青稞主要性状的差异性与遗传分析

孟亚雄，马增科，任盼荣，司二静，汪军成，杨 轲，张海娟，马小乐，王育才，王化俊

(1.甘肃省干旱生境作物学重点实验室/甘肃省作物遗传改良与种质创新重点实验室，甘肃兰州 730070；2.甘肃农业大学农学院，甘肃兰州 730070)

青稞主要性状的差异性与遗传分析

孟亚雄1,2，马增科1，2，任盼荣1,2，司二静1,2，汪军成2，杨 轲1,2，张海娟1,2，马小乐1,2，王育才1,2，王化俊1,2

(1.甘肃省干旱生境作物学重点实验室/甘肃省作物遗传改良与种质创新重点实验室，甘肃兰州 730070；2.甘肃农业大学农学院，甘肃兰州 730070)

为合理评价110份青稞品种(系)的农艺性状及遗传特性，对参试种质材料的株高、穗长、穗粒数、分蘖数和千粒重进行了调查统计，同时用分布于大麦全基因组的48对SSR标记进行了遗传多样性分析。结果表明，参试材料各农艺性状变异较大，变异系数为2.92%～42.33%，其中株高、穗长、分蘖数、穗粒数和千粒重变化范围分别为53～122 cm、2.5～7 cm、2～19个、20～90粒和25.46～60.34 g。SSR标记共检测到168个等位变异，变化范围为2～6个。110份青稞种质材料分成三大类群。SSR标记的1 128个位点成对组合中，不论是共线性成对组合还是非共线性成对组合，都存在一定的连锁不平衡(linkage disequilibrium,LD)。D′统计概率(P<0.01)支持的LD成对位点438个，占全部位点的38.8%，D′的平均值为0.36，整体LD水平较高。较高水平的LD位点(D′>0.5)主要分布在2H、4H、6H和7H连锁群上。

青稞；农艺性状；SSR标记；连锁不平衡

青稞是生长在青藏高原地区的裸大麦，是我国藏族同胞的主食，也是用来酿造青稞酒的主要原料，具有较高的营养价值和保健功效。近年来，随着对青稞的营养价值和保健功效的深入研究，青稞保健品及食品加工产业也得到了不断发展。青稞除了籽粒外，其秸秆也是青藏高原牧区的主要冬饲草，因此青稞生产对我国藏民的生活有着重要的意义。青藏高原地形复杂多样，种植栽培的青稞种质资源丰富多样，拥有大量可被利用和研究的基因资源[1]。和其他作物一样，现代青稞育种亦是以高产、优质和抗逆为主要育种目标，造成基因流失的现象越来越明显。因此，研究青稞种质材料的遗传多样性，发掘优良资源和有利基因，拓宽种质资源将成为解决该问题的主要途径。

目前，国内外学者已采用多种方式对作物种质资源的遗传多样性进行研究。其中，Dotlacil等[2]和Delacy等[3]认为，作物的形态学标记(农艺性状)比较直观，而且便于识别和易于掌握，且与生产实践直接相关，是一种颇为有效的作物遗传多样性分析的方法。其中，作物的株高、穗粒数、千粒重、分蘖数和穗长等农艺性状是作物育种中要重点考察的对象。另外，随着现代分子标记技术的发展和应用，为作物种质资源研究和有利基因挖掘提供了条件。其中，SSR标记具有重复性好、多态性高等优点，已被广泛应用于作物遗传多样性和基因发掘等方面[4-7]。通过遗传连锁分析发掘基因及鉴定基因功能需要构建作图群体, 要花费大量的时间和精力，而关联分析可以以自然群体为研究对象，不需构建作图群体就可检测出大量的等位变异。基于连锁不平衡( linkage disequilibrium，LD)的关联分析可以将作物表型性状的多样性与基因(位点)的多态性结合起来, 确定不同种质资源所携带的等位基因及其对目标性状的贡献。赖 勇等[8]运用SSR标记对221份大麦材料进行了遗传多样性分析和结构分析，结果显示，在2016个SSR位点中不管是共线性组合还是非共线性组合都存在一定程度的LD，其中栽培品种的LD水平高于地方品种, 且现代遗传改良的目标性状集中于2H、4H、6H和7H染色体。Kraakman等[9]用AFLP(amplified fragment length polymorphism)和SSR标记技术对148份春大麦的抽穗期、株高及叶锈抗性和大麦黄矮病抗性等进行了LD作图，找到了各性状的相关标记。

本研究拟对从西藏、四川、青海和甘肃等地收集的青稞种质材料的株高、穗长、穗粒数、分蘖数和千粒重等农艺性状进行统计调查，同时运用SSR标记技术对其进行遗传多样性分析，以期为合理利用青稞种质资源、选配亲本及发掘有利基因和标记辅助育种提供帮助。

1 材料与方法

1.1 试验材料

选用来自西藏、四川、青海、甘肃等地的110份六棱青稞品种(系)构成自然群体(表1)。每份材料取10粒饱满种子置于培养皿中，在室内避光培养，10 d后采黄化苗，液氮速冻置-80 ℃备用。2013年和2014年在甘肃农业大学黄羊镇育种试验站亲本圃，每份材料种植4行，行长1.2 m。在成熟收获时对试验所需的材料进行随机抽样，每份材料取10株，测定株高、分蘖数、穗长、穗粒数、千粒重等农艺性状，并取平均值。

1.2 SSR标记分析

采用CTAB法[10]从黄化苗嫩叶中提取各材料基因组DNA，其质量和浓度经紫外分光光度计法检测，于-20 ℃冰箱保存。根据Korff等[11]构建的遗传图谱，选取均匀分布于大麦1H～7H染色体的86对SSR标记(有关株高、穗长、穗粒数、分蘖数、千粒重的标记)，进行PCR扩增。扩增体系为10 μL：2×Master Mix 5 μL、10 μmoL·L-1引物1 μL、60 ng·μL-1模板1 μL、ddH2O 3 μL。扩增程序参照赖 勇等[8]。扩增产物经8%聚丙烯酰胺凝胶电泳，银染显色后拍照。

1.3 数据统计分析

各农艺性状的数据在Microsoft Excel 2003中进行统计整理及简单的函数处理。SSR多态性分析和遗传结构分析参照赖 勇等[8]、Maccaferri等[12]和Evanno等[13]的方法。使用TASSEL 2.1软件计算共线、非共线SSR位点组合间的LD水平及支持概率，绘制LD配对检测矩阵图。

表1 供试大麦材料Table 1 Hulless barleys used in the study

2 结果与分析

2.1 青稞农艺性状的统计分析

对110份青稞种质材料的株高、穗长、分蘖数、穗粒数和千粒重进行调查和统计分析结果(表2)表明，参试青稞种质材料的株高变化范围为53.00～122.00 cm，平均值为96.80 cm，总体较高；穗长变化范围为3.00～12.00 cm，平均值为5.08 cm；分蘖数变化范围为2.00～29.00个，平均值为10.74个；穗粒数变化范围为20.00～90.00粒，平均值为59.35粒；千粒重变化范围为25.46～60.34 g，平均值为40.43 g，其中40 g以下的材料有56份。对110份青稞种质材料的5个农艺性状进行方差分析表明，株高、分蘖数、穗粒数、千粒重这4个农艺性状的差异均达到显著水平，只有穗长没有达到显著水平。供试材料的5个农艺性状的变异系数为2.92%～42.33%，其中，株高的变异系数最小，为2.92%，表明材料间株高变异幅度不是很大，可以选择的范围较其他材料窄，具有较为稳定的遗传机制，且受环境条件的影响相对较小；分蘖数的变异系数达到了42.33%，其次是穗粒数，变异系数为24.35%，较高的变异系数说明这几个性状容易受环境的影响，遗传稳定性较差。

表2 青稞种质材料的农艺性状Table 2 Agronomic traits of hulless barley accessions

2.2 SSR多态性分析

用86对SSR标记对110份青稞种质材料进行了扩增，结果(表3)表明，其中48对SSR标记具有多态性，且这些标记在大麦7条染色体上均有分布。根据48对多态性SSR标记的检测结果可知，110份青稞亲本材料的遗传相似系数变化范围为0.225 0～1.000 0，平均值为0.510 6；在110份青稞种质材料中共检测到168个等位变异，每对标记所检测到的等位变异数在2～6之间，平均为3.2个，其中，Bmag7检测到的等位变异数最多，为6个，HVGLUEND等8个标记各检测到2个等位变异，变异数最少，3H染色体上检测出的等位变异数最多，为28个，1H染色体上检测出的等位变异数最少，为15个；SSR标记的Shannon’s信息指数的变化范围0.672 7～1.136 8，平均为1.050 7，标准差为0.099 4。

2.3 群体遗传结构分析

参照Evanno等[13]的研究方法，选取分布于大麦7条染色体上具有多态性的48对SSR标记对参试青稞的种质材料进行群体遗传结构分析，依据K值所对应的最大似然值选择确定合适的群体数目。结果如图1所示，当K值为3时，△K值出现了明显的峰值，各群体内青稞亲本材料的相似性最大，所以根据最大似然值的原则选定K=3为最终的群体数目。

由如图2所示的群体结构分析图可知，参试的110份青稞种质材料可以分为3个亚群，第1亚群有6份材料，第2亚群有73份材料，第3亚群有31份材料。说明参试的110份材料的群体结构比较简单，能够有效地降低群体结构对关联分析产生的影响。记录每一份材料的对应群体概率的Q值，可以为后期进行关联分析提供相应的协变量数据。

2.4 LD分析

应用软件TASSEL 2.1对48对SSR标记的1 128个共线、非共线的SSR位点组合间的LD水平及支持概率进行计算分析，并根据计算结果绘制了LD配对检测矩阵图(图3)。1 128个共线、非共线的SSR位点成对组合当中，均出现了不同水平的LD，且LD水平整体较高。当D′取值为0.2～0.4和0.4～0.6时，LD的成对位点数最多，分别为203和102；D′为0.8～1.0时最少，仅有13个(表4)。D′统计概率(P<0.01)支持的LD成对位点数为438个，占总位点数的38.8%，D′的平均值为0.36。由图3可知，在7个染色体群中均出现较高水平的LD成对位点(D′>0.5)，但主要分布在2H、4H、6H和7H连锁群上，且在染色体2H和6H连锁群上较高水平的LD位点(D′>0.5)比较集中，分别出现了7个和11个。对共线性位点组合的LD状况进一步分析，发现在染色体2H、3H和6H连锁群LD成对位点明显多于其他几条染色体连锁群。

表3 48对SSR标记在110份青稞种质材料中的多态性Table 3 Polymorphism of fourty-eight SSRs among 110 hulless barley accessions

K：群体数目。

K:Number of population.

图1 ΔK值随K值的变化图

Fig.1ΔKwith change ofKvalues

图2 110份青稞亲本材料的群体遗传结构图

D'值范围RangeofD'valueLD成对位点数NumberoflocipairswithsignificantLD0～0.2380.2～0.42030.4～0.61020.6～0.8500.8～1.013

3 讨 论

3.1 根据青稞农艺性状评价种质资源的效果

农艺性状是评价种质资源最经济简捷的方法，由于其易于观测并在一定程度上也能反映出内在基因型的变异情况，因此已被广泛应用于作物种质材料遗传多样性研究和品种选育[14-15]。本研究对110份青稞品种(系)的株高、穗长、穗粒数、千粒重和分蘖数等性状进行了统计分析，结果显示，参试材料各性状变异较大，变化范围在2.92%～42.33%之间，这与前人的研究结果相一致[16-17]。就株高而言，多数参试材料在95cm 以上，变异系数小，说明在青藏高原栽培的青稞种质材料主要以高杆为主。千粒重是作物产量构成的三要素之一，本研究中千粒重的平均值为40.43 g，表明参试材料的千粒重总体上较高，因此可从中选取千粒重大的种质资源杂交以获得更高千粒重的品种(系)来提高青稞的产量。穗粒数和分蘖数等的变化范围较大，表现出极为丰富的多样性，可用于构建核心种质库。通过对农艺性状的综合评价，对优良性状多的材料直接用于育种亲本，提供一定的参考。然而，尽管农艺性状对作物种质的评价是有效的[19]，但品质和抗性也至关重要，在后续的评价中应综合考虑。

双向箭头指示连锁群区域；对角线上方为成对位点间的D′值；对角线下方为成对位点间LD的支持概率；椭圆圈显示较高水平的LD位点分布。

Double-headed arrows show the region of linkage groups;D′ value of the corresponding marker pair and itsP-value are shown in the upper and lower triangles,respectively; The oval circles show distribution of LD loci in high levels.

图3 大麦7个连锁群SSR位点的连锁不平衡分布

Fig.3 Distribution of LD among SSR loci on 7 linkage groups of hulless barley

3.2 青稞种质资源的群体遗传结构以及连锁不平衡分析评价

为了弥补农艺性状评价种质资源的局限性，利用分子标记技术分析不同材料间的遗传差异，明确它们的遗传关系，为后期青稞亲本杂交组合配置提供一定的参考[19-21]。本研究以SSR标记技术对来自西藏、青海、甘肃和四川等地的110份青稞品种(系)进行了遗传结构及连锁不平衡分析。结果显示，110份青稞种质材料被分为3个亚群，说明这些青稞材料的整体遗传多样性不够丰富。根据48对多态SSR标记的检测结果，110份青稞亲本材料的遗传相似性偏高，说明参试材料亲缘关系较近，主要原因可能是由于参试材料主要来源于青藏高原，这与赖 勇等[22]、冯宗云等[23]、杨 平等[24]的研究结果较一致。本研究中1 128个SSR位点的共线性组合和非共线性组合中，D′统计概率(P<0.01)支持的LD成对位点数为438个，占总位点数的38.8%，且主要集中在D′值的0.2～0.4范围内(203个)，总体来看LD水平较高。在7个连锁群均有较高水平的LD(P>0.5)位点，但主要集中在2H、4H、6H和7H染色体上，这对关联分析和有利基因的发掘均有非常重要的意义。赖 勇[8]等选用大麦的64对SSR标记对大麦种质材料进行了分析，结果显示，共线性或非共线性位点组合均有一定程度的LD，且整体LD水平较高。Kraakman等[9]研究表明，栽培大麦的LD水平最高，地方品种次之，野生资源LD 水平最低。因此在后期进行关联分析挖掘青稞种质资源的有利基因过程中，需增加其他不同区域来源的材料，丰富遗传基础，提高关联结果的准确性。为了更有效地改善现有青稞遗传基础狭窄的问题，需要加强对其野生近缘种的开发利用，为培育优良青稞新品种提供宝贵的基因资源。

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Agronomic Characteristics and Genetic Analysis in Hulless Barley

MENG Yaxiong1,2,MA Zengke1,2,REN Panrong1,2,SI Erjing1,2,WANG Juncheng1,2,YANG Ke1,2,ZHANG Haijuan1,2,MA Xiaole1,2,WANG Yucai1,2,WANG Huajun1,2

(1.Gansu Provincial Key Laboratory of Aridland Crop Science/Gansu Key Laboratory of Crop Improvement & Germplasm Enhancement,Lanzhou,Gansu 730070,China; 2.College of Agronomy,Gansu Agricultural University,Lanzhou,Gansu 730070,China)

In order to provide a suitable evaluation for the agronomic traits and genetic characteristics of 110 hulless barley germplasm materials,the plant height,spike length,tiller number,grain number per spike and 1 000-kernel weight traits were analyzed statistically and fourty-eight pairs of SSR markers distributed on chromosomes 1H to 7H were used for genetic analysis.The results showed that there were large differences of agronomic characters: the variable coefficients ranged from 2.92% to 42.33%,and the variation range of plant height,ear length,tiller number,grain number per spike and 1 000-kernel weight trait was 53-122 cm,2.5-7,2-19,20-90,25.46-60.34 g,respectively.A total of 168 alleles were detected in 110 hulless barley accessions with 2 to 6 alleles per locus. All accessions were clustered into three major groups. There were linkage disequilibrium (LD) among linked loci and unlinked loci pairs,and 438 out of 1 128 loci (38.8%) had significant LD (P<0.01) with averageD′-value of 0.36. The LD (D′<0.5) level of hulless barley was high,and the loci were mainly distributed on chromosomes 2H,4H,6H and 7H.

Hulless barley; Agronomic characteristics; SSR marker; Linkage disequilibrium

时间：2017-01-03

2016-03-24

2016-12-10

国家自然科学基金地区项目(31460347)；盛彤笙科技创新基金项目(GSAU-STS-1513)；国家大麦青稞产业技术体系项目(CARS-05)

E-mail：yxmeng1@163.com

S512.3；S330

A

1009-1041(2017)01-0048-08

网络出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1359.S.20170103.1625.014.html