60Co-γ射线及化学诱变剂对卷丹百合诱变效应的研究

胡 瑶，李宏告，雷星宇，周毅吉，张 勇，李丽辉

（湖南省农业科学院 核农学与航天育种研究所，湖南 长沙 430125）

卷丹百合（Lilium lancifolium Thunb.）为百合科百合属多年生草本植物。其花橙色或深红色，美丽清雅，芳香宜人；其鳞茎是一种极具营养价值的保健品，具有很高的药用价值，可以活血祛瘀、消肿止痛、养血安神、养阴润肺止咳，还能治疗和预防糖尿病等疾病［1］。百合为湖南道地中药材，采用传统种植模式进行种植以及长期利用种球进行繁殖导致百合品种退化现象严重，从而使百合良种的选育研究受到了限制。

辐照诱变技术具有突变率高、突变谱宽、后代性状稳定快、育种周期短等优点，目前已成为获得新种质资源的最有效途径之一［2］。60Co-γ射线作为一种重要辐照源，在各种作物［3］、花卉［4-7］、中药材［8-9］的育种中应用广泛。目前，已有关于60Co-γ射线诱变处理百合种球的研究报道，例如：赵兴华等［10］对3种切花百合进行60Co-γ诱变育种研究，结果表明适宜诱变剂量因品种不同而变化；李丽辉等［11］在研究60Co-γ射线辐射4种百合的诱变效应时发现，金百合、湖北百合、岷江百合的适宜辐射剂量分别为2～4、2、2 Gy，而卷丹百合在本试验中未找到适宜的辐射剂量。化学诱变作为传统的植物诱变手段，其与辐照诱变技术结合作为植物育种手段的报道还比较少见。鉴于此，本试验采用不同剂量的60Co-γ射线并结合秋水仙素溶液处理卷丹百合的种球，观察了在不同处理下卷丹百合的生物学效应，以期为其辐照诱变结合化学诱变育种适宜剂量的选择提供依据，为今后的卷丹百合诱变技术研究以及开展相关基因功能鉴定奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

供试材料为卷丹百合的鳞茎，购买于湖南省龙山县百合基地，种球大小基本一致，无病虫害。

1.2 辐射处理

采用自封袋分装供试卷丹百合的鳞茎，送往湖南省核农学与航天育种研究所生物辐照中心进行60Co-γ射线辐射处理，辐射剂量分别为0、2、3、4、5 Gy，每组设置3个重复，每个重复10个种球。

1.3 化学诱变剂处理

将辐照后的卷丹百合鳞茎清理干净，放入0.1%秋水仙素溶液中，在振荡器上浸泡12 h，然后取出，用蒸馏水清洗干净，晾干。

1.4 生育指标的调查

将经辐射和化学诱变处理的卷丹百合种球在2020年12月16日栽种于盛有营养土的花盆中，进行常规栽培管理。从各处理中随机选取9株植株，测定其发芽率、存活率、株高、叶长、叶宽、节间距、花瓣长度与宽度、珠芽数等相关生长发育指标，观察记录其变异情况，分析60Co-γ射线辐射结合化学诱变处理对卷丹百合植株形态的影响。

1.5 叶绿体色素及花朵色泽分析

叶绿体色素含量采用乙醇提取比色法［12］进行测定；花色苷、类黄酮含量采用南京建成生物研究所的试剂盒进行测定。

1.6 主要营养保健成分分析

检测材料为卷丹百合的M1鳞茎。水分含量测定采用重量法（《食品中水分的测定》 GB/T 5009.3—2003）；多酚含量测定采用福林酚法［13］；类黄酮含量测定采用南京建成生物研究所的试剂盒；多糖含量测定采用苯酚-硫酸法［14］。对上述所有指标的测定均重复3次，取平均值。

1.7 数据处理

采用SPSS软件对试验数据进行方差分析；使用最小显著差数法（LSD）对不同处理间的指标差异进行多重比较。图表绘制采用Office 2007软件。

2 结果与分析

2.1 不同诱变方法对卷丹百合种球生长指标的影响

2.1.1 种球发芽率、存活率及单株鲜重 自栽培日起70 d后，统计卷丹百合种球的发芽率，在120 d时统计存活率。不同剂量的60Co-γ射线辐射结合化学诱变剂处理对卷丹百合种球的发芽率和存活率均有一定的影响。从表1可以看出：在处理1~5（不同辐射剂量处理）下卷丹百合种球的发芽率和存活率均随着辐照剂量的增加而降低。具体来说，2 Gy处理的发芽率和存活率均较对照（CK）下降了8.3%；3 Gy和4 Gy处理的发芽率均较对照下降了11.1%，存活率则比发芽率下降得快，尤其是4 Gy处理较对照下降了75.0%；5 Gy处理的发芽率只有66.7%，但后期均死亡。处理6~10为辐射结合0.1%秋水仙素处理，其中处理6~8的卷丹百合种球的发芽率为100%；处理9和处理10的发芽率较对照分别下降了22.2%、33.3%；处理6的存活率为91.7%；处理7~9的存活率呈下降趋势，分别较处理6下降了18.2%、27.3%、81.8%；处理10的存活率为0%。随着辐照剂量的增加，卷丹百合的单株最大鳞茎鲜重呈下降趋势，且辐照结合秋水仙素处理的卷丹百合单株最大鳞茎鲜重比单一辐照处理有所下降，说明辐射结合化学诱变处理对卷丹百合的球茎产量有一定的影响。

表1 不同诱变处理对卷丹百合种球发芽率和存活率的影响

2.1.2 卷丹百合的植株形态 为了进一步探究不同诱变方式对卷丹百合植株生长的影响，对两种诱变处理下卷丹百合的植株形态指数进行了分析，结果见表2。除已死亡的处理5、10外，随着辐照剂量的增加，卷丹百合的株高呈明显的下降趋势，均较对照显著下降，其中4 Gy及4 Gy+0.1%秋水仙素处理的株高下降幅度居前2位，较对照分别下降了73.0%、74.1%；2 Gy、3 Gy处理的株高下降，较适于盆栽。在2 Gy和3 Gy剂量60Co-γ射线辐射处理下，卷丹百合的叶片变长，宽度变窄，而且节间距急剧缩短，叶片生长非常紧凑。各处理的卷丹百合的单株珠芽数都随着辐照剂量的增加而变少，3 Gy、4 Gy处理的单株珠芽数较对照显著减少，且在植株顶端生长珠芽，未进行花芽分化。叶形指数也是在3 Gy处理下达到最大值，较对照呈显著差异。采用辐射+0.1%秋水仙素处理的卷丹百合的整体叶长较单一辐照处理短些，叶宽窄些。0~4 Gy辐射+0.1%秋水仙素处理的节间距较对照分别缩小了2.7%、43.5%、72.8%、81.6%，在4 Gy+0.1%秋水仙素处理下差异最显著。各处理的单株珠芽数同样较对照差异显著，但3 Gy与4 Gy结合秋水仙素处理之间差异较小，说明节间距与单株珠芽数对辐射处理表现出较高的敏感性。

表2 两种诱变方式对卷丹百合植株形态的影响

2.1.3 卷丹百合的花朵形态 由表3可知：在60Co-γ射线辐射处理及辐射+秋水仙素处理下卷丹百合的花瓣长度与对照相比差异显著，但各处理间的差异不明显；各处理卷丹百合的花瓣宽度及雄蕊长度变化很小，差异不显著，说明其对60Co-γ射线辐射及0.1%秋水仙素处理不敏感；就卷丹百合的单株花朵数而言，2 Gy处理与对照差异不大，3 Gy、4 Gy处理逐渐减少，且各剂量辐照+0.1%秋水仙素处理均较对照有所减少，以4 Gy+0.1%秋水仙素处理的花朵数量最少，较对照减少了20.0%;各处理的开花历期随着辐射剂量的增加而减短，但开花始期存在不同程度的延迟，辐照剂量越大，延迟天数越多。

表3 2种诱变方式对卷丹百合花朵形态的影响

2.2 两种诱变方法对卷丹百合花瓣色泽的影响

从图1~图2可以看出：在各处理间卷丹百合花瓣的类黄酮含量差异不显著，只有4 Gy+0.1%秋水仙素处理的类黄酮含量比对照增加了55.31%，差异显著；在各辐射处理间卷丹百合花瓣的花色苷含量差异较小；2 Gy辐射+秋水仙素处理的花色苷含量与对照差异不大；3 Gy+秋水仙素处理的花色苷含量较对照降低了21.36%；而4 Gy+秋水仙素处理的花色苷含量比对照增加了11.46%。

图1 两种诱变方式对卷丹百合花瓣花色苷含量的影响

图2 两种诱变方式对卷丹百合花瓣类黄酮含量的影响

2.3 两种诱变方法对卷丹百合叶绿体色素的影响

叶绿素是自然界中植物进行物质代谢和能量代谢的基础物质，也是植物进行光合作用的主要色素之一［15］。两种诱变处理对卷丹百合叶绿体色素含量的影响如表4所示，3~4 Gy剂量60Co-γ射线辐射处理以及2~4 Gy辐射+0.1%秋水仙素处理下卷丹百合叶绿素a的含量均比对照高，以3 Gy辐射处理和3 Gy+0.1%秋水仙素处理的叶绿素a含量最高，均较对照提高了21.2%，差异显著。在不同剂量的辐射处理中，只有3 Gy处理的卷丹百合叶绿素b含量较对照高，且在各辐照处理间叶绿素b含量差异不明显。0~4 Gy辐射+0.1%秋水仙素处理的叶绿素b含量均比对照高。CK+0.1%秋水仙素处理的卷丹百合的类胡萝卜素含量最低，与其他各处理差异显著，较对照降低了61.8%。

表4 两种诱变方式对卷丹百合叶绿体色素含量的影响

2.4 两种诱变方法对卷丹百合鳞茎主要营养保健成分的影响

由表5可知:经过辐射后卷丹百合鲜鳞茎的水分含量均比对照高；在复合诱变处理中，以2 Gy+0.1%秋水仙素处理的鲜鳞茎的水分含量最高，较对照增加了17.13%；鲜鳞茎的类黄酮含量随着辐照剂量的增加呈先降低后升高的变化趋势，以3 Gy+0.1%秋水仙素处理的类黄酮含量最高，但与对照差异不显著；单辐射处理以及复合诱变处理对卷丹百合多糖含量的影响不大，各处理间差异不明显；各辐射处理卷丹百合的多酚含量均比对照显著增加，但辐射+秋水仙素各处理的多酚含量低于相应的单辐射处理，说明0.1%秋水仙素溶液会抑制卷丹百合鲜鳞茎中多酚的积累。

表5 两种诱变方式对卷丹百合鲜鳞茎主要营养保健成分含量的影响

3 讨论

辐照育种技术利用射线诱发农作物遗传物质突变而引起性状变异，是一种选育新品种、农作物改良的有效途径。60Co-γ射线作为常用的辐射源，可对植物的生长发育产生一定的抑制或促进作用［16］。秋水仙素会对正在分裂的细胞产生作用，因此，可以用一定浓度的秋水仙素溶液或乳剂对作物材料进行浸渍、涂抹、滴液、注射等诱变处理［17］。

本试验采用60Co-γ射线辐射并结合化学诱变剂秋水仙素处理卷丹百合的鳞茎，结果表明，两种诱变处理对卷丹百合的形态及生理生化指标均产生了不同程度的影响。在5 Gy剂量处理下，卷丹百合鳞茎的存活率为0%；经4 Gy处理后存活率只有25.0%；经4 Gy+0.1%秋水仙素处理后存活率只有16.7%，这说明高剂量辐照抑制了卷丹百合鳞茎的存活，这与60Co-γ射线对小苍兰的生物学效应的结果［18］一致，但与朱校奇等［19］的研究结果“经3 Gy处理后卷丹百合鳞茎的存活率为0%”有所不同，在本试验中卷丹百合的耐受剂量高些，5 Gy为致死剂量，这可能与辐照样品催芽与否有关。本研究还发现，60Co-γ射线辐射处理以及辐射结合0.1%秋水仙素处理都会使卷丹百合的株高变矮、节间距变短、单株珠芽数减少，且这些指标均与辐射剂量呈负相关，这些现象都符合60Co-γ射线对植物生长的诱变效应，与60Co-γ射线对香梨［20］、月季［21］的辐射效应，以及对观赏海棠组培苗的诱变效应［22］一致。但在本试验中，3 Gy剂量辐照处理的卷丹百合的叶长比对照显著变长，这一结果与Wang等的研究结果“用60Co-γ射线辐射处理德国鸢尾种子会缩短植株的叶长”不一致，这可能与不同植物、不同品种对辐射的敏感性存在差异［23］有关。

本研究结果显示，60Co-γ辐射对卷丹百合花瓣色泽的影响不大，只有4 Gy剂量辐射处理以及4 Gy+0.1%秋水仙素处理的花瓣花色苷、类黄酮含量与对照差异显著。这可能是因为60Co-γ射线和秋水仙素共同作用激发了卷丹百合体内潜在的保护机制，很多类黄酮物质都具有强抗氧化活性［24-25］。叶绿素是捕获光能的物质基础，其含量可以在一定程度上反映植物同化物质的能力［26］。查钱慧等［27］对南山茶增城1号进行60Co-γ辐照处理，发现在20 Gy和30 Gy辐照处理下的叶绿素含量高于对照。有研究表明海州常山的叶绿素a、叶绿素b、总叶绿素含量均随着辐照剂量的增加呈先增加后降低的趋势。在本研究中，60Co-γ射线3 Gy辐射处理和3 Gy+0.1%秋水仙素处理使卷丹百合的叶色呈深绿色，叶绿素a含量较对照显著提高了21.2%，这与前人的研究结果基本一致。本研究还发现，60Co-γ射线辐射及辐射结合秋水仙素处理对卷丹百合鳞茎主要营养保健成分产生了不同程度的影响，主要表现在水分、多酚及类黄酮含量的显著变化上，而多糖含量变化不大，这与李彦杰等［28］的研究结果“辐照可引起多糖降解”不一致，这可能与多糖检测本身存在不稳定性有关。

4 结论

本研究结果表明：60Co-γ射线及60Co-γ射线结合秋水仙素处理卷丹百合鳞茎的致死剂量为5 Gy，适宜辐照剂量为2~3 Gy。经辐照处理后，卷丹百合植株的生长受到了比较明显的抑制，其中4 Gy处理使卷丹百合顶端生长珠芽，不开花；3 Gy处理使叶片叶绿素a含量增加，叶片叶色浓绿；3 Gy及3 Gy+0.1%秋水仙素处理使卷丹百合新鳞茎的水分及多酚含量增加。本试验结果可为今后卷丹百合的诱变育种提供理论依据。