基酸，属于bZIP1家族。SignalP 4.1 Server表明，该蛋白无信号肽或跨膜结构域，属于非分泌性蛋白。

2.1.2 TabZIP1蛋白的二级结构

利用SOPMA在线对TabZIP1蛋白进行二级结构预测，结果显示，二级结构中有α-螺旋(H)89个、延伸片段(E)37个、β转角(T)15个和无规则卷曲(C)247个，分别占总蛋白的22.94%、9.54%、3.87%和63.66%。当H>45%、E<5%时该蛋白结构为all-alpha型；当H<5%、E>45%时为all-beta型；当H>30%、E>20%时为alpha-beta型；其他情况为mixed型。预测结果表明，TabZIP1蛋白二级结构为mixed型。

2.1.3 TabZIP1蛋白多序列比对结果

利用NCBI中的Blastp在线工具进行其他物种的同源氨基酸序列搜索，将TabZIP1与大麦(HvbZIP1)、水稻(OsZIP-1a)、短药野生稻(ObHBP-1a-like)、玉米(ZmbZIPLOC100192709)、苹果(MdbZIPLOC 103455650)的5个bZIP蛋白进行多序列比对，结果表明，TabZIP1蛋白N端具有完整的碱性氨基酸序列特征结构域，C端是典型的亮氨酸拉链域(图1)。

2.1.4 进化树

利用MEGA 6.0软件将小麦与玉米(Zeamays)、拟南芥(Arabidopsisthaliana)、烟草(Nicotianatabacum)、大麦(Hordeumvulgaresubsp.vulgare)、葡萄(Vitisvinifera)、二穗短柄草(Brachypodiumdistachyon)、水稻(Oryzasativa)、短药野生稻(Oryzabrachyantha)、刚毛柽柳(Tamarixhispida)、苹果(Malusdomestica)等其他物种的bZIP的碱基序列进行系统发育分析(图2)，结果表明，TabZIP1与HvbZIP1、BdHBP-1a-like、 ObHBP-1a-like、OsZIP-1a和ZmLOC100192709蛋白比较相近，即这些单子叶植物的bZIP聚类关系较近，其中小麦与大麦聚到了一组，水稻与短药野生稻聚到一组，而二穗短柄草在进化上介于麦类和水稻之间。在双子叶植物中，拟南芥和烟草聚到了一组，而葡萄与其他几种植物的聚类关系最远。

2.1.5 TabZIP1蛋白的亚细胞定位预测

蛋白质要参与正常的生命活动，就必须处于特定的细胞区域。胞质中合成的细胞器蛋白质与胞质蛋白质一样都由游离核糖体合成，随后必须转运到特定的细胞器中。转运进入线粒体及叶绿体中的许多蛋白质都含有特定的导向序列(targeting sequence)，负责细胞器外膜对蛋白质的识别。导向序列又称转运肽(transit peptide)或导肽(targeting peptide)，是蛋白质N-端一段约20～80个氨基酸的肽链，富含带正电荷的碱性氨基酸(Arg和Lys)和羟基氨基酸(Ser)，易形成α-螺旋结构。以是否具有转运肽序列为特征，利用TargetP和ChloroP在线程序对TabZIP1蛋白预测结果显示，TabZIP1定位于线粒体，具有mTP(mitochondrion chloroplast transit peptide，线粒体转运肽)。

①:TabZIPI;②:HvbZIPI;③:OsZIP-1a;④:BdHBP-1a-like;⑤:ZmbZIPLOC100192709;⑥:MdbZIPLOC103455650.

图2 11种植物的bZIP分子进化与系统树

2.2 TabZIP1在不同组织中的表达模式分析

利用RT-PCR分析4个温度下东农冬麦1号和济麦22分蘖节及叶片中 TabZIP1的表达量特点。结果显示，济麦22分蘖节中 TabZIP1表达量随着温度的降低表现出“升-降-升”的趋势，且在0 ℃时达到最高，叶片表达量呈现出先升后降的趋势，在-10 ℃时最高(图3)；东农冬麦1号分蘖节中 TabZIP1表达量先有所降低再增加，-10 ℃时达到峰值，叶片表达量表现为明显的先增后降趋势，峰值同样出现在-10 ℃时(图4)。济麦22分蘖节中 TabZIP1相对表达水平在5 ℃及0 ℃时显著高于叶片，率先对低温响应(图3)；东农冬麦1号叶片中 TabZIP1相对表达水平在0 ℃时显著高于分蘖节，对低温迅速响应，但在-10 ℃时却是分蘖节的 TabZIP1相对表达水平显著高于叶片(图4)。总体来说，济麦22分蘖节及东农冬麦1号叶片中的 TabZIP1表达相比东农冬麦1号分蘖节均在0 ℃时率先对低温响应，而东农冬麦1号分蘖节则在-10 ℃时积极响应低温，表明东农冬麦1号分蘖节是重要的抗寒器官。

**和*分别表示分蘖节与叶片差异在0.01和0.05水平上显著。图4同。

** and * indicate significant differences between tillering node and leaf at 0.01 and 0.05 levels,respectively. The same in Fig.4.

图3 不同温度下济麦22分蘖节和叶片中 TabZIP1的相对表达量

Fig.3 Relative expression level of TabZIP1 in tillering node and leaf of Jimai 22 at different temperatures

2.3 ABA对东农冬麦1号分蘖节 TabZIP1表达模式的影响

由于低温下 TabZIP1在东农冬麦1号分蘖节中的表达量较高，所以利用RT-PCR分析低温胁迫下东农冬麦1号分蘖节中 TabZIP1对外源ABA的反应。RT-PCR结果显示，5 ℃和0 ℃时，对照的 TabZIP1相对表达量高于ABA处理，但差异不显著； -10 ℃和-25 ℃时，ABA处理的 TabZIP1表达量均显著高于对照(图5)。

图4 不同温度下东农冬麦1号分蘖节和叶片中 TabZIP1的相对表达量

**表示ABA处理与对照差异在0.01水平上显著。

** indicates significant difference between ABA treatment and CK at 0.01 level.

图5 不同温度下ABA对东农冬麦1号分蘖节中 TabZIP1相对表达量的影响

Fig.5 Relative expression level of TabZIP1 in tillering node of Dongnongdongmai 1 at different temperatures under ABA treatment

随着低温的降低，ABA处理组分蘖节的 TabZIP1表达量线性升高，且-25 ℃时达到最高(图5)。可见，外源ABA对 TabZIP1在低温(-10 ℃以下)下的表达有诱导作用，且表现为正调控。

3 讨 论

随着分子生物学的快速发展，人类已经完成了拟南芥、水稻[12-20]等多种植物的基因组测序工作，科研工作者也对基因组中转录因子做出了预测和统计[20]， 转录因子的数量在植物基因组中占有相当比重， 可见其在植物生命过程中的重要性。近年来，越来越多的bZIP转录因子被揭示参与调节体内的多种生命现象[21-29]。以往研究表明，bZIP类转录因子在植物组织中有表达差异，如许多在根中高量表达， 在茎和叶片中却表达量很少或不表达[30-33]。本研究结果显示，东农冬麦1号 TabZIP1在分蘖节和叶片中的表达量随着温度的降低而逐渐升高，且分蘖节高于叶片，分蘖节表达量在-10 ℃时达到峰值，这与实验室前期证明-10 ℃是冬小麦启动抗寒机制的关键温度点相一致[34]；低温下济麦叶片中的 TabZIP1表达量也升高，最高表达量出现在-10 ℃时，而济麦分蘖节 TabZIP1表达量在低温下较低，且在0 ℃时达到峰值，较东农冬麦1号提前应答低温胁迫。

ABA作为一个关键的调节因子， 参与植物的各种生物和生理过程[35]。通过ABA调控基因的启动子研究已经鉴定出很多ABA响应元件，如ABRE元件[36]。很多ABRE元件包含1个ACGT核心序列，如小麦Em基因上游的Em1a元件(GGACACGTGGC)， 而其他的ABRE元件则不包含ACGT核心序列， 如大麦 HVA1基因上游的CE3元件(ACGCGTGTCCTC)、水稻 rab16B上游的“motif III”(GCCGCGTGGC)和人工合成元件hex-3 (GGACGCGTGGC)。研究表明， AtbZIP1转录因子基因通过与ABRE元件相结合， 参与ABA信号传导通路[37]。在极端环境条件下，有效的抗氧化系统是植物抵抗逆境的一个重要途径。研究发现，烟草在逆境胁迫条件下过量表达转基因 ThbZIP1基因，可以提高过氧化物酶、超氧化物歧化酶的活性，增加可溶性糖和可溶性蛋白的含量，还可以加快活性氧的消除，促进可溶性渗透剂的积累，诱导或增加可溶性蛋白的生物合成[38]。在正常情况下外源ABA可造成类似逆境的胁迫，而胁迫条件下外源ABA则可提高植物自身防御机制[39]。LIU等研究表明，在-10 ℃及以上低温时外源 ABA促进了分蘖节中可溶性糖和淀粉的积累[40]。外源ABA可通过增加可溶性糖含量提高小麦、甜菜、水稻等抗寒性[41]。本实验结果表明，外源ABA促进低温(-10 ℃及以下温度)环境中东农冬麦1号分蘖节中 TabZIP1的表达，呈现正调控。但在5 ℃和0 ℃时ABA调控 TabZIP1的机制并未启动，这可能是5 ℃和0 ℃时ABA处理过的东农冬麦1号分蘖节 TabZIP1还未对寒冷做出应答，这两个温度不足以启动ABA对 TabZIP1的调控，而是在-10 ℃及以下温度启动，这与实验室前期结果-10 ℃是东农冬麦1号启动抗寒机制的关键温度点相一致[34]。对于 TabZIP1是否参与强抗寒冬小麦东农冬麦1号可溶性糖含量的提高、淀粉的积累及一些逆境相关酶活性的调节，有待进一步研究。

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Bioinformatic Analysis and Effect of Low Temperature and ABA on TabZIP1 Expression Pattern of Winter Wheat Dongnongdongmai 1

LÜ Yan,CANG Jing,LU Qiuwei,YANG Ning,FENG Mingfang,MENG Deyi, LIU Zengbing,PENG Kankan,XU Qinghua,ZHANG Da,YU Jing

(College of Life Science,Northeast Agricultural University,Harbin,Heilongjiang 150030,China)

In order to investigate the response of TabZIP1 to chilling stress and ABA regulation signal response mechanism,with strong cold resistance winter wheat variety ‘Dongnongdongmai 1’ and weak cold resistance cultivar ‘Jimai 22’ as experimental materials,samples were collected at 5 ℃，0 ℃，-10 ℃，-25 ℃,respectively,in the field of natural under cool conditions. The expression pattern of TabZIP1 in the blade and tiller node were analysed by RT-PCR. The regulation of ABA on TabZIP1 expression pattern of tillering in Dongnongdongmai 1 under different temperatures was explored with bioinformatics analysis. The results showed that,the full length of TabZIP1 is 1 167 bp,encoding 388 amino acids,and the expression product is a hydrophobic protein,localized in the mitochondria,with no signal peptide or transmembrane domain; and the secondary structure of TabZIP1 protein is mixed type. The expression level of TabZIP1 in leaves and tiller node of Dongnongdongmai 1 are both highest at -10 ℃,and higher in tiller node than in blade. While in Jimai 22,the expression level of TabZIP1 reached the maximum at 0 ℃ in tiller node,but at -10 ℃ in blade. Based on comprehensive analysis,the expression level of TabZIP1 in tillering node of Dongnongdongmai 1 is highest,which is significantly higher than that of Jimai 22. With ABA treatment,the expression level of TabZIP1 in tillering node of Dongnongdongmai 1 was significantly reduced with temperature increasing,with a maximum at 25 ℃.It is suggested that ABA treatment positively regulated the expression of TabZIP1,thereby improving the cold resistance of winter wheat.

Dongnongdongmai 1; Jimai 22; Cold stress; ABA; TabZIP1; Expression pattern

时间：2017-01-03

2016-08-04

2016-09-26

国家自然科学基金项目(31471423)；国家自然科学基金人才培养科研训练项目(J1210069)；黑龙江省自然科学基金项目 (C201418)

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苍 晶(E-mail:cangjing2003@163.com)

S512.1；S332

A

1009-1041(2017)01-0022-08

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