灌水处理对黄冠梨叶片结构和激素含量及PbDREB基因表达的影响

黄海娜，杨金宇，李红旭，刘小勇，叶振风，朱立武，衡伟

(1. 安徽农业大学园艺学院，安徽 合肥 230036； 2. 甘肃省农业科学院果树研究所，甘肃 兰州 730070)

梨(PyrusL.)属于蔷薇科(Rosaceae)、梨亚科(Pomaceae)、落叶乔木[1]。黄冠梨(Pyrusbretschneideri×pyrifolia)是中国培育的优质、丰产早中熟品种，在中国已大量栽培[2]，已成为许多省市的支柱产业[3]。中国是一个水资源短缺的国家，尤其是西北大部分地区为干旱、半干旱气候，降雨量少，蒸发量大[4]。因此，研究一种最节水、最有效的灌溉方法对干旱、半干旱地区梨产业的发展具有极其重要作用。覆膜滴灌是地膜覆盖栽培与滴灌技术相结合的高效节水灌溉方式，能有效改善土壤水、热、气、肥条件，从而达到提高产量、改善品质的目的[5]。李昭楠等[6]的研究表明，在甘肃河西走廊干旱荒漠区，膜下滴灌葡萄产量和水分利用效率均高于未覆膜滴灌的产量。李敏敏等[7]对苹果研究发现，膜下滴灌可以提高苹果的产量和水分利用率。

多年来，国内外对果树抗旱机制的研究主要集中在叶片组织结构特征、生理生化以及抗旱基因表达等方面[8]。研究表明，植物的抗旱性与植物叶片的形态解剖结构呈一定的相关性[9-11]。在生理生化与抗旱性关系的研究方面，植物内源激素是对干旱胁迫最为敏感的生理活性物质[12]。随着生物技术的提高，人们对抗旱机制的研究更加深入，脱水反应元件结合蛋白(dehydration responsive element binding, DREB)是一类参与应答植物低温、高盐和干旱等非生物胁迫的主要调控蛋白，特异识别并结合 DRE顺式作用元件，启动下游基因的表达[13]。DREB受低温、高盐和干旱等逆境胁迫的诱导，通过在植物体内的调控表达，从而维持植物细胞的正常生理生化代谢活动，主要表现为细胞膜结构的稳定、细胞渗透压的调节、消除活性氧对细胞的毒害等，提高植物的抗逆性[14]。

本研究以不同的灌水方式浇灌梨园，针对不同灌溉处理对黄冠梨叶片组织结构、激素含量及DREB基因表达量的影响进行研究，以期找出可满足果树高产和提高水分利用率的最佳灌水方式，为该地区梨园节水滴灌提供理论依据和实践指导。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验在兰州市景泰县条山集团梨园内进行，供试品种为生长健壮、均匀一致的‘黄冠’梨，砧木为杜梨，树龄9a。待果实采收后分别从各处理梨树冠外围东、南、西、北面及内膛当年生枝条上随机釆取叶片各30个，置入冰盒带回实验室进行生理指标测定，随机挑取嫩叶进行RNA的提取。

1.2 试验处理

梨树行内覆盖黑色地膜，覆膜宽度2.0 m，植株两边距离树干1.5 m处各设置一条“小孔回流”滴灌带。各处理选择正常植株6株，处理间留2株间隔植株，组合小区，顺序排列，4次重复灌溉水通过水泵抽取，灌水量由水表自动控制流量。覆膜滴灌下渗深度观测，均通过各处理行间预设的100cm壕沟固定观察点进行。实验设6个处理，其中以常规漫灌为对照，具体灌水方式如下：

CK：常规漫灌，分别于花后、果实迅速膨大期和果实膨大期进行灌水，共3次/年，每次灌水量相同，年灌水总量为10200 m3·hm-2。

T1：覆膜滴灌，分别于花前、花后、果实迅速膨大期和果实膨大期(2次)进行灌水，共5次/年，每次下渗60 cm，年灌水总量为4800 m3·hm-2；

T2：覆膜滴灌，分别于花前、花后、幼果期、果实迅速膨大期和果实膨大期(2次)进行灌水，共6次/年，每次下渗60 cm，年灌水总量为5400 m3·hm-2；

T3：覆膜滴灌，分别于花前、花后、幼果期、果实迅速膨大期和果实膨大期(4次)进行灌水，共8次/年，每次下渗40 cm，年灌水总量为5400 m3·hm-2；

T4：覆膜滴灌，分别于花前、花后、幼果期、果实迅速膨大期和果实膨大期(4次)进行灌水，共8次/年，每次下渗60 cm，年灌水总量为6000 m3·hm-2；

T5：覆膜滴灌，分别于花前、花后、幼果期、果实迅速膨大期和果实膨大期(5次)进行灌水，共9次/年，每次下渗60 cm，年灌水总量为6750 m3·hm-2；

1.3 方法

1.3.1 叶片组织结构观察 9月中旬采集自然状态下正常的6种不同灌溉处理梨树叶片，剪取中部成熟叶片主脉中间0.5 cm×0.5 cm的小块，用FAA固定液固定后用石蜡切片法[15]切片观察叶片组织结构。切片厚度8～10 μm，番红-固绿染色，加拿大树胶封片。用显微测微尺测量其叶片总厚度、栅栏组织厚度、海绵组织厚度，每片观察3个视野，重复 6次，每种砧木观察视野总数18个。按以下公式计算叶片组织结构紧密度(CTR)和组织结构疏松度(SR)[11]。

CTR(%)=栅栏组织厚度/叶片厚度×100

SR(%)=海绵组织厚度/叶片厚度×100

1.3.2 激素含量测定 叶片中总赤霉素(GA)、玉米素核苷(ZR)、生长素(IAA)、脱落酸(ABA)等含量测定采用酶联免疫法[16]。

1.3.3 黄冠梨PbDREB基因克隆 利用艾德莱RNA试剂盒(北京艾德莱生物科技有限公司)提取黄冠梨叶片的总RNA，并用1%琼脂糖电泳检测其完整性。用M-MLV反转录酶(Promega公司)合成第一链cDNA，具体反应体系和操作步骤依据说明书进行。

根据其它物种DREB基因的保守序列设计特异性引物，以‘黄冠’梨叶片的cDNA为模板，经PCR扩增目的片段，PCR扩增产物经1%琼脂糖电泳分离后回收，连接到pGEM-T载体中，挑取单菌落进行测序。PCR反应体系为20 μL，反应程序为:94℃预变性3 min，94℃变性30 s，50℃退火30 s，72℃延伸1 min，共30个循环。参照TaKaRa公司的3′-Full RACE Kit试剂盒，根据所获得的目的片段设计3′端引物，经PCR扩增出3′端的片段序列，测序后与目的片段拼接。将所得序列与我们构建的梨EST库比对，找出保守序列设计5′端引物，经PCR扩增出5′端序列，测序后与目的片段拼接。根据拼接序列，设计全长引物，验证拼接结果。试验中所用引物序列如表1所示。

表1 梨PbDREB 基因克隆和表达的相关引物

1.3.4PbDREB基因生物信息学分析 利用相关生物信息学网站对已得基因全长进行生物信息学分析。运用NCBI网站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)查找和翻译开放阅读框(Open Reading Frame, ORF)；运用NCBI数据库中的BLASTX对氨基酸序列进行同源性搜索和比对；运用Protparam(http://www.expasy.ch/tools/protparam.html)对蛋白质理化性质进行在线分析；用TMHMM-2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM)对PbDREB氨基酸序列进行分析；运用Net Phos2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/)进行磷酸化位点分析；运用Psort(http://psort.hgc.jp/form.html)进行亚细胞定位分析；氨基酸多重序列比较采用Clustalw2(http://www.ebi.ac.uk/tools/msa/clustalw2/)。

1.3.5PbDREB基因表达分析 分别以黄冠梨叶片的cDNA为模板，以黄冠梨的Actin片段为内参，采用RT-PCR对其进行组织特异性表达分析。根据RACE获得的PbDREB全长序列，使用primer premier 5.0设计荧光定量PCR引物(表1)。使用ABI STEPONE荧光定量PCR仪进行荧光定量PCR分析，采用20 μL反应体系：SYBRTM Premix Ex Taq 10 μL，正、反向引物(10 μmol · L-1)各0.8 μL，ROX Reference Dye 50X 0.4 μL，cDNA模板2.0 μL，ddH2O 6.0 μL。反应程序为：95℃预变性90 s；PCR反应：95℃变性15 s，60℃退火40 s，总共40个循环，每个样品进行4次重复检测，使用2-△△Ct法，求得待测样品相对表达量。

1.4 数据分析

采用 Excel 2003整理实验数据，运用 SPSS 17.0统计软件进行单因素方差分析。

2 结果与分析

2.1 叶片解剖结构特征比较

从叶片的横切解剖结构看(见图1)，上下表皮细胞均为单层。5个处理和对照叶片的栅栏组织细胞均为长柱型，排列整齐而紧密，厚度在65.28～82.72 μm之间。海绵组织位于栅栏组织与下表皮之间，形状不规整，排列疏松，多空隙，厚度在101.91～125.41 μm之间，不同处理之间厚度有较大的差异。

由表2可知，与对照相比，5种处理的叶片厚度均显著增大。其中T3的叶片厚度最大，达到257.13 μm；T3、T4和T5的角质层厚度高于对照，T1和T2低于对照；除T2的栅栏组织厚度小于对照外，其它处理均大于对照；除T5的海绵组织厚度与对照差异不显著外，其它处理均显著高于对照；T2的CTR值低于对照，其它处理均高于对照，其中T1最高，T5次之；T1、T2和T4的SR值显著高于对照，T3和T5低于对照，其中T5的SR值最小，但未达到差异显著水平。同时，年灌水量相同(年灌水总量为5400 m3·hm-2)、灌水次数与下渗深度不同的T2与T3比较，T3处理叶片厚度、角质层厚度、栅栏组织厚度、栅栏组织/海绵组织与叶片结构紧密度均明显高于T2，且差异达到显著水平。

图1 不同灌溉处理的黄冠梨叶片横切解剖结构图Fig. 1 Leaves crosscutting anatomical structure pictures of ‘Huangguan’ pear of different irrigation treatments

处理Treatment叶片厚度Leaf thickness/μm角质层厚度Thickness of cuticle/μm栅栏组织厚度Thickness of palisade tissue/μm海绵组织厚度Thickness of spongy tissue/μmCTR/%SR/%CK224.57c3.30bc72.33bc101.91c32.20ab45.38bT1245.21b2.42d82.22a118.81ab33.45a48.45aT2235.80b2.84cd65.28c115.24b27.72c48.84aT3257.13a4.55a82.72a113.00b31.99ab44.10bT4256.03a3.66b76.21ab125.41a29.68bc49.10aT5237.91b3.39b78.29ab103.82c32.90a43.62b

注：CTR表示叶片组织结构紧密度；SR表示叶片组织结构疏松度；同列不同小写字母表示不同处理P<0.05水平差异显著。以下图表同上。

Note:CTRmeans the leaf tissue structure tense ratio;SRmeans the leaf tissue structure spongy ratio; Different small letters in one column mean significant difference among treatments atP<0.05. The same as below.

2.2 叶片激素含量变化

由表3可知，与对照相比，5种处理均显著提高叶片中的ABA含量，其中T5含量最高，达到118.87 ng·g-1；除T5的IAA和GA含量显著低于对照外，其它处理均高于对照；T3和T4的ZR含量均显著高于对照，其它处理均显著低于对照，其中T5的ZR含量最低，仅7.3 ng·g-1。年灌水量相同(年灌水总量为5400 m3·hm-2)、灌水次数与下渗深度不同的T2与T3相比，T2的ABA、IAA和GA含量均显著高于T3，但T2的ZR含量显著低于对照，说明年灌水量相同，灌水次数和灌水深度对叶片中激素含量影响显著。

2.3 基因克隆及表达分析

2.3.1PbDREB基因全长cDNA克隆及序列分析 通过ORF Finder分析，PbDREB基因全长cDNA为1551 bp，其中包含5′非编码区10 bp，3′非编码区346 bp和开放阅读框1197 bp，编码398个氨基酸，起始密码子为ATG，终止密码子为TGA。

表3 不同灌溉处理对黄冠梨叶片ABA、IAA、GA和ZR含量(鲜重)的影响

通过Protparam分析其理化性质，推测PbDREB蛋白分子式C1858H2863N531O630S23，其相对分子量为43456.7，等电点4.8。其理论半衰期约为30 h，不稳定参数为44.58，蛋白质性质不稳定(40以下为稳定蛋白)。该蛋白中相对含量较多的氨基酸是甘氨酸Gly(11.3 %，45个)、丝氨酸Ser(10.1 %，40个)和谷氨酸Glu(8.5%，34个)，预测该蛋白为亲水性蛋白。TMHMM-2.0分析PbDREB氨基酸序列没有跨膜结构域，没有信号肽。NetPhos2.0预测结果显示，PbDREB蛋白有18个Ser、7个Thr和3个Tyr，可能成为蛋白激酶的磷酸化位点。推断PbDREB蛋白可能定位于细胞核。

将PbDREB基因编码的氨基酸序列进行同源分析，结果发现，该氨基酸序列与很多植物DREB氨基酸序列具有较高的一致性(图2)。PbDREB编码的氨基酸序列与苹果MdDREB2-1编码的氨基酸序列一致性最高，为59.8%，其它依次是沙冬青AmDREB2C38.8%、草莓FvDREB2C-like36.4%、蓖麻RcDREB2C34.2%、黄瓜CsDREB2C-like33.8%、鹰嘴豆CaDREB2C-like31.3%、川桑MnDREB2A30.7%。

注：图中分支点的数字表示Bootstrap验证中基于1000次重复该节点可信度的百分比；标尺代表遗传距离。Note: The number on the branches indicate the reliability percent of Bootstrap values based on 1000 replications; the scale bar represents genetic distance.图2 不同植物DREB氨基酸序列的系统进化树分析Fig. 2 Phylogenetic tree of DREB amino acid sequences from different plants

2.3.2PbDREB在不同灌溉处理下的表达 由图3可知，PbDREB在6种处理的叶片中均有表达，除T1与对照差异不显著外，其它处理均显著高于对照，其中在T5中的表达量最高，达到2.75，是对照的2.89倍；当灌水下渗深度同为60 cm时(T1、T2、T4和T5)，各处理叶片PbDREB基因表达量随年灌水量的增加而上升，且达到差异显著水平。年灌水量相同(年灌水总量为5400 m3·hm-2)、灌水次数与下渗深度不同的T2与T3相比，PbDREB在T2中的表达量略低于T3，但未达到差异显著水平，说明灌水量相同时，灌水次数和下渗深度对PbDREB基因表达量的影响不显著。

图3 不同灌溉处理下叶片中PbDREB的表达水平Fig. 3 Expression pattern of PbDREB in the leaves of six different irrigation treatments

3 讨 论

果树的抗旱能力是一种复合性状[17]，指标的合理选择是抗旱性鉴定的关键。在叶片结构上，CTR和SR等指标与果树的抗旱性密切相关，这在葡萄[18]、核桃[19]、桃[11]、酸枣[20]、苹果[21]等果树上已得到证实。郑国琦等[22]研究发现，月灌水定额小于900 m3·hm-2时，随着灌水量的增加，叶片厚度、栅栏组织厚度和叶片结构紧密度显著增加。有关不同灌水处理对梨叶片解剖结构的影响尚未见研究报道。本研究结果发现，叶片厚度、栅栏组织厚度和叶片结构紧密度并没有随着灌水量的增加而增加，但灌水量最大的T5(灌水9次、下渗60 cm、年灌水总量为6750 m3·hm-2的覆膜滴灌)处理的叶片栅栏组织厚度/海绵组织的比值最大、CTR较大、SR最小。栅栏组织厚度/海绵组织的比值和CTR增大是植物对水分短缺的一种响应，该特征有助于CO2气体从气孔下室到光合作用场所的传导，又可抵消因气孔关闭和叶肉结构的变化所引起的CO2传导率的降低，从而提高植物对水分的利用率，表现出植物的抗旱适应性[23]。

内源激素是植物体生命活动的调节者，在逆境胁迫下，植物通过内源激素的变化如IAA、ZR和CTK浓度的减少和ABA浓度的升高来调节某些生理过程以达到适应逆境的效果，已经在许多果树等植物上得到证明[24]。本研究发现，T5(灌水9次、下渗60 cm、年灌水总量为6750 m3·hm-2的覆膜滴灌)处理的叶片中ABA增加的同时，IAA、ZR和CTK均减少，从而可以改变膜的特性，使气孔关闭，改变代谢氧的容量与膜相结合的酶的活性，促进降解过程并抑制合成过程[25]。但关于灌水量对植物内源激素的影响，目前报道较少。王永平[26]研究发现，玉米籽粒的 ABA、Z+ZR、GAs和IAA含量受水分影响明显，随着灌水量提高内源激素含量显著提高。但本研究发现，随着灌水量的增多，内源激素含量并没有规律性地增多，引起相关差异的原因，有待进一步试验研究。

周永斌[27]等研究表明，在不同的干旱胁迫条件下，转基因(一种DREB类基因)植株的抗旱能力明显高于受体对照。周伟[28]等研究发现，重组酵母菌株与表达VaDREB基因的转基因拟南芥株系均表现出明显增强的盐、干旱、低温和高温胁迫耐受性表型，基因表达分析结果表明，转基因拟南芥株系中抗逆相关功能基因的表达量出现了明显上调。施肖堃[29]证明对甘蔗转入EaDREB2B基因可以提高其耐旱性。综上结果证明VaDREB转录因子在植物抗逆调控过程中起着重要作用。本研究结果表明，DREB在6个不同灌溉处理的黄冠梨叶片中都有表达，并且与灌水次数和灌水量呈正相关，说明6种不同灌溉处理的黄冠梨都具有一定的抗逆性，其中在T5(灌水9次、下渗60cm、年灌水总量为6750 m3·hm-2的覆膜滴灌)处理的叶片表达量最高。然而，DREB类转录因子超表达在提高植株耐逆性的同时还会产生生长迟缓、植株矮化、产量下降等不良影响，这种负效应可以通过用胁迫诱导启动子或其它条件性启动子启动DREB基因的表达来加以克服[30]。这一步骤在今后有待于进一步的研究。

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