外源渗透调节物质对黄芩幼苗抗旱能力的影响研究

李小玲,贺广祥,华智锐

(1.商洛学院 生物医药与食品工程学院,陕西 商洛 726000;2.陕西秦岭特色生物资源产业技术研究院有限公司,陕西 商洛 726000)

干旱是植物所面临的非生物逆境(干旱、盐碱、低温等)因素之一,其造成的损失最为严重。植物在受到干旱胁迫后,其细胞脂膜的正常结构会被破坏,细胞膜上的蛋白发生移位,最终会导致细胞膜渗透性增加、膜选择性丧失,从而导致细胞原生质失水,细胞器和细胞质中的酶活性大大降低,甚至完全变性[1]。在干旱逆境下,可溶性糖(蔗糖、葡萄糖)、脯氨酸和甜菜碱等有机渗透调节物质对调节植物组织的渗透性、维持细胞膨压、促进组织光合作用、清除植物体内活性氧自由基等有着重要作用,进而可以提高经济植物在逆境下的收获指数和产量。

黄芩(SctellariabaicalensisGeorigi)是属于唇形科(Lamiaceae)黄芩属(Scutellaria)的多年生草本药用植物,是我国常用的大宗中药材及秦岭五大商药之一[2],在我国主要分布于山东、山西、陕西、甘肃四大产区,具有较强的耐寒、耐旱特性且主要在旱地栽培。近年来,随着全球性的气候异常和生态平衡被破坏,黄芩的生物学和药学品质受到严重影响,制约了黄芩产业的可持续发展。目前,通过施加不同浓度的外源物质来增强植物抗逆性的化控措施已成为继生物学改良后提高植物抗性的又一条有效途径。

聚乙二醇(PEG-6000)是一种高分子渗透剂,是模拟生物干旱胁迫的常用材料之一[3,4],可将其配制成一定浓度梯度的水势溶液,模拟土壤的自然水势。糖类是植物光合作用的主要产物之一,在植物组织、器官中的主要作用是为物质代谢提供能量,为核酸、蛋白质和脂类的合成提供碳骨架,同时也是植物细胞主要的有机渗透调节物质[5]。在干旱胁迫条件下,植物的生理代谢发生紊乱,其细胞大量积累小分子有机渗透化合物,如可溶性糖(主要有葡萄糖、果糖、蔗糖)等,通过这些化合物来降低水势,从而维持较高的渗透压,保证细胞的生理功能正常。所以可溶性糖的含量是反映植物抗旱性的重要指标之一[6]。游离脯氨酸广泛存在于植物细胞内,是植物体内为数不多的渗透调节物质之一。脯氨酸代谢能在逆境胁迫下有效保护植物的生长发育过程。相关研究表明,脯氨酸具有调节渗透压、减少水分散失等生理生化作用。脯氨酸还能与变性的蛋白质结合,防止变性蛋白凝集。脯氨酸也是一种抗氧化剂,可清除细胞内部的活性氧(ROS)。甜菜碱于植物体内广泛存在,是一种永久性或半永久性渗透保护物质。杨丽娜等[7]的研究表明,在前期水分胁迫下,通过增加可溶性糖和脯氨酸含量,甜菜碱处理提高了树体的渗透调节能力。甜菜碱既能与酶和蛋白质生物大分子的亲水区结合,又能与其疏水区结合,这种独特的性质对其发挥渗透调节和保护功能具有重要意义[8]。

本文以商洛道地药材黄芩为研究材料,通过模拟干旱,探讨了几种渗透调节物质(葡萄糖、脯氨酸、甜菜碱)对商洛黄芩抗旱能力的影响,以期为探寻增强黄芩抗旱能力的栽培措施提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验所用黄芩幼苗购自洛南药材种植基地,为一年生幼苗。甜菜碱(GB)、脯氨酸(Pro)、葡萄糖(Glc)和PEG-6000购自西安晶博有限公司,含量≥99.5%,分析纯试剂AR级。

1.2 试验方法

1.2.1 材料预培养及处理 将黄芩幼苗移栽到塑料花盆(直径10 cm,高15 cm)中进行预培养,在缓苗期间定时浇水、松土，以保持土壤湿润，使幼苗恢复至正常生理状态。每盆培养3～5株,每个处理9盆。在1周后选取生长一致的幼苗用于试验。试验共设2个对照、15个处理,如表1所示。

表1 试验处理和对照设置

用不同浓度的GB、Pro、Glc和蒸馏水、20%PEG-6000隔天喷施相应处理的黄芩幼苗叶片,只喷施叶片正面,以防止粘稠的PEG将叶片表面覆盖,阻碍正常气体交换；参照汪月霞等[9]的方法用手持式喷雾器均匀喷施,至叶片湿润滴水时停止喷施；连续喷施1周；在1周后随机选取处理的植株进行生理指标的测定。每种药剂重复5次,每次重复9株苗。

1.2.2 指标的测定方法 采用称重法测定地上部和地下部重量,计算根冠比[10];叶绿素含量的测定参照张志良等[10]的丙酮-碳酸钙法;MDA含量的测定参照张志良等[10]的硫代巴比妥酸(TBA)检测法;脯氨酸含量的测定参照李合生等[11]的酸性茚三酮法;可溶性糖含量的测定参照李合生等[11]的苯酚法;POD活性的测定参照李合生等[11]的愈创木酚法;SOD 活性的测定参照李合生等[11]的氮蓝四唑法;CAT活性的测定参照高俊风等[12]的紫外吸收法;质膜透性的测定参照张以顺等[13]的相对电导率法。

1.3 数据统计分析

数据统计、作图采用Excel 2010软件进行,用SPSS statistics 22.0软件进行数据分析。各项生理指标的测定重复5次,求其平均值。

2 结果与分析

2.1 外源渗透调节物质对干旱胁迫下黄芩幼苗根冠比的影响

由图1可知：与CK1相比,CK2的黄芩幼苗的根冠比明显升高,增幅达到40%,差异达显著水平(P<0.05)；在干旱胁迫下，经不同浓度的外源渗透调节物质(GB、Pro和Glc)处理后,根冠比整体呈下降的趋势,均与CK2差异达到显著水平；随着处理浓度的升高,根冠比降低的趋势明显不同,在200 mg/L GB、Pro、Glc处理浓度下根冠比的降幅均达到最大,与CK2相比分别降低了34.3%、17.1%、25.7%,说明200 mg/L GB的处理效果最好,Glc次之。

在同一处理浓度下,标有不同字母的处理间在0.05水平上差异显著，下同。

2.2 外源渗透调节物质对干旱胁迫下黄芩幼苗叶绿素含量的影响

由图2可知：与CK1相比，CK2的叶绿素含量显著降低(P<0.05),说明干旱胁迫处理对黄芩叶片中的叶绿素含量有显著影响；经不同浓度的外源渗透调节物质(GB、Pro和Glc)处理后,叶绿素含量整体呈上升的趋势,均与CK2差异达到显著水平；在100、150 mg/L 3种外源物质处理浓度下,黄芩幼苗的叶绿素含量未出现显著性差异；在200 mg/L处理浓度下,外源甜菜碱与葡萄糖对黄芩幼苗叶绿素含量的影响效果相当,与外源脯氨酸的差异达到显著水平,这两种处理与CK2相比增幅达到最大,分别为70.6%和69.7%。

图2 外源渗透调节物质对干旱胁迫下黄芩幼苗叶绿素含量的影响

2.3 外源渗透调节物质对干旱胁迫下黄芩幼苗MDA含量的影响

由图3可知：CK2与CK1相比,黄芩幼苗的MDA含量明显升高,增幅达到18.3%,差异达显著水平(P<0.05)；经不同浓度的外源渗透调节物质(GB、Pro和Glc)处理后,MDA含量整体呈下降的趋势,均与CK2差异达到显著水平；随着处理浓度的升高,MDA含量降低的趋势先强后弱,在200 mg/L处理浓度下MDA含量的降幅均达到最大,与CK2相比分别降低了27.2%、20.3%、20.4%,以200 mg/L GB的处理效果最好。

图3 外源渗透调节物质对干旱胁迫下黄芩幼苗MDA含量的影响

2.4 外源渗透调节物质对干旱胁迫下黄芩幼苗可溶性糖含量的影响

由图4可知：CK2与CK1相比，可溶性糖的含量明显上升,说明干旱胁迫对黄芩叶片中的可溶性糖含量有显著影响；经不同浓度的外源渗透调节物质(GB和Glc)处理后,可溶性糖含量整体呈上升的趋势,除100 mg/L GB外其他处理均与CK2差异达到显著水平(P<0.05)；在喷施不同浓度的外源渗透调节物质Pro后可溶性糖含量呈先上升后下降的趋势,但也与CK2差异达到显著水平；在150 mg/L Pro处理下可溶性糖含量的增幅达到最大,为16.4%；在200 mg/L GB和Glc处理下可溶性糖含量的增幅均达到最大,分别为23.6%和43.00%。因此，200 mg/L Glc处理对可溶性糖含量的影响最大,效果最佳。

图4 外源渗透调节物质对干旱胁迫下黄芩幼苗可溶性糖含量的影响

2.5 外源渗透调节物质对干旱胁迫下黄芩幼苗SOD、POD和CAT活性的影响

由图5～图7可知：CK2与CK1相比，黄芩幼苗叶片中的SOD、POD、CAT活性均显著升高,说明干旱胁迫对黄芩叶片中的保护酶活性有显著影响。由图5可知：经不同浓度的外源渗透调节物质(GB、Pro和Glc)处理后,SOD活性整体呈先上升后下降的趋势,与CK2的差异均达到显著水平(P<0.05)；在干旱胁迫下，经200 mg/L 3种外源物质处理后SOD活性的增加趋势最为显著,增幅最大,分别比CK2增加了15.7%、10.2%、13.0%。由图6可知:除100 mg/L Pro处理外,在其他处理与CK2间POD活性的差异均达到了显著水平；在150 mg/L处理浓度下,外源GB和Glc对POD活性的影响差异不大；在200 mg/L处理浓度下,3种外源物质处理与CK2比较，POD活性的增加趋势最为显著,增幅最大,分别为18.0%、14.7%、20.0%。由图7可知:CK2与CK1相比,黄芩幼苗叶片中的CAT活性显著升高；外源物质GB和Pro在100 mg/L处理浓度下对黄芩幼苗CAT活性的影响效果相当,与CK2的差异均达到了显著水平；在150 mg/L处理浓度下Pro和Glc对黄芩幼苗CAT活性的影响效果相当,与CK2的差异均达到了显著水平；在200 mg/L处理浓度下GB和Glc对黄芩幼苗CAT活性的影响效果相当,与CK2的差异均达到了显著水平。总体上,在喷施不同浓度的外源渗透调节物质(GB、Pro和Glc)后,黄芩幼苗叶片中的CAT活性整体上呈先上升后下降的趋势,除100 mg/L Glc处理外与CK2的差异均达到了显著水平。在200 mg/L处理浓度下,3种外源物质处理与CK2比较,CAT活性的增加趋势最为显著,增幅最大,分别为20.8%、11.8%、19.6%。总之,3种外源物质都能显著增加干旱胁迫环境下黄芩幼苗叶片中保护酶SOD、POD、CAT的活性，且以施加200 mg/L的效果最佳。

图5 外源渗透调节物质对干旱胁迫下黄芩幼苗SOD活性的影响

图6 外源渗透调节物质对干旱胁迫下黄芩幼苗POD活性的影响

图7 外源渗透调节物质对干旱胁迫下黄芩幼苗CAT活性的影响

2.6 外源渗透调节物质对干旱胁迫下黄芩幼苗脯氨酸含量的影响

由图8可知：CK2与CK1相比,干旱胁迫后黄芩叶片中的脯氨酸含量显著增加；经不同浓度的外源渗透调节物质(GB、Pro和Glc)处理后,脯氨酸含量整体呈上升的趋势,均与CK2差异达到显著水平(P<0.05)；在100、150 mg/L处理浓度下,3种外源物质对黄芩幼苗叶片脯氨酸含量的影响效果相当,与CK2的差异均达到了显著水平；在200 mg/L处理浓度下,GB与Pro、Glc对黄芩幼苗叶片脯氨酸含量的影响效果相当,但在Pro和Glc处理间差异达到了显著水平。在5个处理浓度中，以200 mg/L GB和Pro促进脯氨酸含量增加的效果最为显著,分别比CK2增加了13.8%、17.4%；在3种外源调节物质中，以Pro的处理效果最佳,GB次之。

图8 外源渗透调节物质对干旱胁迫下黄芩幼苗脯氨酸含量的影响

2.7 外源渗透调节物质对干旱胁迫下黄芩幼苗相对电导率的影响

由图9可知：CK2与CK1相比，黄芩幼苗叶片的相对电导率显著升高,差异达到了显著水平(P<0.05)，说明干旱胁迫已造成黄芩叶片膜结构破坏或功能受损,膜透性增大，从而导致细胞内水溶性物质外渗；经不同浓度的外源渗透调节物质(GB、Pro和Glc)处理后,相对电导率整体呈下降的趋势,与CK2的差异均达到显著水平；在100 mg/L处理浓度下,GB和Glc对黄芩幼苗叶片相对电导率的影响效果相当,但均比Pro差；在150和200 mg/L处理浓度下,3种外源物质对黄芩幼苗叶片的相对电导率均有显著的影响,以200 mg/L GB处理的效果最为显著,与CK2相比的相对电导率降幅高达35.3%,而Glc次之,降幅高达20.8%。

图9 外源渗透调节物质对干旱胁迫下黄芩幼苗相对电导率的影响

3 讨论

植物在感知干旱逆境胁迫时会启动相应的防御机制,比如通过信号转导及相关基因的表达引发渗透调节和激素调节等代谢途径的变化[14]。在干旱逆境下,植株内的渗透调节物质会大量积累,通过降低渗透势来平衡水势的降低。积累的渗透调节物质主要包括脯氨酸、可溶性糖(葡萄糖、果糖、蔗糖等)和甜菜碱等有机小分子化合物。可溶性糖、脯氨酸和甜菜碱等物质能够减小植物细胞水势和稳定膨压,保持细胞健康生长以及清除自由基，缓解细胞衰老，还能通过提高光合速率、维持气孔导性、促进光能捕获等来提高植物在干旱胁迫逆境下的光合作用。根冠比可以反映植物在遭受逆境胁迫后地上、地下部分生长平衡的变化。本研究发现：在干旱胁迫下,随着添加外源物质浓度的增加,各处理黄芩幼苗的根冠比降低；在同一处理浓度下,与CK2相比，以甜菜碱处理的根冠比降低幅度最大,葡萄糖的作用效果次之;随着外源物质处理浓度的增加,根冠比呈降低的趋势,以200 mg/L甜菜碱处理的根冠比最小。由此表明,施用适量的外源物质可以降低黄芩幼苗的根冠比,改善幼苗地上部分的生长，以200 mg/L甜菜碱的处理效果最佳。

叶绿素是与光合作用息息相关的一种色素。赵博生等[15]的研究结果表明,施用外源甜菜碱有利于作物对光能的捕获和转换,明显促进作物的生长,降低干旱、盐胁迫对作物的抑制作用。本试验的结果与前人的研究结果一致,在遭受干旱胁迫后,黄芩幼苗叶片中的叶绿素含量显著下降；但不同浓度的甜菜碱处理均可提高黄芩幼苗叶片中的叶绿素含量,以200 mg/L处理的效果最佳。钱永生等[16]的研究表明,渗透调节物质脯氨酸不仅可以参与叶绿素的合成,而且对蛋白质起保护作用。本研究证实外源物质脯氨酸可以在干旱环境下促进黄芩幼苗叶片中叶绿素的合成。

MDA是细胞膜脂过氧化作用的主要产物之一,能真实反映植物在遭受逆境胁迫后细胞内有害物质的积累程度[17]。在本试验中,黄芩幼苗遭受干旱逆境时,MDA含量显著升高,但在施加不同浓度的外源物质后MDA含量显著降低,随着处理浓度变大,MDA含量降低越明显,以200 mg/L GB的效果最明显,这与前人的研究结果[18]一致。说明叶面喷施适量的GB能显著缓解脱水过程中产生的氧自由基对质膜的伤害。

可溶性糖是植物的主要有机渗透调节剂之一,也是作物碳架和能量的主要来源,在稳定细胞膜和原生质胶体方面发挥着重要的作用[19]。在水分胁迫期间,糖的积累能降低植物渗透压,从而起到保水作用,因此糖也是植物适应机制中的重要信号物质[20]。在本试验中,黄芩幼苗在遭受干旱逆境时,可溶性糖含量显著升高,从而降低渗透压,对黄芩幼苗进行保水。加入200 mg/L的外源物质对可溶性糖含量的影响最为显著，以200 mg/L葡萄糖的效果最为明显,甜菜碱次之。

干旱胁迫导致植物体内产生大量的ROS,启动膜脂过氧化反应,进而引起细胞膜受损,而脂膜损伤又是导致植物衰老和组织伤害的重要原因。植物能通过酶保护系统(SOD、POD和CAT等)和非酶促防御系统清除活性氧自由基,保护植物细胞膜免受伤害,从而保证其生理过程的正常进行[21]。张立新等采用盆栽试验研究表明,在水分胁迫条件下,添加甜菜碱处理能提高夏玉米的SOD、POD和CAT活性,降低MDA含量,缓解膜脂过氧化伤害[22]。本试验也得到了相同的结果,在干旱胁迫下抗氧化酶(SOD、POD和CAT)活性提高,以此对黄芩幼苗进行保护。外源渗透调节物质处理提高了黄芩幼苗的抗氧化酶(SOD、POD和CAT)活性,缓解了活性氧自由基的膜脂过氧化伤害。以200 mg/L甜菜碱处理的综合效果最佳,葡萄糖次之,可能与糖参与适应机制的重要信号通路有关。

脯氨酸常以游离状态广泛存在于植物体内,是植物蛋白的组分之一,其含量的增加是植物遭受干旱胁迫的敏感征兆之一,它通过参与植物渗透调节作用对蛋白质具有一定的保护作用[23]。本试验发现：在干旱胁迫下，黄芩幼苗体内脯氨酸含量显著升高；经外源渗透调节物质处理后,黄芩幼苗体内脯氨酸含量增加,以200 mg/L脯氨酸的作用效果最佳,甜菜碱和葡萄糖次之。

干旱胁迫会破坏植物组织的膜脂结构和功能,导致膜脂通透性增大,细胞内各种水溶性物质出现不同程度的外渗,外渗物越多则电导率越大,所以通过电导仪测定外渗电导率就能得知膜受伤害的程度[24]。本研究发现：干旱胁迫处理后黄芩幼苗叶片的相对电导率显著升高,说明膜透性增大；加入外源渗透调节物质后叶片的相对电导率明显降低,以200 mg/L GB处理的效果最为显著。这一结果与邱念伟等[18]对烟草的研究结果一致。随着喷施甜菜碱浓度的升高,叶片相对电导率下降,说明叶面喷施甜菜碱能显著增加细胞膜的稳定性。葡萄糖的作用效果次之。

综上所述,在遭受干旱胁迫后黄芩幼苗的各种生理指标发生了显著变化(P<0.05)；3种外源渗透调节物质(GB、Pro和Glc)处理均可提高干旱胁迫环境下黄芩幼苗叶片的叶绿素含量、可溶性糖含量、保护酶(SOD、POD、CAT)活性和脯氨酸含量,降低根冠比、MDA含量和相对电导率；以200 mg/L的效果最佳；在200 mg/L处理浓度下，综合效果以GB最佳,Glc次之。