外源褪黑素对低温胁迫下油菜幼苗抗寒性的影响

史中飞,梁娟红,张小花,成宏斌,郑 晟,王 娟,张腾国

(西北师范大学生命科学学院，甘肃 兰州 730070)

植物在自然环境中生长会受到各种非生物胁迫的影响。在植物应对低温胁迫的过程中可以发生多种生理代谢和生化分子的变化，如过氧化氢、超氧阴离子和羟自由基等活性氧(ROS)的大量积累，而ROS的积累能够导致脂质的过氧化和细胞内蛋白质的氧化，抑制植物的正常生长发育[1]。因此，植物为了防止ROS引起的氧化损伤，进化出一系列复杂的抗氧化系统，包括超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)等抗氧化酶系统和谷胱甘肽、脯氨酸等非酶抗氧化剂，它们可以直接参与ROS的反应，也可作为酶的反应底物，参与ROS信号诱导的其他反应[2]。

植物为了应对各种非生物胁迫，也进化出了一系列复杂的调控机制，包括蛋白磷酸化激酶的激活，如丝裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinase，MAPKs)和钙依赖性蛋白激酶(CDPKs)的磷酸化激活，参与植物对各种非生物胁迫的响应。MAPK级联途径由三种连续作用的蛋白激酶组成：即MAPKK激酶(MAPKKK)、MAPK激酶(MAPKK)和MAPK。当细胞外刺激被胞膜受体识别，MAPKKK首先被磷酸化激活，然后MAPKKK磷酸化激活MAPKK，MAPKK近一步使MAPK磷酸化激活，活化的MAPK可以与其他信号分子相互作用并激活特定的下游靶标，例如转录因子和其他功能性蛋白质，导致信号的响应[ 3]。越来越多的研究表明，MAPK级联途径在植物响应干旱、盐、低温等非生物胁迫方面起不可或缺的调节作用。在拟南芥中，研究最多的MAPKs包括AtMAPK3、AtMAPK4和AtMAPK6，受低温、盐和机械损伤的诱导[4]。水稻中，OsMKK6和OsMPK3能构成中度低温信号传导途径并调节水稻对冷胁迫的耐受性；过表达OsMAPK5株系表现出OsMAPK5激酶活性和对干旱、盐、冷胁迫的耐受性增加，表明OsMAPK5基因可以正向调节水稻对干旱、盐和低温的耐受性[6]。棉花的研究表明，GhMPK2的过表达降低了ABA的敏感性，增强了转基因烟草植株对盐和干旱胁迫的耐受性[7]。

褪黑素(N-乙酰基-5-甲氧基色胺，Melatonin，MT)是一种吲哚类色胺，是由松果体合成的一种小分子激素，广泛存在于动物和人体内，1993年首次在日本牵牛花(Pharbitisnil)中被发现[8]，随着人们不断地研究表明，褪黑素也普遍存在于其它高等植物之中，并在植物生长、发育中具有多种生理功能，如调节昼夜节律、花形态发育、促进叶绿素合成和提高植物的光合作用等[9]。植物中褪黑素的另一主要功能是充当活性氧(ROS)清除剂，作为抵御植物内部和环境氧化应激的第一道防线[10]，研究表明，外源施用或内源诱导的褪黑激素能够增强植物对盐、寒冷、干旱等非生物胁迫的抗性，并能延缓叶片衰老[11]。赵小红[12]等对黄瓜的研究表明，在低温胁迫下，适宜浓度的外源MT处理能够提高SOD、POD、CAT的活性和脯氨酸的含量，降低相对电导率和MDA的含量，增强黄瓜幼苗的抗性，缓解低温给黄瓜幼苗带来的伤害。吴雪霞[13]等研究发现，外源MT能够增强低温胁迫下茄子幼苗的光合作用以及清除活性氧的能力，减缓低温胁迫的危害，提高茄子幼苗对低温胁迫的耐性；此外，对玉米[14]、菘蓝[15]的研究也表明褪黑素具有缓解低温冷害的作用，而在油菜(Brassicarapa)方面的研究鲜见报道。

我国北方寒旱区地域辽阔广袤，但冬春低温严寒，冬茬农作物越冬十分困难，油菜作为我国重要的油料作物，在北方地区推广冬油菜种植不但可以增产油料，也可以增加北方冬季土地覆盖率、改善生态环境等。本研究以白菜型冬油菜品种陇油6号为试验材料，用100 μmol·L-1MT预处理后再进行4℃低温处理不同的时间，研究其对丙二醛含量、相对电导率、叶绿素含量、ROS含量、抗氧化酶活性和MAPK3、MAPK4、MAPK6基因表达的影响，分析外源MT对低温胁迫下油菜幼苗抗性的影响，为深入研究MT在植物中的生物学功能提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料培养与处理

白菜型冬油菜陇油6号种子由甘肃农业大学提供，将购自上海森科农业生物技术公司的进口丹麦品氏草炭土与蛭石按2∶1的比例搅拌混匀，装入小四方花盆中，用含有0.05 g·L-1艾美乐杀虫剂的1/8 MS营养液完全浸透，挑选颗粒饱满且经1% NaClO消毒的陇油6号种子，播种到花盆中，每盆6～8粒，置于25℃恒温、14 h/10 h(光照/黑暗)、250 μmol·m-2·s-1的光照培养室培养，培养30 d左右后进行以下实验处理：(1)4℃低温处理：挑选生长良好的油菜幼苗浇灌1/8 MS营养液预处理24 h后，转入4℃低温培养箱培养，并于不同时间点(0、12、24、36、48 h)取样，测定相关生理指标，并取胁迫处理24 h的幼苗叶片提取总RNA，用于基因的表达分析；(2)褪黑素预处理后再低温处理：用含有100 μmol·L-1MT的1/8 MS营养液预处理生长良好的油菜幼苗24 h后，在4℃低温培养箱培养处理不同时间段(0、12 、24 、36 h和48 h)后测定生理指标，并取胁迫处理24 h的幼苗叶片提取总RNA，用于基因的表达分析；(3)对照(CK)：油菜幼苗浇灌等量1/8 MS营养液，25℃恒温培养，单独的MT处理：油菜幼苗浇灌等量含有100 μmol·L-1MT的1/8 MS营养液，25℃恒温培养。

1.2 试验方法

1.2.1 生理指标的测定 丙二醛、相对电导率、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)的测定均参照李合生[16]的方法，叶绿素含量采用直接浸提法[17]测定，每个指标做3个生物学重复。

1.2.3 实时荧光定量PCR分析MAPK3、MAPK4、MAPK6基因表达 提取实验处理后陇油6号叶片的总RNA，反转录成cDNA后，以ActinF、ActinR为管家基因引物，MAPK3-F、MAPK3-R为MAPK3引物，MAPK4-F、MAPK4-R为MAPK4引物，MAPK5-F、MAPK5-R为MAPK5引物(表1)，依据TaKaRa公司SYBR Premix Ex TaqTM试剂盒用25 μL反应体系进行定量检测，每个样品做3个重复。定量反应体系为：SYBR Premix Ex TaqTM 12.5 μL，上、下游引物各1 μL，cDNA模板2 μL，ddH2O 8.5 μL。反应程序为：95℃预变性30 s；95℃变性5 s，60℃退火20 s，40次循环；55℃～95℃每30 s升高0.5℃，81个循环。每个样品均重复3次，采用2-ΔCt法分析基因的相对表达量。

1.3 数据处理与分析

用SPSS 20.0软件进行统计分析，Image J软件计算染色面积分数和相对灰度分析，Oringin 9.0软件作图。

表1 实时荧光定量PCR引物

2 结果与分析

2.1 外源褪黑素对低温胁迫下油菜幼苗MDA含量的影响

由图1可以看出，与对照(0 h)相比，单独的低温胁迫处理油菜幼苗不同时间(12、24、36、48 h)，油菜幼苗MDA含量呈先上升后下将的趋势，但均高于对照；用褪黑素预处理后再进行低温处理12、24、36、48 h，与单独的低温胁迫处理相比，MDA含量分别降低了14.3%、15.0%、17.2%和20.0%，表明褪黑素预处理能够降低油菜幼苗MDA的含量，缓解低温胁迫下油菜幼苗的膜脂过氧化作用。

2.2 外源褪黑素对低温胁迫下油菜幼苗相对电导率的影响

如图2所示，低温胁迫处理不同的时间，油菜幼苗相对电导率与对照(0 h)相比，呈先上升后下将的趋势，但均高于对照；与单独的4℃处理相比，用褪黑素预处理后再进行低温处理(12、24、36、48 h)，油菜幼苗相对电导率分别降低11.5%、12.8%、16.2%、15.1%，且差异达到显著水平，表明褪黑素预处理能够抑制低温胁迫下油菜幼苗相对电解质的渗漏。

2.3 外源褪黑素对低温胁迫下油菜幼苗叶绿素的影响

由图3可以看出，与对照(0 h)相比，单独的低温胁迫处理下油菜幼苗的叶绿素a、叶绿素b和总叶绿素含量均随处理时间的增长呈下降趋势；与单独的4℃处理相比，用褪黑素预处理后再进行低温处理(12、24、36、48 h)，其中叶绿素a分别增长5.2%、9.0%、18.7%、20.7%，叶绿素b分别增长4.6%、11.0%、15.5%、19.1%，总叶绿素分别增长5.0%、9.5%、17.6%、20.3%，表明外源褪黑素可以缓解低温胁迫下叶绿素的降解。

注：同一处理时间不同字母表示两种不同处理(4℃、4℃+MT)之间差异显著(P<0.05)，下同。 Note: Different letters at the same processing time indicate significant difference (P<0.05) between the two different treatments (4℃,4℃+MT)， the same below.图1 外源褪黑素对低温胁迫下油菜MDA含量的影响Fig.1 Effects of exogenous melatonin on MDA content in Brassica rapa under low temperature stress

2.4 外源褪黑素对低温胁迫下油菜幼苗活性氧(ROS)的影响

图2 外源褪黑素对低温胁迫下油菜相对电导率的影响Fig.2 Effects of exogenous melatonin on relative conductivity in Brassica rapa under low temperature stress

图3外源褪黑素对低温胁迫下油菜叶绿素含量的影响Fig.3 Effects of exogenous melatonin on chorophyll content in Brassica rapa under low temperature stress

A: NBT染色；B: DAB染色;C: NBT染色面积分数;D: DAB染色相对灰度 A: NBT staining;B: DAB staining;C: NBT staining area fraction;D: DAB staining relativegray图4 外源褪黑素对低温胁迫下油菜活性养(ROS)的影响Fig.4 Effects of exogenous melatonin on ROS in Brassica rapa under low temperature stress

2.5 外源褪黑素对低温胁迫下油菜幼苗抗氧化酶活性的影响

由图5可以看出，与对照相比，单独的低温胁迫处理不同的时间，油菜幼苗体内CAT、POD、SOD酶活性均呈先增加后降低的趋势；与单独的4℃胁迫处理相比，用褪黑素预处理后再进行不同时间的低温胁迫处理(12、24、36、48 h),CAT的活性分别增加28.5%、23.1%、7.6%、13.1%，POD的活性分别增加36.0%、25.3%、5.9%、18.7%,SOD的活性分别增加14.6%、18.6%、9.1%、13.6%，表明褪黑素预处理能够增强低温胁迫下油菜幼苗CAT、POD、SOD酶的活性。

2.6 外源褪黑素对低温胁迫下油菜MAPK3、MAPK4、MAPK6基因表达的影响

MAPK激酶级联途径在植物抵御非生物胁迫信号传导过程中发挥着重要的作用，拟南芥中AtMAPK3、AtMAPK4和AtMAPK6基因表达受到逆境胁迫的诱导。为了探讨MAP激酶级联途径是否参与油菜中褪黑素诱导的耐寒性过程，对油菜MAPK3、MAPK4、MAPK6在4℃、MT、4℃+MT处理24 h后的表达情况进行了分析，结果表明(图6)，与照相比，低温胁迫能够诱导MAPK3、MAPK4、MAPK6基因表达上调，且MAPK3、MAPK6基因达到显著水平，用褪黑素预处理后再进行低温胁迫处理，MAPK3、MAPK4、MAPK6基因表达均高于单独的低温胁迫，表明MAPK3、MAPK4、MAPK6基因均能响应低温胁迫，但MAPK3、MAPK6基因比MAPK4基因对低温胁迫更敏感，外源使用褪黑素能够诱导低温胁迫下MAPK3、MAPK4、MAPK6基因表达上调，且不同基因的响应程度存在差异。

图5 外源褪黑素对低温胁迫下油菜抗氧化酶活性的影响Fig.5 Effects of exogenous melatonin on antioxidant enzyme activity in Brassica rapa under low temperature stress

图6 外源褪黑素对低温胁迫下油菜MAPK3、MAPK4 和MAPK6基因表达的影响Fig.6 Effects of exogenous melatonin on the expression of MAPK3, MAPK4 and MAPK6 genes in Brassica rapa under low temperature stress

3 讨 论

植物在逆境条件下生长，会导致膜脂过氧化和细胞膜结构完整性的损伤[20]。低温胁迫下植物的防御机制包括生理反应、适应代谢和基因表达变化。有研究表明，白曼陀罗幼嫩花芽[21]和芦荟[22]在4℃低温胁迫下褪黑素含量增加，表明褪黑素可能参与植物对低温胁迫的调节。丙二醛(MDA)是一种最主要的膜脂过氧化反应生成物，其含量的变化能反映出环境对于植物损害程度的大小及植物应对外界环境刺激的剧烈程度，受低温胁迫的植物经常遭受膜损伤，因此可以通过电解质渗漏和MDA含量来反应植物受到的损害程度。潘红艳等[15]的研究表明用适当浓度外源褪黑素处理的菘蓝幼苗MDA含量显著降低，减轻了植株膜脂过氧化程度。Garcia等[23]的研究显示，褪黑素能够对细胞质膜的流动性起到稳定效果，同时保持磷脂和蛋白质功能的完整性，在一定程度上增强了细胞的抵御能力。同时也有研究表明外源褪黑素处理的黄瓜胚轴中膜脂过氧化水平显著降低[24]。此外，对甜瓜的研究表明外源褪黑素处理能提高低温胁迫下甜瓜幼苗叶片叶绿素含量，减缓光合速率的迅速下降[25]。本研究中，用褪黑素预处理后再进行4℃低温处理，油菜幼苗体内MDA含量、离子渗漏率的增加和叶绿素的含量均显著低于单独的低温胁迫处理，这些结果表明，适宜浓度的外源褪黑素可以缓解低温胁迫引起的细胞膜损伤和叶绿素的分解，增加油菜幼苗的抗寒性。

MAPK级联途径是将细胞外刺激信号在细胞内级联放大的重要信号传导途径，据报道其参与拟南芥、水稻和番茄等多种植物对生物和非生物胁迫的反应[31]。有研究表明AtMAPK6能被低温、干旱等多种非生物胁迫迅速激活[32]；H2S可以调节AtMPK4基因的表达，增加拟南芥对低温胁迫的耐受性，从而更好地适应环境[3]；外源H2O2也能够激活AtMPK3、AtMPK6基因的表达[33]，此外，褪黑素也能够上调低温应答基因COR15a、低温环境耐受转录因子CAMTA1以及抗氧化基因ZAT10/ZAT12的表达[34]，证实了褪黑素的保护作用可能与MAPK级联途径相关。本研究中低温胁迫下油菜幼苗MAPK3、MAPK4、MAPK6基因表达上调，且MAPK3、MAPK6基因达到显著水平，而用褪黑素预处理后再进行低温胁迫处理，MAPK3、MAPK4、MAPK6基因表达均高于单独的低温胁迫，但不同基因的上调程度存在差异，表明低温胁迫下，MAPK3、MAPK4、MAPK6基因均能响应低温胁迫，但MAPK3、MAPK6基因比MAPK4基因对低温胁迫更敏感；而使用褪黑素能够诱导低温胁迫下MAPK3、MAPK4、MAPK6基因表达上调，且不同基因对褪黑素诱导的响应程度存在差异，表明褪黑素缓解低温胁迫对油菜幼苗损伤的过程与MAP激酶级联信号途径有关，但是具体的调节机制还有待进一步研究。

4 结 论

本研究中，与单独的4℃低温胁迫处理相比，100 μmol·L-1外源褪黑素预处理后进行4℃低温胁迫处理，油菜幼苗MDA含量、相对电导率和ROS含量均显著低于单独的低温胁迫处理，叶绿素含量、过氧化氢酶(CAT)、过氧化物酶(POD)、超氧化物歧化酶(SOD)活性均增加，且MAPK3、MAPK4、MAPK6基因表达上调，表明使用100 μmol·L-1外源MT预处油菜幼苗，可以有效降低低温胁迫下MDA含量、电解质的渗漏和ROS积累，抑制叶绿素的降解，诱导MAPK3、MAPK4、MAPK6基因表达上调，进而增强油菜幼苗的抗寒性，缓解低温胁迫造成的氧化损伤。