大刺鳅人工繁殖与胚胎发育研究

方 园，吴 真，曾庆祥*，刘 斌，钟颖良，王海华，彭进榕，黄雅贞，郭 婧

(1.赣州市水产研究所，江西 赣州 341100；2.江西省水产科学研究所，江西 南昌 330039；3.广州市河盛汇农业科技有限责任公司，广东 广州 511300)

大刺鳅(Mastacembelusarmatus)属于鲈形目(Perciformes)、刺鳅科(Mastacembelidae)、刺鳅属(Mastacembelus)鱼类[1]，主要分布在长江流域以及南方水系中[2]。大刺鳅的肌肉蛋白含量高、氨基酸种类丰富，既有较好的美食口感，也有较高的营养价值[3]。由于大刺鳅野生资源稀少、人工养殖量小，目前，其市场价格高达200元/kg。特别是近年来，部分地区由于过度非法捕捞以及水域生态环境的恶化，我国野生大刺鳅的资源量呈现日益减少的趋势，因此，发展大刺鳅人工增养殖势在必行。

目前，国内针对大刺鳅人工繁殖和胚胎发育特征观察的研究只有少量报道[4-7]。本课题组近年来已经在大刺鳅池塘养殖、生物学特性、人工繁殖、仿生态养殖技术、常见病防治技术等方面开展了相关的试验研究[8-12]，但在人工繁殖和胚胎发育方面尚未进行系统的研究，为进一步了解大刺鳅繁殖特征，突破大刺鳅规模化高效繁殖技术，掌握大刺鳅胚胎发育情况。笔者于2020年进行了3批次大刺鳅人工繁殖试验，并观察其胚胎发育特征。

1 材料与方法

1.1 繁殖前期准备

1.1.1 亲本鱼的培育与选择 开春后，水温稳定在18 ℃以上时，开始投喂全价配合饲料，选择正规厂家生产的大刺鳅专用饲料，其粗蛋白含量47%以上，并在饲料中适量添加维生素E。随着水温的升高，逐步增加饲料投喂量，直至每天投喂量稳定在大刺鳅体重的6%左右。在人工繁殖前2周，适当减少配合饲料投喂量，以减少雌鱼体内脂肪积累，保证卵子质量。

选用池塘养殖的3冬龄以上大刺鳅作亲本，要求雌鱼体重150 g以上、雄鱼体重200 g以上。根据曾庆祥等[13]挑选方法，选择腹部黄白色、膨大柔软圆润、生殖孔凸起红润、个体略显粗短的雌性大刺鳅作母本，腹部皮肤灰黑、没有明显膨大、游动较激烈、个体粗长的雄性大刺鳅作为父本。雌雄比为5∶1。

将挑选好的大刺鳅亲鱼暂养在面积约20 m2且已经消毒好的水泥池中，消毒药物选择聚维酮碘溶液，按0.25 g/m3(有效碘10%)的剂量全池泼洒，暂养池要求池底及池壁光滑，最好贴有瓷砖，保持水深50 cm，进(排)水方便，进水管与池边呈45°～60°夹角，使水流呈喷射状冲击水面，确保池水呈现循环流动状态，同时开启增氧机，保证池内水体中有充足的溶解氧。

1.1.2 孵化池准备 孵化池的构造与亲本暂养池基本一致，先用水冲洗去除池中杂物后，使水位保持在50 cm，用10 g/m3高锰酸钾溶液对孵化池浸泡消毒，30 min后将水排干；用清水冲洗完后将水位保持在40 cm，开启增氧机，保证水体溶氧充足。开启加热棒，将加热棒温度设置为28 ℃，在池底放置温度计，便于观测和记录水温。

1.2 人工催产与授精

1.2.1 人工催产 采用背部肌肉注射法，分2次注射。催产药物及剂量为：1000 IU/kg绒毛膜促性腺激素(HCG)、10 μg/kg促黄体素释放激素A2(LRH-A2)和5 mg/kg地欧酮(DOM)，将3种催产素放入烧杯中混合均匀后待用。雌鱼第1次按1 mL/kg体重的量注射，约12 h后注射第2次，第2次注射量减半，注射后将水温加温至29～30 ℃。雄鱼不注射催产素。

1.2.2 人工授精 采用湿法授精，具体步骤：使用适量鱼安定将大刺鳅亲鱼麻醉，用毛巾将雌性亲鱼鱼体上的水分擦拭后挤卵，从腹部前端往生殖孔方向将卵子挤于消毒好的不锈钢盆中。雄性亲鱼挤精方法类似，再利用注射器吸取挤出的精子，注入装有生理盐水的不锈钢盆中，混匀后倒入放有卵子的不锈钢盆中，并用另一个不锈钢盆反复倾倒以充分混匀，完成授精，最后将受精卵均匀倒入准备好的孵化器、孵化池中进行孵化。孵化过程中水温保持在28～29 ℃之间，孵化池水体的溶解氧应始终保持在5 mg/L以上，池水pH值在7.2～7.8之间。

1.3 胚胎发育观察

人工授精后，立即取少量受精卵均匀地铺于培养皿中，在Olympus显微镜下观察，并用数码摄像系统拍照，详细记录各时期的发育特征和时间，以50%以上胚胎达到某期确定为该发育过程的起始时间，从前一个发育阶段到下一个发育阶段之间的时间间隔为该阶段的发育期间，并通过随机观察记录3个培养皿进行重复观察验证。

在卵裂期时，每15 min观察1次胚胎发育情况，进入囊胚期后每30 min观察1次胚胎发育情况。

1.4 数据处理

(1)胚胎发育各阶段的积温(℃·h)=此阶段胚胎发育时间(h)×水温(℃)[14]。

(2)催产率(%)=注射催产素后成功挤出卵子的样本数/总样本数×100%。

(3)胚胎发育到原肠中期时统计受精卵数和总样本卵数，受精率(%)=受精卵数/样本卵数×100%。

(4)孵化率(%)=出苗数/样本受精卵数×100%。

(5)游标卡尺进行测量卵径大小、仔鱼全长。

2 结果与分析

2.1 人工繁殖情况

分别于5月28日、5月30日、6月1日对大刺鳅进行人工催产繁殖，具体情况见表1。挑选的大刺鳅雌鱼体长(32.3±0.05)cm，雄鱼体长(44.1±0.05)cm。催产后约10 h，池底有卵子出现后，开始进行人工挤卵。挤出的大刺鳅卵子大部分为成熟卵，呈橙黄色，有少许白色，卵径(1.94±0.05)mm，沉性卵，具黏性(图1-a)。3次人工催产获得的卵重平均约200粒/g，雌性亲本平均怀卵量约3036粒/尾，催产率平均为99.20%，受精率平均为82.77%，孵化率平均为77.20%。

表1 人工催产情况

2.2 胚胎发育过程

在28～29 ℃水温条件下，大刺鳅胚胎发育过程从受精卵到孵出仔鱼历时约50.5 h，主要经过受精卵、胚胎隆起、卵裂期(2细胞、4细胞、8细胞、16细胞、多细胞期、桑葚期)、囊胚期(囊胚早期、囊胚中期、囊胚晚期)、原肠胚期(原肠早期、原肠中期、原肠晚期)、神经胚期(神经胚期、胚孔封闭期)、器官形成期(肌节出现期、视泡期、尾芽期、肌肉效应期、心跳期)、出膜期等8个阶段共22个时期。根据胚胎发育各阶段的发育时间与水温关系，得到整个胚胎发育过程总积温约1454.4 ℃·h。各发育时期主要特征见表2。

表2 大刺鳅的胚胎发育

2.2.1 受精卵 大刺鳅的成熟卵子受精后吸水膨胀，卵径(2.15±0.05)mm。大约10 min后，形成受精卵，受精卵呈卵圆形，色泽为金黄色或者橘黄色，极性不明显，在受精卵内部出现多个大小不等的油球(图1-b)，油球数随着受精卵的发育而逐渐减少，最后形成少量且较大的油球。

2.2.2 胚胎隆起 受精大约0.6 h后，胚胎中细胞质向动物极方向集中，并向上隆起，形成帽状的胚盘(图1-c)。

2.2.3 卵裂期 大刺鳅受精卵卵裂只分布在动物极部分，是典型的不完全卵裂方式。受精后1.2 h，受精卵开始分裂，形成2个大小相等形状相近的细胞球(图1-d)。受精1.8 h后，出现第2次分裂，该分裂与第1次分裂方向垂直，形成4个大小相近的细胞球，该时期为4细胞期(图1-e)。受精后3 h，胚胎开始第3次分裂，形成体积较小的8个分裂球(图1-f)。受精后3.4 h，胚盘开始第4分裂，形成16个小分裂球，该时期为16细胞期(图1-g)。受精后4.6 h，胚盘分列出多个分裂球，为多细胞期(图1-h)。受精后7.0 h，胚盘继续分裂成桑葚状，为桑葚期(图1-i)。

2.2.4 囊胚期 受精后8.2 h，由于胚盘持续分裂，许多个分裂细胞紧密粘接，显微镜下难以看出细胞间隙，形成囊胚状突起结构，此时为囊胚早期(图1-j)。受精后8.7 h，囊状突起高度降低，呈下包趋势覆盖在卵黄表面，此时为囊胚中期(图1-k)。受精后9.6 h，囊状突起呈明显下包状态，囊胚层变扁平，即囊胚晚期(图1-l)。

2.2.5 原肠胚期 受精后13.2 h，囊胚层继续下包至1/2处，胚层边缘细胞集中形成胚环结构，此时为原肠胚早期(图1-m)。受精后16.4 h，下包至2/3处，胚盾出现，进入原肠胚中期(图1-n)。受精后21.8 h，下包至3/4，胚盾延长，形成胚孔结构，此时为原肠晚期(图1-o)。

2.2.6 神经胚期 受精后25.5 h，胚盘继续下包至4/5，未包被的卵黄形成栓状结构，即卵黄栓。胚盾继续延长，形成神经板。此时为神经胚期(图1-p)。受精后29.8 h，进入胚孔封闭期(图1-q)。

2.2.7 器官形成期 受精后32.5 h，胚体中部出现肌节，此时为肌节出现期(图1-r)。受精后33.8 h，进入视泡期，这时胚体中出现椭圆形黑点(图1-s)。受精后35.6 h，尾节呈芽状出现，此时为尾芽期(图1-t)。受精后37.7 h，配体出现颤动，此时为肌肉效应期(图1-u)。受精后40.9 h，胚体中出现明显的类似管状心脏，微弱颤动，即进入心跳期(图1-v)。

2.2.8 出膜期 受精后50.5 h，胚体变长，形成椭圆形，尾巴破膜伸出。刚出膜的仔鱼肉眼看除2个黑色眼囊外全身透明，仔鱼全长平均(6.52±0.05)mm，卵黄囊宽(1.38±0.05)mm、长(2.72±0.05)mm。显微镜下仔鱼嘴巴会进行缓慢咬合，心跳有规律，全身红色血管流动清晰(图1-w)。

a.成熟卵子；b.受精卵；c.胚胎隆起；d.2细胞期；e.4细胞期；f.8细胞期；g.16细胞期；h.多细胞期；i.桑葚期；j.囊胚早期；k.囊胚中期；l.囊胚晚期；m.原肠早期；n.原肠中期；o.原肠晚期；p.神经胚期；q.胚孔封闭期；r.肌节出现期；s.视泡期；t.尾芽期；u.肌肉效应期；v.心跳期；w.出膜期

3 讨论

3.1 大刺鳅的人工繁殖

对于鱼类催产激素的使用，目前广泛使用的有HCG、LRH-A2、DOM、PG等激素。在激素使用比较研究中发现，鱼类对HCG、LRH-A2、DOM这3种激素的混合使用敏感度最高，催产率和孵化率都显著优于单一激素或其他组合。针对大刺鳅人工繁殖技术，目前的研究也发现混合使用HCG、LRH-A2、DOM这3种催产激素的催产效果最好[15]。同样，本研究尝试通过2次注射HCG、LRH-A2和DOM混合物，观察大刺鳅的产卵效率，结果显示：催产效率明显上升，催产后约10 h后即可挤出较为成熟的卵子，产卵量约3036粒/尾，表明通过2次激素刺激能提升大刺鳅的产卵效率。

另外，为初步探索大刺鳅催产的最高温度，笔者将大刺鳅在29～30 ℃的催产温度下进行试验，发现大刺鳅亦能有效催产。有研究发现，大刺鳅繁殖时间主要是在春夏季节的4～7月[16]，但是在8月底、9月初的水温较高时，大刺鳅仍会高效产卵[17]。这说明相对于四大家鱼，大刺鳅亲本的产卵温度范围较广，具备适当抵抗环境恶化的能力。

催产出的大刺鳅成熟卵子呈橙黄色、易沉底，具有弱黏性，但随时间的推移，其黏性会降低。大刺鳅卵径(1.94±0.05)mm，这与薛凌展[7]和李晓双[6]等的研究结果基本一致。卵重平均200粒/g，雌性亲本平均怀卵量约3036粒/尾，这与刘霆[18]和周惠强[19]等调查的大刺鳅怀卵量相近。

3.2 大刺鳅的胚胎发育

本研究通过在28～29 ℃水温条件下，培养观察大刺鳅胚胎发育情况，将大刺鳅胚胎发育过程区分为受精卵、胚胎隆起、卵裂期、囊胚期、原肠胚期、神经胚期、器官形成期、出膜期等8个阶段22个时期，符合“卵裂-胚体形成-器官分化-孵化出膜”的发育顺序。

水温是鱼类胚胎发育时间的重要影响因子[20]，并且在适当的温度范围，孵化效率与温度呈正相关[21-22]。薛凌展[7]研究提出：在(25±1)℃的孵化条件下，大刺鳅受精卵历时65 h孵化出膜，而本试验中大刺鳅的胚胎在28～29 ℃水温下发育时间约52 h，减少了约13 h，这为大刺鳅规模化苗种繁殖节约了时间，提高了孵化效率，且孵化率达77.20%，说明大刺鳅胚胎发育在28～29 ℃温度下的孵化效率较高，28～29 ℃是大刺鳅胚胎发育的适宜温度。另外，笔者发现大刺鳅胚胎发育总积温约1454.4 ℃·h，该结果略低于薛凌展[7]的研究(1624.5±58.12)℃·h，这可能与孵化温度的升高有关。本研究详细记录了28～29 ℃环境下大刺鳅胚胎发育各阶段的主要特征及发育时间，为今后深入开展大刺鳅的生物学、胚胎学等研究提供了重要的参考资料。另外，本研究提出的大刺鳅人工繁殖技术，可在生产上指导大刺鳅规模化高效繁殖，加快大刺鳅产业发展的进程，增加渔民的养殖收入，促进特色高效水产养殖业的发展。