钾镁肥优化施用对烤烟后期光合荧光特性和碳氮代谢酶活性的影响

谢榕榕，柯玉琴，李文卿，李春英，郑朝元，吴良泉

（1.福建农林大学 资源与环境学院/国际镁营养研究所，福建 福州 350002；2.福建农林大学 生命科学学院，福建 福州 350002；3.福建省烟草专卖局 烟草科学研究所，福建 福州 350013）

0 引言

镁营养在植物生长过程中起着重要作用，叶片中的镁参与蛋白合成，35%的镁存在于叶绿体中［1］；Mg催化谷胱甘肽合酶、磷酸激酶、RNA聚合酶等300多种酶反应［2］，因此，植物体中镁营养状况直接或间接影响光合作用、碳水化合物分配、硝酸还原等过程［3］。与此同时，钾和镁对光合作用过程和光同化物的运输起着至关重要的作用，介导蔗糖运输和光同化物的分布［4］。镁在土壤中的有效性低，这主要是镁离子具有较大的水合半径，与土壤胶体吸附性差，易被淋洗而损失，导致雨量充沛的南方烟区土壤镁的有效性低，含量也低［5-6］。另外，离子间的拮抗作用，钾镁之间的拮抗互作被认为是缺镁的主要原因［7］；钾镁比例增大会导致土壤缺镁［8］。因此，在福建烟区提高镁营养的有效性十分迫切。

福建烟区烤烟生长后期常遇高温强光气候，热胁迫对烤烟品质有负影响。有研究表明，充足镁供应能够减轻玉米和小麦的热胁迫［9］，在较低光强下生长的叶片有高达57%的镁与叶绿素结合，而在高光下生长的叶片中结合比例仅为37%，镁缺乏的反应是叶绿素浓度的降低［9］，但在烤烟上关于调整钾镁比例对光合作用以及碳氮代谢的影响研究还较少。

烤烟生产中常施用较多的钾肥，以提高烟叶钾含量，提高烟叶产量和品质。若烤烟种植上忽视镁肥的补充，则会影响烟株生长和品质形成，且较高的施钾量会进一步抑制烟株吸收镁。本研究通过优化钾镁施肥处理，减少钾肥施用，增加镁肥施用，以期达到平衡烟株营养的效果，为优化烤烟田间养分管理提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验地点和品种

试验在福建省烟科所宦溪科研基地进行。品种为当地主栽品种翠碧一号（Nicotiana tabacum L. cv CB-1）。土壤pH值4.96。试验区基础肥力情况见表1。

表1 试验区基础肥力情况 mg/kg

1.2 试验设计

根据氮磷钾的配比，共设4个处理： T1为对照，N∶P2O5∶K2O=1∶0.68∶3，施钾量（K2O）为315 kg/hm2，不施镁肥；T2为钾肥优化处理，N∶P2O5∶K2O=1∶0.68∶2，施钾（K2O）量为210 kg/hm2，不施镁肥；T3为钾镁肥配施1，N∶P2O5∶K2O=1∶0.68∶2，施钾量（K2O）为210 kg/hm2，施镁量（MgO）为19.5 kg/hm2；T4为钾镁肥配施2，N∶P2O5∶K2O=1∶0.68∶2，施钾量（K2O）为210 kg/hm2，施镁量（MgO）为39.0 kg/hm2。

各处理施氮量为105 kg/hm2，施磷量（P2O5）为71.4 kg/hm2，肥料种类分别为专用肥（N∶P2O5∶K2O=12∶8∶22）855 kg/hm2，复合肥（N∶P2O5∶K2O=15∶15∶15）15 kg/hm2，基肥、追肥比例为66∶34。T1处理施用硫酸钾240 kg/hm2，T2、T3和T4处理施用硫酸钾45 kg/hm2，均在烟株大开盘时双侧条施；镁肥为化学纯氧化镁，全部在移栽前1周条施。每处理种植98株，行株距为1.2 m×0.5 m，随机区组排列，重复3次。2019年1月25日移栽。除试验处理不同外，其余栽培措施均参照当年优质烟生产技术方案。

1.3 测定项目

移栽前取土样，测定土壤中有机质、水解氮、有效磷、速效钾、交换性镁、微量元素的含量以及pH值。在烤烟成熟采收期（5月29日）每个处理测定上部倒2叶位的光合、荧光参数，同时取各处理上部倒2～3叶位叶片，带回实验室，剔除主脉后测定各生理指标。

叶绿素含量的测定：用80%丙酮浸提24 h，利用可见分光光度计分别在470、646和663 nm 3个波长处进行吸光度测定。

光合参数采用英国PP-system公司生产的CIRAS-II型便携式光合仪测定，测定光强为1000 μmol/（m2·s），CO2浓度为380 μL/L；荧光参数采用Hansatech公司生产的Pocket PEA便携式叶绿素荧光计测定，每个处理重复测定5片叶，同时计算荧光动力学JIP-test参数，涉及的JIP-test参数如表2所示［10］。

表2 JIP-test快速叶绿素荧光诱导动力学曲线 （OJIP） 参数

RuBPCase的活性采用酶联生物的试剂盒，用酶联免疫分析（ELISA）方法测定。硝酸还原酶（NR）的活性采用活体法测定。谷氨酰胺合成酶（GS）的活性参照邹琦等［11］的方法测定。蔗糖磷酸合成酶（SPS）、蔗糖合成酶（SS）的活性参照刘以前等［12］的方法测定。

1.4 数据统计分析

数据的初步统计作图等由Excel 2010软件完成，方差分析和多重比较由DPS 7.05软件完成。

2 结果与分析

2.1 不同处理对采收期烤烟光合特性的影响

2.1.1 不同处理对采收期烤烟叶绿体色素含量的影响 如表3所示，与常规施肥（T1）相比，减少钾肥施用 （T2）有增加叶绿体色素含量的趋势，但增幅不显著。在降低钾肥的基础上增加镁肥施用（T3）能有效增加叶绿体色素的含量，其中总叶绿素 （Chl）、叶绿素a（Chla）含量较T2极显著增加（P＜0.01）。随着镁肥施用量进一步增加（T4），Chl、Chla、Chlb和Car含量均显著增加。降低钾镁比例，烤烟各处理叶绿素中Chl含量的增幅分别为2.2%、11.8%、18.3%，Car含量的增幅分别为3.5%、17.5%、19.7%，说明在常规施肥的基础上降低钾肥的施用量能在一定程度上提高色素含量，通过减钾增镁降低钾镁养分比例可以显著提高烟叶色素含量，色素含量均在T4处理钾镁比最低时达到最大值。

表3 不同处理对采收期烤烟叶绿体色素含量的影响 mg/g

2.1.2 不同处理对采收期烤烟光合参数的影响 净光合速率（Pn）、细胞间CO2浓度（Ci）、气孔导度（Gs）、蒸腾速率（Tr）等光合参数是表征光合作用强弱的指标。由表3可知，与常规施肥（T1）相比，减少钾肥施用量 （T2）极显著 （P＜0.01）提高了叶片的Pn和Gs；Tr也有增加趋势，但增加不显著；Ci则表现为显著下降。

在优化施肥加镁的2个处理中，施镁量为19.5 kg/hm2时，Tr、Pn、Gs和Ci均表现为增加的趋势，但仅Tr达到显著水平；在优化施肥加镁19.5 kg/hm2时，Tr、Pn、Gs的值最高，此时光合作用最强；随着钾镁比值继续降低，当镁肥施用量达到39.0 kg/hm2时，Tr、Pn、Gs开始表现出下降趋势，光合作用开始减弱。

优化施肥中，Pn、Tr、Gs、Ci值随着镁肥施用量的增加而呈现倒V型变化。各处理Pn值：T3＞T2＞T4＞T1，说明优化施肥+19.5 kg/hm2镁肥能有效促进光合作用进行。

表4 不同处理对采收期烤烟光合参数的影响

2.1.3 不同处理对采收期烤烟叶绿素荧光参数与JIP-test参数的影响 由表5可知，优化施肥与加镁处理采收期烤烟叶绿素Fo无显著差异，说明优化施肥通过调整钾镁比例对光系统Ⅱ没有显著影响。相较于常规处理，减少钾施用量的各处理烟叶的Fm、Fv、Fv/Fm值极显著地增加，Fv/Fo也有增加的趋势，进一步说明了降低钾镁比值能有效提高采收期烤烟的光合作用，促进采收期碳代谢。降低钾镁比例，烤烟各处理最大荧光（Fm）的增幅分别为13.3%、18.0%、24.1%；可变荧光（Fv）的增幅分别为 17.3%、23.6%、30.9%；Fv/Fo的增幅分别为11.0%、17.2%、23.1%；Fv/Fm的增幅分别为3.7%、4.7%、5.5%。各处理中以钾镁比最低的T4处理的Fm、Fv、Fv/Fm、Fv/Fo值最高，说明增加镁肥施用能维护光系统光化学反应功能，T4处理下采收期烤烟叶光系统光化学反应功能最佳。

表5 不同处理对采收期烤烟叶绿素荧光参数的影响

从图1可见，优化施肥处理后JIP-test参数Sm、N、ETo/RC、ABS/CSm、TRo/CSm、ETo/CSm、PIABS、PItotal、RC/CSm、ETo/ABS、ETo/TRo、TRo/ABS、ETo/ABS、ETo/TRo值均大于常规施肥处理。各处理的Sm变幅趋势为T3＞T4＞T2＞T1；N的变幅趋势为T4＞T2＞T3＞T1；ABS/CSm、TRo/CSm、ETo/CSm、PIABS、PItotal、RC/CSm、ETo/ABS、ETo/TRo、TRo/ABS、ETo/ABS、ETo/TRo的变化趋势为T4＞T3＞T2＞T1。优化加镁的T3、T4处理的ETo/CSm、PIABS、PItotal、ETo/ABS、ETo/TRo值增大明显，与农户对照相比，T3处理的分别增长了32.23%、68.26%、56.28%、22.34%、19.36%，T4处理的分别增长了45.87%、86.89%、39.00%、31.19%、26.53%。随着钾镁比例下降，TRo/RC、ABS/RC值有下降趋势，表明优化施肥后，天线色素中有更多的激发态叶绿素a将能量 （光子）传递到反应中心，减少无效的荧光产生。

图1 不同处理对采收期烤烟荧光JIP-text参数的影响

2.2 不同处理对采收期烤烟碳氮代谢的影响

2.2.1 不同处理对采收期烤烟RuBPCase活性的影响 如图2所示，与常规施肥相比，优化施肥、减少钾肥施用显著提高了采收期烤烟RuBPCase活性。与对照相比，优化加镁处理通过降低土壤钾镁比例能在一定程度上提高烟株叶片RuBPCase活性，但T3处理与对照差异不显著，T4处理显著高于T1处理；T2、T3和T4处理间RuBPCase活性差异不显著。说明钾肥施用量偏高可能降低烤烟RuBPCase活性，进而影响采收期烤烟光合作用中碳同化过程。

图2 不同处理对采收期烤烟RuBPCase活性的影响

2.2.2 不同处理对采收期烤烟NR活性的影响 硝酸还原酶（NR）是NO3-同化中第1个关键酶，生长后期较高的NR活性会阻碍碳氮代谢的转换和适时落黄［2-3］。由图3可知，与常规施肥（T1）处理相比，减少钾肥的施用促进了叶片NR活性上升，其中T3处理达到显著水平，但降钾的3个处理间差异不显著。降钾优化处理可提高NR活性，促进NO3-转化NO2-，有利于烤烟叶片维持一定的氮代谢。

图3 不同处理对采收期烤烟NR活性的影响

2.2.3 不同处理对采收期烤烟GS活性的影响 谷氨酰胺合成酶（GS）是氮代谢中心的调节酶，参与催化无机氮合成谷氨酰胺［4］。如图4所示，与常规施肥相比，降低钾肥施用（T2）显著提高了采收期烤烟GS活性，但降钾的3个处理间差异不显著。各处理以T4处理时GS活性最高，氮代谢中谷氨酰胺合成能力最强。说明降低钾镁比例能促进氮代谢中谷氨酰胺的合成过程。

图4 不同处理对采收期烤烟GS活性的影响

2.2.4 不同处理对采收期烤烟SS活性的影响 蔗糖合成酶（SS）是一种可逆酶，既可以促进蔗糖分解生成腺苷二磷酸葡萄糖和果糖，也可以促进蔗糖的合成，具有协调植物蔗糖和淀粉含量的功能［7-8］。图5为不同处理对采收期烤烟SS活性的影响，优化施肥处理的SS活性显著高于常规施钾处理，其SS活性是常规施钾肥（T1）处理的1.5倍，说明减少钾肥施用量可以显著提高SS活性；在优化加镁肥施用处理中降低钾镁比例会降低SS活性，但其SS活性仍显著高于常规施钾肥处理。

图5 不同处理对采收期烤烟SS活性的影响

3 讨论

3.1 钾镁优化对烤烟光合特性与光合荧光特性的影响

已有研究表明，缺镁植株的叶绿素含量下降［13］；当土壤有效镁含量低时，随着镁肥施用量增加，采收期烤烟的光合作用有增强的趋势［14-15］，这与本研究结果一致。在烤烟生产上，不施镁肥的土壤，若施钾量较高，导致钾对镁的拮抗作用，则镁的有效性低，镁作为叶绿素中心原子缺乏，不能及时合成叶绿素进行光合作用。本研究结果表明，优化加镁能显著提高烟叶叶绿素含量，降低钾镁比例能够促进采收期烟叶叶绿体色素积累，其主要是通过增加Chla的含量来影响Chl含量。光系统Ⅱ活性增强，能够提高烤烟采收期的光合作用。

在叶绿素荧光参数中，Fv/Fm反映光系统Ⅱ在逆境下光系统受伤程度，优化施肥随着镁肥的外源施用以及施用量的增加，Fm、Fv、Fv/Fm、Fv/Fo值呈增加趋势，说明优化施钾肥并补施镁肥可以促进烤烟烟叶光系统Ⅱ光化学反应进行，进而促进光合作用。这可能是因为钾镁比例降低，镁有效性提高，光合组织中有充足的镁，植物生理生化反应中复杂的相互作用会促进光合碳同化的进行［4］，导致优化加镁处理Fm、Fv、Fv/Fm、Fv/Fo值增大明显。同时施用MgO 19.5 kg/hm2处 理 的 叶 绿 素 荧 光 JIP-test参 数ETo/CSm、PIABS、PItotal、ETo/ABS、ETo/TRo分别有不同程度上调，表明单位膜面积活性中心进入电子传递中的电子传递到有效电子受体（QA至QB，PQ，PC）的量子效率（ETo/CSm、ETo/ABS、ETo/TRo）提高，PSⅡ、PSⅠ与电子传递之间整体活性（PIABS，PItotal）增加。已有类似研究结果表明，REo/ABS和PIABS，PItotal在缺镁叶片和功能叶中降低，导致PSI末端电子受体减少，使这些叶片受到损害［16］；在缺镁叶片中，光合电子传递链过度减少，从而增强了高活性氧的产生，在强光下影响更为严重［17］。随着镁的补充和钾镁比例下降，TRo/RC、ABS/RC值下降，聚光色素能够将更多的光子传递到反应中心参与电子传递，此时发射荧光减少，也减少了活性氧的产生，减轻烤烟后期叶片损伤，这对烤烟生长后期遇上高温强光的东南烟区有极其重要的意义。通过叶绿素荧光瞬态值计算的JIP-test参数表明优化加镁处理后光反应活性中心效率也有一定的提高，说明提高镁肥施用量促进烤烟采收期光合作用主要是通过提高烟叶单位面积光反应活性中心效率、电子传递的有效性实现的。同时，镁能够影响光合系统的整体协调性，对光合系统活性指数分析可知，PSⅡ活性指数（PIABS）随着钾镁比例的降低而逐渐增大，T4处理时增幅为86.89%；T3处理时光合系统总活性指数（PItotal）最佳，这可能是因为在低Mg2+浓度下，镁对光合系统的影响首先是聚光复合蛋白（LHCIIs）的横向微组织发生变化，随后两个光系统发生分离［18］，缺镁导致捕光叶绿素a/b蛋白（LHCP）从PSⅡ中脱离，从而增加光子从LHCP直接转移到PSI的可能性［19］。也有研究认为缺镁下植株叶片叶绿素降解，释放镁养分，并通过触发LHCIIs降解来保护细胞免受光损伤［4］。成熟期烟叶细胞结构较完整，有利于烟叶烘烤过程中物质正常转化，促进烤后烟叶外观均匀。

3.2 钾镁优化对烤烟碳氮代谢酶活性的影响

氮代谢的关键酶硝酸还原酶（NR）的作用依赖光合作用提供还原力，有效镁含量增加有利于氮同化的进行［20］。雷佳等［21］的研究表明，在烤烟全生育期中，NR活性在团棵期达到最大值，此后随着烤烟成熟而逐渐降低；成熟期烤烟碳的固定代谢和转化代谢开始减弱。本研究结果表明，优化加镁能够促进成熟期烤烟氮代谢的进行，同时镁可以明显提高Rubisco的活性。也有研究表明低浓度的Mg2+加速了Rubisco活性的增强，高浓度的Mg2+则减缓了Rubisco活性的增强［22］。优化加镁促进Rubisco活性增加存在最适临界点，与前人的研究结果一致；本研究发现镁可以明显提高Rubisco的活性。蔗糖合成酶催化蔗糖转化为相应的核苷酸活化的葡萄糖衍生物，镁的含量影响了其催化效率［23］。同时Zhao等［24］的研究表明Mg的缺乏降低了NR的活性，减少了Chl的合成。Yin［13］在菠菜上研究发现缺镁降低了菠菜氮代谢关键酶NR、GS的活性。施镁能促进烤烟生长后期碳氮代谢过程，促进碳氮代谢平衡，提高烤烟后期干物质积累，有利于烤烟烟叶品质优化［25］。本研究取样时间为5月29日，刚进行了下部叶采收，此时测定结果表明降低钾镁比例，提高土壤镁有效性，可以提高烤烟成熟期上部叶片碳氮代谢关键酶NR、GS、SS活性，促进成熟期烤烟碳氮代谢平衡，促进烤烟内在物质趋于平衡，在下部叶进入成熟期后，上部叶仍保持较好的碳氮代谢平衡，可在一定程度上延长烟株生育期，避免烟株提前衰老。

通过分析优化施镁处理烤烟的碳氮代谢酶活性，结果表明优化钾肥加镁能提高碳代谢中RuBPCase、SS活性，这可能与镁介导了RuBPCase封闭的六聚体的形成有关［26］；充足的镁离子与RuBPCase结合，有利于羧化作用［27］，从而光合作用与碳固定增强，促进碳循环代谢。同时优化钾肥加镁能提高氮代谢中NR、GS活性。GS是氮同化的关键酶之一，Mg与GS的调控有关，镁是GS的组成部分，具有构成GS结构和催化作用［28］。NR的去磷酸化和14-3-3蛋白的解离增加了NR的活性，Mg通过增加14-3-3蛋白与NR的相互作用增加NR活性［29］。

3.3 钾镁优化对烤烟生产的影响

在植物细胞中，Mg2+对植物具有重要的生物学功能，是合成叶绿素的中心原子、具有稳定核糖体结构和酶的辅助因子等功能［30］。在植物-土壤系统中，钾和镁元素之间的互作，既表现出协同作用又表现有拮抗作用，有研究表明两者之间的拮抗作用以钾对镁的单方拮抗为主［31］，在低镁低钾供应下，促进植物对钾、镁养分的吸收；在高钾低镁条件下，植株吸收镁养分显著降低，合理施钾会增加植物对Mg2+的吸收；而当钾肥施用量较大时，由于钾-镁之间的拮抗作用，缺镁症状可能会加剧。

本研究表明，在农户常规施肥基础上减少钾肥施用，补施镁肥，降低钾镁比例，有利于采收期烟叶叶绿体色素积累，增强植物光合作用，提高碳固定，增强碳氮固定代谢酶、转化代谢酶的活性，为烤烟生长干物质积累提供最佳酶活性机制，促进烤烟碳氮代谢平衡。与钾有关的有机酸对烟叶的燃烧性作用明显，增施钾肥能提高钾氯比，从而改善燃烧性［32］。在烤烟生产上，为提高烟叶的燃烧性，常常施用大量钾肥以提高烤烟的钾含量。从本研究看，太高的施钾量容易导致成熟期烟株内在光合作用、荧光特性、碳氮代谢等平衡过早被打破，不利于叶片正常成熟，这可能是导致东南烟区烤烟生长后期高温逼熟的原因之一。因此，进行优化施肥十分必要，适当降低钾肥施用，优化钾镁比例对成熟期烤烟保持较好的碳氮代谢平衡和正常成熟落黄有利，特别在福建生态条件下，有利于减缓烤烟生长后期受高温强光伤害影响，提高烟叶烘烤品质。但烟叶田间生长时间延长，可能导致内在物质积累更充分，叶片身份增厚，需要优化烘烤工艺提高烘烤质量；同时，要适量施用氮肥，保障烤烟成熟期能够适时成熟落黄。另外，在生产上调整钾肥施用量，进行优化施肥，辅以少量镁肥施用，能有效节约烤烟生产成本。

4 结论

本研究结果表明，在目前生产施钾的基础上减少钾肥施用，优化钾镁比例能够促进采收期烟叶叶绿体色素积累，显著地增加烤烟烟叶Fm、Fv、Fv/Fm值，提升烤烟采收期光合作用中光合色素捕获光能的能力，提高单位面积光反应活性反应中心效率、电子传递的有效性，促进光能转化成化学能，提升采收期烤烟光反应系统的功能协调性，提高光反应系统的整体活性，进而提高净光合速率，并减缓叶片受高温强光伤害。NR活性在优化处理+MgO 19.5 kg/hm2的处理下最大，优化施肥能增加GS活性，有效提高烤烟RuBPCase活性，提高SS活性，促进烤烟生长后期碳氮代谢平衡，保障叶片正常成熟。当优化钾镁比例为10.77∶1、施用MgO 19.5 kg/hm2时烤烟的生理代谢功能最佳。