日粮中添加蓝藻粉对崇仁麻鸡肠道菌群结构的影响

张 莉，尹德凤，向建军，袁丽娟，廖且根，张大文*，罗林广

（1.江西省农业科学院 农产品质量安全与标准研究所，江西 南昌 330200；2.农业农村部畜禽产品质量安全风险评估实验室（南昌），江西 南昌 330200；3.江西省农产品质量安全重点实验室，江西 南昌 330200）

由水体富营养化引起的蓝藻水华问题已经成为世界性的水环境问题，其产生的异味物质严重影响了饮用水源以及旅游水源的水质，而且由此产生的各种生物毒素还会危害水生动物、鸟类甚至人类的健康［1-3］。大量打捞堆积的水华蓝藻如果得不到及时有效的处理，对环境会造成严重的二次污染。水华蓝藻中蛋白质含量丰富，氨基酸总量可达52.63%，其中畜禽必需的氨基酸总量达30.25%［4］，如能有效合理利用，将成为资源短缺型动物蛋白的替代蛋白源［5］。为了了解家禽对水华蓝藻粉中藻毒素的耐受和响应，开发水华蓝藻在禽类饲料蛋白中的利用潜力，本实验室前期开展了日粮中添加蓝藻粉对崇仁麻鸡生长性能的影响［6］，并对肝脏和肾脏组织的病理毒理作用进行了研究［7-8］，结果表明，不同蓝藻粉替代量对鸡只肝脏和肾脏造成的损害程度不一样，替代剂量较低的10%和20%对鸡只的生长性能没有显著影响。有研究显示，鸡只肠道微生物与其生长性能之间存在显著的相关性影响［9］，动物肠道中的益生菌会通过竞争来抑制微囊藻毒素对动物机体的负面影响［10］，肠道微生物对宿主的健康起着非常重要的作用，对进入肠道的各种物质代谢起着关键作用［11］，因此，推测本实验室小剂量蓝藻粉的摄入对鸡只生长不产生显著影响，可能与鸡只肠道微生物的调节作用有关。当一定量的蓝藻粉替代豆粕后，鸡只肠道微生物菌群能否存在相应的响应机制？能否提升鸡只对蓝藻粉中蓝藻毒素等危害因子的抵抗能力？本研究通过研究蓝藻粉部分替代日粮中的豆粕后对家禽肠道微生物的影响，有助于了解家禽对蓝藻毒素的抵御机制，为蓝藻饲料化利用提供理论支撑。

1 材料与方法

1.1 试验动物

34日龄健康杂交崇仁麻鸡（快大型），在20日龄时开始进行适应性饲养2周，由江西国华禽业提供。

1.2 试验材料

蓝藻粉，来自无锡太湖，粗蛋白含量41.5%（实测），与基础日粮中的豆粕蛋白质含量（40.8%）相当。

1.3 试验分组

试验分组与王扬等［6］的研究一致，1组为对照组（CB），饲喂基础日粮；2~4组分别用10%（CL）、20%（CM）、50%（CH）蓝藻粉替代基础日粮中的豆粕，试验时间为35 d。各实验组日粮组成及营养水平见表1。

表1 基础日粮组成及营养水平

1.4 饲养管理

饲养管理与王扬等［6］的研究一致，试验鸡饲养于同一鸡舍内，采用多层笼养，限饲，上午和下午各饲喂1次，每只鸡每天的日粮摄入量为100 g，自由饮水。试验前鸡舍进行充分冲洗和严格消毒，按常规方法进行饲养管理，为防止免疫过程中对鸡体内生理生化指标的影响而干扰试验结果，在试验开始之后试验鸡只未进行免疫。

1.5 盲肠内容物采集

饲喂结束后，每组随机选取10只鸡，将鸡只实施安乐死后，拔毛清洗，无菌冷却水冲洗后转移至洁净室取出盲肠，超净工作台中无菌操作收集盲肠内容物，充分混匀后装入离心管中，立即置于-80 ℃冰箱保存。

1.6 DNA提取及MiSeq测序

盲肠内容物样品DNA提取按照TIANGEN磁珠法土壤和粪便基因组DNA提取试剂盒（DP712-01）说明书进行。细菌16S rDNA V3-V4扩增引物为338F（ACTCCTACGGGAGGCAGCAG）和806R（GGACTACHVGGGTWTCTAAT）。PCR反应体系为：4 μL 5×FastPfu Buffer、2 μL 2.5 mmol/L dNTPs、0.8 μL Forward Primer（5 μmol/L）、0.8 μL Reverse Primer（5 μmol/L）、0.4 μL FastPfu Polymerase、0.2 μL BSA、10 ng Template DNA，补dd H2O 至20 μL。反应参数：① 95 ℃预变性3 min；②27次循环（95℃变性30 s；55 ℃退火30 s；72 ℃延伸45 s）；③ 72℃延伸10 min，10 ℃保持。2%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，大小正确，条带清晰可见的目标条带用于进行后续测序试验，MiSeq测序委托上海美吉生物医药科技有限公司完成。

1.7 数据分析

使用上海美吉生物医药科技有限公司提供的免费在线数据分析平台——I-Sanger对数据进行分析（www.i-sanger.com）。

1.7.1 稀释曲线绘制方法 选择97%相似度的OTU或其他分类学水平，利用mothur计算不同随机抽样下的Alpha多样性指数，利用R语言工具制作曲线图。

1071 Value of contrast-enhanced ultrasound in differential diagnosis of pleural-based pulmonary tuberculosis and lung cancer

1.7.2 Chao1指数的计算公式

式（1）中，Schaol=估计的OTU数；Sobs=实际观测到的OTU数；nl=只含有1条序列的OTU数目；n2=只含有2条序列的OTU数目。

1.7.3 Coverage指数的计算公式

式（2）中，nl=只含有1条序列的OTU数目；N=抽样中出现的总序列数目。

1.7.4 Simpson指数的计算公式

式（3）中，Sobs=实际观测到的OTU数；ni=第i个OTU所含的序列数；N=所有的序列数。

1.7.5 PCA分析方法 采用R语言进行PCA统计分析，基于分析结果，将不同分组样本在第一主成分轴上做箱线图，直观呈现出不同分组样本在第一主成分轴上的差异离散情况。

1.7.6 物种群落结构分析 利用R语言工具统计和作图。

2 结果与分析

2.1 日粮中添加蓝藻粉对崇仁麻鸡生长性能的影响

在整个实验期，各组鸡只摄食情况没有差异，各组均无病鸡、死鸡现象出现，饲养结束后，各组鸡只生长情况见表2。

表2 崇仁麻鸡生长性能测定结果

2.2 测序数据统计

不同试验组样本的序列信息见表3，经拼接、过滤等数据前处理，4个试验组的样本一共得到206403条序列，平均长度438.94 bp。按照97%相似性对非重复序列（不含单序列）进行运算分类单元（OTU）聚类，得到OTU总数为395个。

表3 样本序列信息统计表

2.3 稀释曲线分析

稀释曲线分析可以验证取样数量的合理性，如图1所示。4个试验组的样本的稀释曲线均已趋向平坦，说明试验取样数量合理，测序深度已基本覆盖样本中所有细菌。

图1 稀释曲线图

2.4 Alpha多样性分析

盲肠内容物细菌Alpha多样性结果采用丰富度指数chao1值、物种覆盖度（coverage）和辛普森多样性指数（Simpson指数）进行表示，如表4所示。各组样本中物种覆盖度均为0.999，说明所有样本中所含序列均被成功测序，本次测序可以反映样本中细菌群落结构的真实情况。对照组样本（CB）的细菌丰富度指数Chao1值小于各蓝藻组，Simpson指数值大于各蓝藻组。

表4 样本表面Alpha多样性指数分析

2.5 β多样性分析

如图2所示，在属水平对样本的测序数据进行样本层级聚类分析（A）和PCA分析（B）中，根据不同样品之间的相对距离可以看出，随着蓝藻粉替代比例的增加，与对照组盲肠内容物的beta多样性差异逐渐增大。

图2 样品的β多样性分析

2.6 物种群落结构特征分析

本次试验共获得13个门，113个属，395个OTU。在门水平上，有12个门为各样品组共有，p_Spirochaetae仅在CM组和CH组样本中存在（表5）。在属水平上有100个属为各样品组共有，3个属为3个蓝藻替代组共有而对照组中未出现，2个属仅在CM组和CH组中出现，1个属仅在CH组和CL组中获得，1个属仅在CH组和CB组中获得。在OTU水平上，实验组和对照组共有OTU数量291个，3个蓝藻粉替代组特有OTU数量58个，CL组特有OTU数量为4个，CM组特有OTU数量为2个，CH组特有OTU数量为10个（表5）。

表5 各样本物种在门、属和OTU水平上的Venn数据表

各组样本盲肠内容物中细菌群落结构特征如图3所示。在门水平上（图3A），各试验组样本中的微生物丰度最大的均是拟杆菌门和厚壁菌门，其次是变形菌门和互养菌门。各试验组样本中拟杆菌门数量较对照组均有所下降，其中CH组中拟杆菌门数量下降明显；厚壁菌门数量在CL组和CM组有所上升，在CH组上升趋势不明显；变形菌门数量在CL组中呈下降趋势，在CM组和CH组有比较明显的上升趋势；互养菌门在CM组下降明显，而在CL组和CH组上升明显，特别是CH组，其互养菌门所占比例是CB组所占比例的2.5倍；疣微菌门数量在CL组和CM组中比例明显下降。在属水平上（图3B），各试验组样本中的拟杆菌属丰度最大，其次是互养菌属、乳杆菌属、Rikenellaceae_RC9_gut_group、［Ruminococcus］_torques_group、脱硫弧菌属等。拟杆菌属所占比例在CM组和CH组有所下降；互养菌属在CM组中所占比例下降明显，而在CL组和CH组中所占比例升高明显；脱硫弧菌属在CL组中所占比例下降明显，随着替代剂量的升高，所占比例又不断升高，到CH组已显著高于CB组含量；Rikenellaceae_RC9_gut_group在对照组中未发现，但在蓝藻粉替代组中却被检出，且所占比例随着蓝藻粉添加量的增加而增大。乳杆菌属在蓝藻粉替代组中所占比例均比对照组高，其中CL组最高，为CB组的2倍；普雷沃氏菌科（Prevotellaceae）的Prevotellaceae_UCG-001属细菌的数量在CL组和CM组中所占比例显著下降，而CH组与CB组相比而言变化并不明显，Unclassified_f_Prebotellaceae的数量在CL组和CM组中未被发现，而在CH组中所占比例却超过对照组的2倍之多；Akkermansia细菌仅出现在CH组中。

图3 各组盲肠内容物中细菌群落在门（A）和属（B）水平上的分布

2.7 物种组间差异显著性检验

各蓝藻添加组中拟杆菌门、变形菌门、互养菌门和疣微菌门均与对照组呈现显著性差异，厚壁菌门在CL组和CM组中与CB组呈显著性差异，而在CH组中与CB组差异不显著（图4）。在属水平上，各添加组中拟杆菌属、互养菌属、乳杆菌属、脱硫弧菌属等均与对照组呈现显著性差异（图5）。

图4 门水平上基于费舍尔精确检验的两样本比较

图5 属水平上基于费舍尔精确检验的两样本比较

3 讨论

鸡只肠道微生物菌群在营养物质的消化吸收、免疫调节以及有毒有害物质的分解等方面发挥着巨大的作用［12］，其多样性在孵化早期随着日龄的增长而不断发生变化，之后逐渐趋于稳定［13-14］，肠道内正常的土著菌群主要为厚壁菌门和拟杆菌门［12］，其数量和多样性结构受多种因素的影响，年龄、饲料结构、环境外源物的摄入以及病原微生物的感染等均对鸡只肠道微生物多样性产生显著影响［15-16］。

本研究在鸡只日粮中添加不同比例的蓝藻粉替代豆粕后，鸡只肠道中微生物菌群结构与对照组之间存在显著差异。在门水平上，与CB组相比，CL组和CM组鸡只肠道中的厚壁菌门数量有所上升，拟杆菌门有所下降；而CH组拟杆菌门数量下降显著，厚壁菌门无明显变化，但变形菌门上升显著；CL组变形菌门数量呈下降趋势，CM组呈上升趋势。在属水平上，蓝藻粉替代组中乳杆菌属数量均高于对照组，特别是CL组样本中乳杆菌丰度超过对照组丰度近2倍；而脱硫弧菌丰度在CL组较CB组明显降低，随着替代剂量的增加，其丰度又逐渐变大，至CH组超过CB组近1倍。在CH组鸡只盲肠中检测到丰度较高的Akkermansia属细菌，而其他组并未检测到该类细菌。

已有研究表明，在动物消化道中的拟杆菌门和厚壁菌门细菌对多种物质的代谢都非常重要，且拟杆菌门和厚壁菌门细菌数量的变化直接关系到动物体从饲粮中获取能量的效率，增加厚壁菌门数量，降低拟杆菌门数量，使拟杆菌门/厚壁菌门的比值降低，可对动物生长起促进作用［17］；而变形菌门中包含许多致病微生物，如致病性大肠埃希氏菌、沙门氏菌、志贺氏菌等，在一定条件下常常引发动物的各种胃肠道炎症性疾病，影响其免疫力和生长速度，因此，降低变形菌门数量有利于保持动物肠道健康［18］。在属水平上，乳杆菌在肠道中的存在可降低大肠杆菌及沙门氏菌等致病菌在肠道壁的强黏附能力，增强动物机体的免疫力［19］，脱硫弧菌数量与肠道息肉和溃疡性结肠炎密切相关［20］。而Akkermansia属细菌由于能利用黏液中的黏蛋白作为唯一碳氮源，且通常与包括IBD、克罗恩病、溃疡性结肠炎和阑尾炎在内的几种肠道疾病相关［21］。由此可知，低剂量蓝藻粉替代组中，鸡只可通过增加体内肠道中有益菌的数量来竞争抑制蓝藻粉中蓝藻毒素等有害物质对机体的毒害，一旦替代量过高，则会增加蓝藻粉中蓝藻毒素等有害成分对鸡只的毒性效应，影响了鸡只健康，这一结果正好解释了前期的研究结果，蓝藻粉替代豆粕的CL组和CM组的鸡只生长均未受到显著影响，但CH组鸡只生长受到显著性的影响［6］。

综合上述，适量（≤10%）蓝藻粉替代豆粕对宁都黄鸡生长不产生影响；当蓝藻替代量继续增加后，其中的藻毒素（MCs）等有毒有害物质的毒性效应逐渐凸显，最终导致鸡只生长受限。因此，要使蓝藻粉规模化地进行禽类饲料化应用，必须进行藻毒素等有毒有害物质的脱毒处理或尝试进行添加外源益生菌对藻毒素等有毒有害物质的负面作用进行抑制。