紫茉莉耐盐突变体筛选的初步研究

陆玉建

(1.滨州学院 生物与环境工程学院,山东 滨州 256603;2.山东省黄河三角洲野生植物资源开发利用工程技术研究中心,山东 滨州 256603;3.山东省黄河三角洲生态脆弱带工程技术研究中心,山东 滨州 256603)

紫茉莉(MirabilisjalapaL.)为紫茉莉科、紫茉莉属多年生草本植物[1]。紫茉莉具有较高的观赏价值,可以美化环境,同时也是一种药用植物,具有杀虫、抑菌、抗病毒等功效[2,3]。紫茉莉生长迅速、生物量大,根系发达,可通过根系分泌物与土壤微生物相互作用,在污染土壤的生物修复中显示出巨大的潜力[4]。土壤重金属污染对人类健康构成了巨大的威胁,植物修复是解决此类问题的重要途径。紫茉莉对重金属镉具有较强的耐受性,甚至在碱性土壤中仍具有强大的镉积累能力[5,6]。通过螯合和施肥等措施,可以强化紫茉莉对镉污染土壤的修复效率[7]。紫茉莉通过根系有机物含量的变化,可以将吸收的铅积累在根部,从而有效地保护植物的地上部分,因此紫茉莉具有极强的铅耐性[8]。由此可见,紫茉莉是一种较为理想的修复重金属污染土壤的植物。石油污染会导致土壤中真菌的多样性明显降低；紫茉莉耐受污染的能力强,可以较好地维持真菌的丰度[9]。紫茉莉能够稳定维持土壤中的微生物群落结构,种植紫茉莉可使石油污染土壤的根际微生物多样性增加[10]。上述研究结果表明,紫茉莉可通过与微生物联合作用,进一步提高石油污染土壤的修复效果。虽然紫茉莉可用于修复重金属和有机污染物污染的土壤,但其修复效果仍难满足实际需求,而诱变技术无疑是提高紫茉莉生物修复能力的有效途径。甲基磺酸乙酯(Ethyl methyl sulfonate, EMS)是一种活性很强的化学诱变剂,已在植物诱变育种中被广泛应用[11]。EMS可作用于植物各种组织和器官,通过DNA复制过程中碱基交换而形成点突变[12]。化学诱变和离体培养技术相结合是突变体筛选较常用的一种方法,具有不受环境条件限制、节省大量人工和时间、扩大变异谱和提高变异率等优点[13,14]。目前国内外关于紫茉莉的研究主要集中在生物修复方面,而通过体细胞无性系变异途径选育突变体则未见相关报道。本研究以紫茉莉为材料,通过将离体再生和EMS诱变技术相结合,初步筛选出了性状优良的耐盐突变体。

1 材料与方法

1.1 实验材料

在温室种植紫茉莉2个月后,选取带节茎段作为实验材料。

1.2 实验方法

1.2.1 培养基的配制 紫茉莉不定芽诱导培养基:以MS为基本培养基,分别添加2,4-D(0.1、0.5 mg/L)、NAA(0.5、1.0 mg/L)、6-BA(1.0、2.0 mg/L)、KT(1.0、2.0 mg/L)、TDZ(0.05、0.1 mg/L)。生根培养基:以MS或1/2MS为基本培养基,添加NAA(0、0.3、0.5、1.0 mg/L)。所有培养基均添加3.0%蔗糖和1.0%琼脂。

1.2.2 紫茉莉的离体再生 取紫茉莉的带节茎段,剪去叶片,先用自来水反复冲洗,再用蒸馏水冲洗1～2次,然后用70%酒精处理30 s,用0.1% HgCl2消毒10 min,最后用无菌水冲洗5次,将茎段切割后插入MS培养基中培养30 d。将茎段上抽出的芽切下,转入MS培养基中继续培养30 d。以无菌幼苗为材料,取带节茎段作为外植体,转接到不定芽诱导培养基。将不定芽接入MS+2.0 mg/L 6-BA培养基进行增殖培养。切取不定芽,接入MS培养基进行壮苗培养,最后转入生根培养基进行生根诱导。

1.2.3 盐胁迫对紫茉莉不定芽生长的影响 选取紫茉莉的不定芽,分别转接到含不同浓度(0、50、100、150、175、200、250、300 mmol/L)NaCl的生根培养基中进行垂直培养。在培养30 d后观察不定芽的生根情况,确定紫茉莉耐盐突变体筛选时NaCl的临界浓度。

1.2.4 紫茉莉不定芽的EMS诱变 将紫茉莉的不定芽浸泡在含不同浓度(0.0%、0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%)EMS的磷酸缓冲液中,处理时间分别为3、4、5、6、7、8 h。在处理完毕后,用无菌水反复冲洗不定芽,将其转接入不定芽增殖培养基,在培养30 d后观察不定芽的生长情况。当紫茉莉的不定芽无生长或者叶片变黄或干枯时,说明不定芽受到了严重抑制,均按致死处理。根据统计的致死的不定芽数,计算不定芽致死率,获得比较适合不定芽EMS诱变的半致死剂量。紫茉莉不定芽致死率=(不定芽致死数/总芽数)×100%。

1.2.5 紫茉莉耐盐突变体的筛选 用合适剂量的EMS诱变紫茉莉的不定芽,然后接种到增殖培养基进行培养。在培养30 d后切取不定芽，将其接种到含适当浓度NaCl的生根培养基中进行生根诱导。切割生根的不定芽,在含盐或不含盐的培养基中反复培养,进而获得耐盐能力较强的紫茉莉突变体。

2 结果与分析

2.1 植物生长物质对紫茉莉不定芽诱导的影响

为了获得紫茉莉不定芽诱导的最适培养基,分别对接种到不定芽诱导培养基中茎段不定芽的分化情况进行观察分析。实验结果显示,在通过正交实验设计的不定芽诱导培养基中,茎段均可产生不定芽,但不定芽产生的数量和速度存在明显的差异。根据形态观察和不定芽数量统计的结果,在MS+1.0 mg/L KT+0.05 mg/L TDZ+0.5 mg/L NAA培养基中,紫茉莉不定芽诱导的效果较好，并且获得的不定芽在MS+2.0 mg/L 6-BA培养基中增殖迅速。

2.2 植物生长物质对紫茉莉不定芽生根的影响

通过对不定芽生根情况进行统计分析可以发现,紫茉莉比较容易生根,在所设计的生根培养基中,不定芽均可生根,但效果存在一定的差异。其中添加0.3 mg/L NAA的MS培养基更适于不定芽的生根,在此培养基中,不定芽生根效果明显,根数量较多,并且比较粗壮。

2.3 紫茉莉离体再生体系的建立

将紫茉莉茎段接种入MS中培养30 d,可观察到在茎段的叶腋部位有明显的芽抽出。将产生的芽接种到MS培养基中继续培养30 d,芽生长旺盛,获得无菌苗(图1A)。切取茎段,将其接种到MS+1.0 mg/L KT+0.05 mg/L TDZ+0.5 mg/L NAA培养基进行不定芽诱导,30 d后茎段上产生了明显的不定芽(图1B)。将不定芽转入MS+2.0 mg/L 6-BA培养基中增殖培养30 d,不定芽数量快速增加,成簇分布(图1C)。切割不定芽,将其接种入MS+2.0 mg/L 6-BA培养基中进行连续继代培养,不定芽继续增多增大(图1D～图1E)。选取不定芽,将其接入MS培养基进行壮苗培养30 d,不定芽生长迅速(图1F)。将壮苗培养后的不定芽接种入MS+0.3 mg/L NAA培养基中进行生根诱导,30 d后在不定芽基部产生了大量的根(图1G)。将再生植株进行栽培,在适宜条件下,紫茉莉生长十分旺盛(图1H)。

A：培养30 d的茎段; B：分化培养30 d的茎段; C：增殖培养30 d的不定芽; D：继代培养2周的不定芽; E：连续继代培养的不定芽; F：不定芽的壮苗培养; G：生根诱导30 d后的再生植株; H：移栽后生长的紫茉莉。

2.4 盐胁迫对紫茉莉不定芽生长的影响

将紫茉莉的不定芽接种到含盐的生根培养基中进行垂直培养,30 d后观察各培养基中不定芽的生根情况。实验结果表明：对照组的不定芽生长旺盛,产生的根较多(图2A)；当NaCl浓度为50～100 mmol/L时,不定芽的生长情况和对照类似(图2B～图2C)；当NaCl浓度达到150 mmol/L时,不定芽的生长受到了一定的抑制,只有部分不定芽可以生根,并且根的数量有所减少(图2D)；当NaCl浓度为175 mmol/L时,不定芽的生长受到了明显的抑制,大多数不定芽难以生根(图2E)；当NaCl浓度为200 mmol/L时,不定芽的生长受到了严重抑制,基部开始褐化,没有根产生(图2F)；当NaCl浓度为250 mmol/L时,部分不定芽已经枯萎,基部褐化严重,无根产生(图2G)；当NaCl浓度为300 mmol/L时,不定芽逐渐枯萎,基部褐化腐烂(图2H)。因此，含175～200 mmol/L NaCl的培养基可以用来进行紫茉莉耐盐突变体的筛选。

2.5 紫茉莉不定芽的EMS诱变

将紫茉莉的不定芽利用不同剂量的EMS进行处理,结果如图3A所示。当EMS诱变3 h时,对照组的不定芽生长正常;经0.2%～1.0% EMS处理的不定芽的生长情况与对照组相似。当EMS诱变4 h时,经0.2%～0.8% EMS处理的不定芽的生长情况与对照组无明显差异;而经1.0% EMS处理的不定芽的生长受到了一定的抑制,致死率接近7%。当EMS诱变5 h时,经0.6% EMS处理的不定芽的致死率大约为17%;经0.8% EMS处理的不定芽的生长明显被抑制,致死率大约为40%;而经1.0% EMS处理的不定芽的生长受到了严重抑制,部分不定芽干枯,致死率接近100%；当EMS诱变6 h时,经0.8% EMS处理的不定芽的致死率大约为50%；当EMS诱变7 h时,经0.6% EMS处理的不定芽的致死率大约为55%,同样接近半数致死率(图3B)；当EMS诱变处理8 h时,不定芽受到的抑制作用明显增强,其中0.6% EMS处理的不定芽的致死率超过了60%；0.8% EMS处理的不定芽的致死率提高到75%;1.0% EMS处理的大部分不定芽褐化干枯,致死率达到了100%。紫茉莉不定芽致死率的统计结果表明,EMS诱变不定芽的合适剂量为0.8%(处理6 h)或0.6%(处理7 h)。

A～H：紫茉莉不定芽分别在含0、50、100、150、175、200、250、300 mmol/L NaCl的培养基中诱导生根的情况。

A：紫茉莉不定芽经EMS处理后致死率的统计结果；EMS处理时间分别为3、4、5、6、7、8 h;EMS处理浓度分别为0.0%、0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%。B：EMS处理7 h时不定芽的生长情况；EMS浓度分别为0.0%、0.2%、0.4%、0.6%、0.8%。

2.6 紫茉莉耐盐突变体的筛选

将0.8% EMS处理6 h后的不定芽进行增殖培养,接着转入含175 mmol/L NaCl的培养基中垂直培养14 d,和对照相比,诱变后的不定芽生长更迅速(图4A和图4D)。将不定芽转入相同的含盐培养基中进行继代培养,诱变后不定芽的生根效果明显优于对照(图4B和图4E)。将经175 mmol/L NaCl筛选后的不定芽切割后转入含200 mmol/L NaCl的培养基中继续培养,连续继代2次,结果表明：对照组不定芽的生长受到了严重抑制,难以生根;而诱变处理的不定芽的生长较好,部分不定芽可诱导产生明显的根(图4C和图4F)。

将筛选后的不定芽接种到锥形瓶中培养30 d,当培养基中不含NaCl时,对照和诱变处理的不定芽均可诱导生根,没有明显的区别(图4G)。但当培养基中添加200 mmol/L NaCl时,对照的不定芽的生长受到了严重抑制,无根产生;而诱变处理的不定芽则可产生明显的根,生长较好,具有较强的耐盐能力(图4H)。

A：在含175 mmol/L NaCl培养基中垂直培养14 d的不定芽; B：在含175 mmol/L NaCl培养基中继代培养的不定芽; C：在含200 mmol/L NaCl培养基中继代培养2次的不定芽; D：经EMS诱变后,在含175 mmol/L NaCl培养基中垂直培养14 d的不定芽; E：经EMS诱变后,在含175 mmol/L NaCl培养基中继代培养的不定芽; F：经EMS诱变后,在含200 mmol/L NaCl培养基中继代培养2次的不定芽; G：在不含NaCl的培养基中培养30 d的不定芽; H：在含200 mmol/L NaCl的培养基中培养30 d的不定芽。

3 讨论

污染土壤的植物修复在传统上主要依赖于从污染环境中寻找超富集植物,这限制了植物修复技术的应用和发展[15]。利用诱变技术选育具有高生物量的超富集植物,是开发和利用植物修复技术,进行污染土壤净化的有效新途径[16]。EMS是一种可以改变DNA结构的烷化剂,可对植物的某一特殊性状进行改良[17,18]。紫茉莉适应性强,生长迅速,生物量大,是一种较为理想的污染土壤的修复植物[19]。但野生紫茉莉对污染土壤的修复能力仍需进一步提高。将EMS诱变与植物离体培养相结合,变异不仅包括培养过程中产生的体细胞无性系变异,还包括诱变处理产生的新变异,从而可以极大地拓宽变异谱[11]。EMS离体诱变还可以选择具有抗性的突变体,加快诱变育种进程,能够在较短时间内创造出更有价值的新品种[20]。目前,通过EMS诱变改良紫茉莉生物性状的研究尚未见报道。我们将离体培养和诱变技术相结合,试图筛选出耐盐能力强的紫茉莉新品系。实验结果表明,在紫茉莉离体再生的过程中,MS+1.0 mg/L KT+0.05 mg/L TDZ+0.5 mg/L NAA培养基适合茎段不定芽的诱导。对照各培养基的成分发现,在NAA和KT存在的情况下,添加TDZ对不定芽诱导的效果较好,显示TDZ可能在不定芽诱导过程中十分重要,但仍需和其他植物生长物质协同作用。6-BA可促进细胞分裂和分化,有利于不定芽的诱导和增殖，因此,在MS培养基中添加2.0 mg/L 6-BA对紫茉莉不定芽的增殖效果较好。紫茉莉的生根能力极强,不同类型的培养基均可诱导产生不定根,而当在MS培养基中添加0.3 mg/L NAA时,不定根的形成效果更佳,表明一定浓度的NAA更有利于促进紫茉莉不定根的形成。通过分析影响不定芽分化和生根诱导的因素,本研究建立了比较高效稳定的紫茉莉离体再生体系,从而使紫茉莉离体诱变成为可能。

盐胁迫是限制植物生长发育的主要环境因素之一,高盐度可导致植物生长缓慢、产量降低甚至死亡[21]。通过分析盐胁迫对紫茉莉不定芽生长的影响可以发现,随着盐浓度的提高以及处理时间的延长,紫茉莉不定芽表现出越来越明显的盐害症状。当NaCl浓度为175 mmol/L时,不定芽的生长受到了明显的抑制,生根效果极差；当NaCl浓度达到200 mmol/L时,不定芽的生长受到了严重的抑制,基部开始褐化,没有根产生,因此该浓度可作为紫茉莉耐盐突变体的筛选浓度。为了获得更多的耐盐突变体,在实际筛选过程中,NaCl浓度可设定为175～200 mmol/L。通过分析EMS诱变对紫茉莉不定芽生长的影响可以看出,不定芽生长对EMS表现出明显的剂量依赖性。低浓度的EMS对不定芽的生长没有影响,甚至有一定的促进作用;高浓度的EMS则对不定芽的生长有明显的抑制作用。此外,EMS处理时间越长,对不定芽的影响也越大。在36种处理组合中,比较适合紫茉莉不定芽诱变的条件为:0.8% EMS处理6 h或0.6% EMS处理7 h,此时不定芽的致死率大约为50%,适合不定芽的诱变处理。通过合适剂量的EMS诱变和175～200 mmol/LNaCl的反复耐盐筛选,初步获得了具有抗性的紫茉莉耐盐突变体。本研究结果可以为下一步通过EMS诱变技术定向筛选生物修复能力强的紫茉莉新品系提供参考，对今后利用紫茉莉进行污染土壤的修复具有重要意义。