中国节节麦基于ISSR标记的遗传多样性分析

李玉阁，苏亚中，张大乐，李锁平

(河南大学生命科学学院，河南开封 475004)

中国节节麦基于ISSR标记的遗传多样性分析

李玉阁，苏亚中，张大乐，李锁平

(河南大学生命科学学院，河南开封 475004)

为揭示中国节节麦的遗传多样性并发掘可能具有独特变异的节节麦种质资源，采用ISSR标记对75份中国节节麦的遗传多样性进行分析。结果表明，筛选出的9条ISSR引物共检测得到155个位点，多态性位点(138个)百分率为89.31%。Nei’s多样性指数(He)、Shannon’s信息指数(I)、基因分化系数(Gst)和基因流(Nm)分别为0.273 4、0.415 2、0.138 5和3.11，表明中国节节麦有较高的遗传多样性，群体间有中等程度的遗传分化。基于简单相似系数的UPGMA聚类分析表明，除5份河南和陕西节节麦聚类形成独立的分支Group 2 (T078、T102和SC1) 和Group 3(SX38和T006)外，绝大多数节节麦均聚类形成较大的分支Group 1，且在Group 1中，除4份节节麦(T002、T023、XJ6和XJ49)外，绝大多数节节麦均依据地理分布分别形成了黄河流域节节麦亚组和新疆节节麦亚组，在遗传距离约0.77处，又可依次分为河南、陕西和新疆节节麦小分支。二维主成分分析、群体的遗传一致度和分子变异分析也表明了类似的结果，同属于黄河流域节节麦亚组的河南、陕西节节麦遗传一致度(S=0.971 8)较高，群体内个体差异是中国节节麦变异的主要原因，但两大亚组和三居群的遗传差异分别占总变异的18.57%和10.38%。可见，不同节节麦的地理分布和生境差异，是导致中国节节麦居群遗传分化的主要原因，而聚类分析中单独形成独立分支Group 2和Group 3的5份黄河流域节节麦，可能是具有独特遗传变异的种质资源。

中国节节麦；ISSR；聚类分析；二维主成分分析；分子变异分析

自然遗传变异是植物遗传改良重要的基因资源。节节麦(Aegilopstauschii,DD，2n=14)作为普通小麦(TiriticumaestivumL.,AABBDD，2n=42)D基因组的祖先供体种，不仅具有比普通小麦D基因组更丰富的遗传变异，而且其宝贵基因资源易于通过传统杂交导入普通小麦，因此，节节麦被看作是小麦族中可应用于小麦遗传改良最重要的遗传资源[1-5]。Mizuno等[6]和Sohail等[7]对世界不同地理分布的节节麦种群遗传结构的分析表明，少数隶属于L2谱系2-3亚系的节节麦，至少是L2谱系的节节麦，主要参与了普通小麦D基因组的起源，而具有更广泛遗传变异、隶属于L1谱系的节节麦，没有参与普通小麦的起源，是小麦遗传改良重要而丰富的遗传资源。分布于我国新疆西部的伊犁河谷和黄河流域的节节麦，隶属于L1谱系的节节麦，不仅没有参与普通小麦的起源，且部分来源于河南、陕西的黄河流域节节麦，还具有其他谱系节节麦所缺乏的独特遗传变异[6]。因此，系统采集中国节节麦，对其进行广泛的遗传多样性分析，并从中筛选具有独特遗传变异的种质资源，无论对节节麦的遗传多样性保护，还是对小麦的遗传改良来讲均具有重要的意义。

2006-2008年本课题组对分布于我国河南、陕西、新疆的节节麦野生种质资源进行了系统调查和采集，并相继对中国黄河流域[8]和新疆伊犁地区[9]节节麦的SSR遗传多样性、HMW-GS组成[10-11]、穗发芽[12]和抗旱特性[13]进行了大规模的初步调查和比较分析。为进一步揭示中国节节麦的遗传多样性和居群间的遗传差异，并从中筛选出具有独特变异的宝贵种质资源，本研究在黄河流域和新疆节节麦SSR遗传多样性分析的基础上，选取有代表性的75份节节麦，采用能很好揭示物种内遗传多样性、且有效性已在伊朗节节麦遗传多样性分析中得以验证的ISSR分子标记[11-17]，进行遗传多样性分析。

1 材料与方法

1.1 供试材料

75份代表性中国节节麦(Aegilopstauchii)种质资源(表1)，由河南大学生命科学学院植物种质资源与遗传实验室收集并保存。

1.2 试验方法

1.2.1 基因组DNA的提取

随机选取20粒左右的节节麦种子，在温室中培养5～7 d至黄化苗，采用CTAB法从嫩叶中提取基因组DNA。

1.2.2 ISSR引物的选择、合成与筛选

首先，选择Baranduzi等[14]、杜金昆等[16]和马艳明等[17]研究中得到的扩增效果良好的18条ISSR引物，交由上海生物工程科技有限公司合成。然后，根据遗传多样性的SSR分析结果[8-9]，选取遗传差异相对较大的部分节节麦为材料，对18条ISSR引物作进一步筛选，将扩增多态性好、重复性强的引物作为本研究用于遗传多样性分析的引物。

1.2.3 PCR扩增及结果检测

PCR扩增采用15 μL的反应体系，包括约50 ng的基因组DNA、100 μmol·L-1的dNTPs、0.5 U的TaqDNA聚合酶(TaKaRa)和0.5 μmol·L-1的ISSR引物。PCR循环程序：94 ℃预变性4 min；94 ℃变性30 s，50～60 ℃(根据引物的Tm值调节退火温度，一般为Tm+2 ℃)退火45 s，72 ℃延伸60 s，32个循环；72 ℃延伸15 min。PCR扩增产物采用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳和银染法分别进行分离和鉴定，具体方法参照苏亚蕊等[7]。

1.2.4 ISSR分析结果的统计与分析

每条ISSR引物至少PCR扩增两次，只有那些能稳定重复的清晰条带才作为可能的多态性条带进行统计。在每个凝胶上，根据对应的ISSR扩增条带的有无记录条带，有扩增条带的记为1，没有扩增条带的记为0，将扩增结果转换成二元矩阵。采用NTsys2.1软件，基于简单匹配系数(simple matching coefficient，SM)，对75份中国节节麦进行UPGMA(un-weighted pair group method analysis)聚类分析和二维主坐标分析(principal coordinates analysis，PCoA)。应用POPGENE.32软件计算河南、陕西和新疆节节麦居群的观测等位基因数(observed number of alleles，Na)、有效等位基因数(effective number of alleles，Ne)、Nei’s基因多样性指数(Nei’s gene diversity,He)、Shannon’s信息指数(Shannon’s information index,I)、多态位点百分率(percentage of polymorphic loci，PPB)、不同居群间的总基因多样性(total gene diversity，Ht)、群体内的基因多样性(gene diversity within population，Hs)、群体间的基因多样性(gene diversity among populations，Dst)、遗传分化系数(genetic differentiation coefficient，Gst)、基因流(gene flow，Nm)、Nei’s遗传距离(genetic distance，D)和遗传一致度(genetic identity，S)，并依据遗传距离进行群体聚类和分组。应用DCFA软件对数据进行转化，然后用AMOVA 1.55软件进一步对中国节节麦进行分子变异分析。

表1 75份代表性中国节节麦材料的编号及来源Table 1 Name and origin of the 75 Chinese Aegilops tauchii accessions

2 结果与分析

2.1 ISSR-PCR扩增结果

利用筛选出的9条ISSR引物，从75份中国节节麦中共检测得到155条清晰、可重复、片段大小在120～2 000 bp的PCR条带，每条引物可扩增得到条带12～24条，多态性条带在9～21条，多态性位点百分率为89.31%(表2)。从引物UBC859的扩增结果(图1)可以初步看出，新疆伊犁地区节节麦有较高的遗传相似性，而来自河南、陕西的黄河流域节节麦，有较为广泛的遗传变异。

表2 筛选出的9条ISSR引物及其扩增结果Table 2 Nine selected primers and their amplified resluts

HN、SX和XJ分别代表河南、陕西和新疆的节节麦材料;M代表X174-HaeⅢ digest DNA marker。 下同。

HN，SX and XJ represent the materials from Henan，Shaanxi and Xinjiang provinces,respectively; M represents the X174-HaeⅢ digest DNA marker.The same below.

图1 引物UBC859的PCR扩增结果

Fig.1 Profiles of PCR products amplified with the primer UBC859

2.2 75份中国节节麦ISSR遗传多样性的UPGMA聚类分析和二维主成分分析

为进一步揭示75份中国节节麦的亲缘关系，基于简单相似系数，利用NTsys2.1对ISSR遗传多样性结果进行聚类分析和二维主成分分析。从聚类结果(图2)可以看出，在相似系数约0.67处，除3份来自河南(T078、T102和T006)和2份来自陕西(SC1和SX38)的节节麦分别形成相对独立的分支Group 2和Group 3外，其他70份中国节节麦形成较大的分支Group 1。而且，除T002、T023、XJ6和XJ49(虚线框表示)这4份材料外，在相似系数约0.71处，Group 1中来自新疆伊犁地区的节节麦(Sub 1)和来自河南、陕西的黄河流域节节麦(Sub 2)又形成了2个不同的亚组。而在相似系数约0.77处，分布在黄河流域节节麦亚组Sub 2的节节麦，又能明确地分为河南、陕西和新疆节节麦小分支。对遗传距离与系统进化树之间的相关性分析表明，二者存在极显著的相关性(r=0.812 6，P<0.01)。对75份节节麦的二维主成分分析表明(图3)，主要代表新疆和黄河流域节节麦地理差异的第1、2主坐标的方差贡献率分别为51.41%和6.24%。可见，聚类分析与主成分分析结果基本一致，均表明地理隔离是造成黄河流域节节麦和新疆伊犁地区节节麦遗传差异的主要原因。而且，从75份节节麦的分布可以直观看出，新疆节节麦的遗传相似度较高，而来自河南、陕西的黄河流域节节麦遗传多样性相对丰富，尤其是形成独立分支Group 2和Group 3的5份节节麦，可能是具有独特遗传变异的节节麦种质资源。

图2 75份中国节节麦ISSR遗传多样性分析的系统聚类图

图3 75份中国节节麦的二维主坐标分析

2.3 中国节节麦居群的遗传多样性和遗传分化程度分析

为进一步揭示中国节节麦群体及不同居群间的遗传多样性水平和遗传分化程度，采用POPGENE.32软件对河南、陕西和新疆节节麦居群的群体基因遗传多样性(表3)、群体基因的遗传分化程度(表4)、三居群间的遗传一致度和遗传距离(表5)参数进行计算和比较分析，并依据遗传距离对不同居群进行聚类分析(图4)。结果表明，陕西节节麦的群体遗传多样性水平(He=0.242 0，I=0.366 0)略高于新疆(He=0.239 9，I=0.360 3)和河南(He=0.228 1，I=0.354 7)。新疆节节麦的多态性位点比率最低，仅为71.04%。中国节节麦群体的总基因多样性为0.274 7，不同群体间发生一定的遗传分化(Gst=13.85%)，并存在中等程度的基因交流(Nm=3.11)。基于遗传距离对不同居群节节麦的UPGMA聚类结果也表明，中国节节麦可分为黄淮流域节节麦和新疆伊犁地区节节麦两大居群，而河南节节麦和陕西节节麦有较高的遗传一致度(S=0.971 8)，遗传距离较近(D=0.039 7)。采用AMOVA 1.55软件对黄河流域节节麦和新疆伊犁地区节节麦(Groups)及河南、陕西和新疆节节麦(populations)的分子变异分析(表6)也进一步表明了类似的情况，黄河流域与新疆伊犁地区节节麦的遗传变异占总变异的18.57%，而河南、陕西、新疆节节麦的遗传变异占总变异的10.38%。群体间存在较明显的遗传分化。

表3 不同居群的中国节节麦的遗传多样性分析Table 3 Genetic diversity of three populations of Chinese Aegilops tauchii accessions

表4 中国节节麦群体基因遗传多样性的Nei’s分析Table 4 Nei’s analysis of gene diversity of Chinese Aegilops tauchii accessions

表5 三个中国节节麦居群的遗传一致性和遗传距离分析Table 5 Genetic distance and similarity among three populations of Chinese Aegilops tauchii accessions

图4 河南、陕西和新疆节节麦居群的UPGMA遗传距离聚类图

3 讨 论

具有广泛的地理分布和自然变异的节节麦(Aegilopstauschii)，是小麦族野生物种中最重要也最易于用于小麦遗传改良的宝贵种质资源[3-4]。而在我国黄淮麦区有良好适应性的黄河流域节节麦，不仅没有参与普通小麦的起源，隶属于存在更广泛遗传变异的L1居群，且部分来源于河南、陕西的黄河流域节节麦，还具有其他节节麦所缺乏的独特遗传变异[6-7]。因此，系统采集并开展中国节节麦的遗传多样性分析，从中筛选具有独特遗传变异的种质资源，无论对节节麦的物种多样性保护，节节麦的起源和传播研究，还是对中国节节麦在小麦遗传改良中的有效利用，均具有重要的理论价值和现实意义。

表6 中国节节麦群体的分子变异分析Table 6 Analysis of molecular variation of Chinese Aegilops tauchii accessions

目前对节节麦的遗传多样性分析虽已有不少报道[7-8,18-22]，但对中国节节麦遗传多样性和群体间分化程度的比较分析却并不多[20]。本课题组基于中国节节麦对小麦遗传改良中的重要性，对其进行了系统的采集和大规模的遗传多样性分析和相关优良性状的初步鉴定和分析[8-13]，本研究主要在已开展的黄河流域[8]和新疆伊犁地区节节麦[9]SSR遗传多样性分析的基础上，从中筛选出75份有代表性的中国节节麦，进一步开展遗传多样性的ISSR分析，并期望通过群体间的遗传分化程度比较和聚类分析，从中筛选出可能具有独特遗传变异的种质资源。研究结果与SSR[8-9,20]的分析基本一致，黄河流域节节麦和新疆伊犁节节麦有较显著的遗传差异。除个别例外节节麦外，绝大多数中国节节麦，可依据其地理分布进行分组，其中，存在地理隔离的新疆伊犁地区节节麦和黄河流域节节麦的差异较大，河南和陕西节节麦的遗传一致度较高，不同群体间存在较为明显的遗传分化(PHist=0.289，Gst=0.138 5)。按照Buso等[23]的分类，属于中等程度的遗传分化。而三群体间的基因流为3.11>1，表明三群体间的遗传分化可能与遗传漂变无关。根据NTsys、POPGENE和AMOVA分析结果均可以看出，不同节节麦的地理分布和生境差异，可能是造成中国不同居群节节麦差异的主要原因。

此外，与Mizuno等[6]和Sohail等[7]对世界不同地理分布的节节麦的种群遗传结构分析类似，本研究也表明，在黄淮麦区有良好适应的黄河流域节节麦，部分具有独特的遗传变异。在分析的75份中国节节麦，尽管绝大多数在遗传距离约0.71处均聚类形成一个较大的分支Group 1，但有5份来源于河南(T078、T102和T006)和陕西(SC1和SX38)的节节麦，却在聚类分析和二维主成分分析中形成了两个明显独立的分支Group 2和Group 3。实验室前期对黄河流域[11]和新疆伊犁地区[9]节节麦HMW-GS的组分分析也表明，尽管新疆伊犁地区节节麦的HMW-GS组成比较一致(均为2+10亚基组合类型)，黄河流域节节麦也以5t+10.5t亚基组合为主要的组合类型(分布频率高达96%)，但ISSR分析中位于Group 3的节节麦T006，其HMW-GS组却为分布频率较低的6.2t+10.4t组合类型。李玉阁[24]对部分中国节节麦LMW-GS和α-、γ-醇溶蛋白的基因克隆和分子特征分析也表明，T006和SC1的LMW-GS基因与对品质可能有较大贡献的D3-2和D3-4单倍型有较高的同源性，其α-、γ-醇溶蛋白基因的分子特征上存在独特的遗传变异。其α-醇溶蛋白基因部分与A、B基因组来源的α-醇溶蛋白基因有更高的同源性，不含或含有较少的、可诱发人类最常见的一种慢性遗传性疾病-乳糜泻(celiac diesease，CD)的免疫优势多肽，其绝大部分γ-醇溶蛋白也与B基因组来源的、存在于强筋优质小麦的基因有更高的同源性，在N-末端重复区含有一个额外的半胱氨酸残基。因此，综合以上分析结果，本研究推测这5份节节麦，至少是实验已开展分析的T006和SC1，可能是节节麦遗传多样性保护和小麦遗传改良可利用的独特种质资源。对其LMW-GS和α-、γ-醇溶蛋白的基因独特分子特征及其在小麦品质改良和CD预防中的应用价值的进一步深入分析和鉴定，目前正在的试验中。

有关中国黄河流域节节麦和新疆节节麦的传播关系，目前尚存在一定争议。有研究[8,19-20,25-26]认为黄河流域节节麦可能是作为普通小麦的伴生种，从伊朗经丝绸之路传入我国的，而新疆伊犁地区节节麦是中东节节麦野生居群在东部的延续，二者不存在直接的传播关系。也有研究[27]认为，中国节节麦至少起源于两个不同的居群，新疆节节麦可能起源于黄河流域节节麦，但也不排除黄河流域节节麦是从新疆传播而来的可能。而本研究中对中国节节麦的ISSR遗传多样性的聚类分析也发现，在系统进化树中有两份河南节节麦(T002和T023)聚类在了新疆亚组，而两份新疆节节麦(XJ6和XJ49)却聚类在了黄河流域节节麦亚组，与陕西节节麦有更高的同源性。可见，对代表性中国节节麦、以及在聚类分析中处于特殊地位的节节麦与国外节节麦，采用更多的分子标记类型、进行更广泛的遗传多样性分析，也有望为揭示黄河流域节节麦和新疆节节麦的传播关系研究，提供更多的证据和参考。

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Genetic Diversity ofAegilopstauchiiAccessions Native to China Revealed by ISSR Markers

LI Yuge,SU Yazhong,ZHANG Dale,LI Suoping

(College of Life Science,Henan University,Kaifeng,Henan 475004,China)

In order to reveal the genetic diversity ofAegilopstauchiiaccessions native to China extensively and screen some beneficial wild resources with individual genetic variation,ISSR markers were used to assess the genetic diversity of 75 ChineseAegilopstauchiiaccessions. Nine ISSR primers produced 138 (89.31%) polymorphic bands out of 155 bands in total. Genetic parameters including average number of effective alleles (Ne=1.471 5),Nei’s gene diversity (He=0.273 4),Shannon’s information index (I=0.415 2),and gene differentiation coefficient (Gst=0.138 5) revealed a high level of genetic diversity and middle level of gene flow maintained in ChineseAelilopstauchiipopulations.A dendrogram constructed on the basis of cluster analysis of similarity simple coefficient clustered all the samples in three main groups 1,2 and 3. Although most of accessions except for T002,T023,XJ6 and XJ49 were placed into group 1 with two subgroups (sub 1 and sub 2),regarding to their different locations (Yellow River basin and Yili River Valley in Xinjiang). There were still five accessions from Henan and Shaanxi provinces clustered in group 2 (T078,T102 and SC1),and group 3 (SX38 and T006). The further two-dimensional principal coordinates analysis (PCoA),the analysis on the genetic distance and similarity among Henan,Shaanxi and Xinjiang populations and the analysis of molecular variance (AMOVA) also confirmed the results that the genetic similarity of Henan and Shaanxi was highest among the three populations. 18.57% of the variance was due to the differences between Yellow River basin and Yili Valley,and 10.38% of the variance was due to differences among populations of Henan,Shaanxi and Xinjiang and the remaining 71.05% was due to differences within populations. Thus,it was suggested that the high genetic diversity of ChineseAegilopstauchiiwas attributable to geographic isolation,and the five accessions constituted two independent groups 2 and 3 maybe the beneficial wild resources with individual genetic variations.

Aegilopstauchiiof China; ISSR; Phylogenic analysis; PCoA; AMOVA

时间：2017-01-03

2016-06-06

2016-12-15

国家自然科学基金面上项目(31271713)；河南省高等学校重点科研项目(15A180011)

E-mail：lygzixiu@henu.edu.cn

李锁平(E-mail：lisuoping@henu.edu.cn)

S512.9；S330

A

1009-1041(2017)01-0030-10

网络出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1359.S.20170103.1625.010.html