中国美利奴羊OAR1脱毛症的基因组选择分析

常倩倩，杨烨彰，李 睿，郑浪漫,崔子龙，米热妮萨·图尔荪托合提，陈鸿杰，刘春洁*，刘书东*

（1.塔里木大学 动物科学与技术学院，新疆 阿拉尔 843300；2.新疆生产建设兵团塔里木畜牧科技重点实验室，新疆 阿拉尔 843300）

绵羊是新石器时代人类驯化的最早家畜之一［1］。绵羊给人们的生活提供了大量的肉类、奶类、毛皮等产品。中国美利奴羊是我国第一个细毛羊品种，于1985年培育成功，它的父本是澳大利亚美利奴羊，母本是新疆细毛羊。该品种的适应性强、体型长，胸部宽且深，后肢肌肉丰满，尾部宽而平直，头部羊毛从顶部覆盖至两眼连线处，前肢羊毛覆盖至腕关节处，后肢则羊毛覆盖则达到腓关节；羊毛丛密度大、结构好，羊毛较长且有明显的弯曲，毛色一般呈乳白色或者油白色，净毛量较高，主要分布在新疆、内蒙古和东北地区等，所产羊毛长、产量高且质量好，羊毛的产量决定了羊毛产业的经济效益，但羊的脱毛症给养殖业带来了巨大损失。

羊脱毛症是指羊的被毛脱落、根部萎缩、被毛发育不良等症状的总称，是由于某种特殊病因，如缺乏营养和代谢紊乱、细菌感染、寄生虫侵害、中毒等引起的一种非传染性疾病［2］。在绵羊和山羊的群体中，脱毛症是绵羊养殖过程中一种常见疾病，多见于泌乳期和妊娠后期的母羊［3］。羊脱毛症在发病时，羊躯干和颈部的被毛会成片地脱落，被毛粗糙灰暗、无光泽，并呈现出不同程度的贫血，喜食杂物如黏土、污粪等。吃下去的杂物在胃内会形成毛球，继而出现便秘、腹痛、消化不良等症状，严重者表现为消瘦贫血、腹泻，个别羊出现视力模糊，甚至死亡。脱毛症发病率可高达20%~35%，多为农业区和半农半牧区，死亡率通常较低，但会导致农牧民减产减收和经济收入偏低。

目前，脱毛症与基因的相关性主要在人类中的研究比较多，人类的斑秃（AA）是一种非瘢痕性的脱发，国外有研究称斑秃疑似为自身免疫性疾病，AA的产生可能与异质表型相关［4］。患有AA的人一般会出现较严重的脱发，不同患者的脱发面积大小不尽相同。在脱发症状出现一段时间后，其病灶有的会出现不同程度的减小，甚至完全消退；有的则会逐渐扩大，延伸到整个头皮。据研究称，有大约2%的人会在一生当中的不同阶段出现AA。AA很可能是由环境、免疫和遗传因素共同引起的疾病，这一结论已经在多对同卵双胞胎中得到验证，并且获得了多代AA成员家庭的认同［5］。

韩国庆熙大学生命科学学院东方药物与加工系的一个研究小组称，人参皂苷F2能够通过2种生物学途径控制细胞凋亡来降低脱发的发病率［6］。人参皂苷F2比鱼肝素抑制毛细胞凋亡的效果更加显著。他们的研究结果表明，人参皂苷F2降低了TGF-β2和SCAP蛋白的表达，这可能与细胞凋亡和进入卡他根有关。他们还发现DHT（二氢睾酮）可以通过减少生长因子TGF-β2来抑制毛发的生长，还能影响Smad-2基因的表达，这些因素以直接调控的方式影响毛细胞的凋亡［7］。

德国研究者表明，PTCH2基因可能被排除为脱 毛X型 的 致 病 因 素［8］。Lothrop和Schmeitzel提出，人类的CAH表型与狗的脱毛X表型具有一定的相似性。有90%~95%的人类CAH病例是由编码类固醇21羟化酶的CYP21A2基因发生突变而引起的。欧洲一些药物研究人员发现药物抑制DGAT1可诱导小鼠和狗的皮脂腺发生萎缩，但却只有小鼠出现明显的脱发［9］，该研究组的结果表明，二酰甘油O-酰基转移酶1（DGAT1）在合成脂类中具有非常重要的作用，但是DGAT1的抑制剂作为治疗代谢性疾病和糖尿病的潜在药物此前已有研究。在小鼠中，延长药物抑制DGAT1和AZD7687的作用，可以与药物抑制DGAT1小鼠产生相同的皮肤表型，包括皮脂腺萎缩和脱发。AZD7687对皮肤的介导有很强的时间依赖性，并且是可逆的，它们仅在持续的DGAT1抑制时发生；长期使用AZD7687对狗进行治疗时也会致使皮脂腺发生萎缩，但不会导致更加严重的脱毛现象。尽管给人类使用的治疗剂量和给小鼠使用的治疗剂量对皮肤产生的影响可能有所不同，但在使用DGAT1抑制剂的临床试验中，监测皮肤变化的工作依然十分重要。

绵羊脱毛症主要受环境因素和基因因素共同影响，本研究主要从基因的因素分析脱毛症的原因。在绵羊1号染色体上的遗传信息量大，存在大量与皮肤、毛囊、生长发育相关的基因，具有经济性状相关的QTL有35个。因此，本论文选择1号染色体作为研究对象，对其上的SNPs进行分析，获得相关的分子标记。通过基因注释找出脱毛症有关的候选基因，在选择选育中控制与减少脱毛症的发病率，对预防和治疗羊的脱毛症具有重要的意义。

1 材料与方法

1.1 试验材料

在伊犁库克图拜种畜场，随机挑选150只中国美利奴羊，分为病例组（50只）和健康组（100只）。样品病理情况调查时间为2006~2016年。

1.2 耳组织采集

用剪耳钳在耳缘处剪下一黄豆大小的组织块，去除掉组织块上的毛和杂物，置于已灭菌的1.5 mL离心管中，编号后放入采样冰盒，送往实验室，保存于-70 ℃的冰箱中备用。

1.3 样品DNA提取

粉碎耳组织，加入2 mL裂解液，摇匀10 min；取出混合液冷却至常温，并向灭菌离心管加入600 μL Tris-HCl饱和酚溶液，将上下轻柔颠倒混匀10 min，于2000 r/min下离心10 min；用剪刀将1 mL枪头尖部剪为直径大小约0.3 cm的圆形，取出600 μL上清液移至新的灭菌离心管，加入1∶1的酚/氯仿溶液600 μL，轻柔摇匀5 min，于2000 r/min下离心10 min；将上层液移至新的灭菌离心管中，加入600 μL氯仿溶液，轻摇5 min后，于2000 r/min下离心10 min；加入冰无水乙醇1 mL，轻摇2 min，可观察到的絮状物即为DNA，于2000 r/min下离心10 min；将TE（pH值7.0）溶液加入灭菌离心管，弹起混匀干燥的DNA，保存于4 ℃冰箱中，直至DNA完全溶解。

1.4 送至生物公司制备芯片及其结果的处理

由生物公司进行Illumina Ovine SNP50 Bead-Chip制备，再由BeadScan Software软件将图像进行转换，形成数据信号，然后再利用Genome Studio软件对基本的数据结果进行处理，可以得到能用来运算的VCF文件，经过PLINK 1.07软件将其转换为MAP和PED文件。

1.5 基因型检测

筛选生物技术公司提供的数据和SNP等位基因频率分析，舍弃非目标SNPs位点。用PLINK 1.07软件对其进行质量控制：排除样品中检出率低于95%的单体样品。同时，排除质量不合格的SNPs，检出率低于90%、最小等位基因频率低于5%、哈代—温伯格平衡检验P值低于1×10-6的SNPs。

1.6 Fst的计算

本研究中，根据无偏估计Fst方法计算留下的SNP位点，获得2个群体的每个SNP位点的群体分化指数Fst值［10］。计算公式如下：

其中，MSG为检测的群体内部位点的误差均方：

MSP是检测的群体之间位点的均方差：

nc为校正后的群体间平均样本大小：

上述公式中，i是总亚群数S的一个群体，i=1，2，3，…，S；PAi是第i个亚群中SNP等位基因A的频率； ni是亚群体i的平均样本大小是各群体中PA的加权平均值，即

本研究的Fst数据计算基于（http：//www.r-project.org/）R语言pegas软件包完成，画图基于R语言ggplot软件包完成。

2 结果与分析

用分光光度计检测所提取的耳组织DNA的浓度和纯度，浓度大于50 ng/μL，纯度OD260/OD280在1.7~2.0之间，OD260/OD230应介于1.8~2.1之间。用0.8%琼脂糖凝胶，验证所提取的耳组织基因组DNA。如图1所示，琼脂糖凝胶电泳检测的条带清晰带型完整，点样孔干净、无污染、没有拖尾现象。可以说明所作电泳检测的DNA没有被蛋白质污染、未发生降解，其检测质量合格，满足高密度基因组芯片制备的条件。

图1 琼脂糖凝胶电泳检测结果

图2中，横轴代表26对常染色体，其图中点的密度大小代表携带遗传信息的多少；纵轴代表Fst值，其高度表示对应染色体上该位点表达的显著程度。阈值线为研究参考线，阈值线上方区域为对研究有意义的位点，阈值线下方区域为舍弃位点。

图2 健康和脱毛症绵羊全基因组分化系数分析（Fst）曼哈顿图及OAR1上Fst值分布情况

对健康组和病例组进行遗传分化系数分析（表1），在1号染色体取前1%的分子标记35个，在这些分子标记附近的基因53个基因，其中有5个基因在基因组上没有被注释。其中影响皮肤发育的基因有GADD45A、MCCC1、MLPH、SSBP3等，已经有文献报道SSBP3与脱毛症相关（表2）。

表1 在2号染色体上健康和脱毛症绵羊全基因组选择信号分析（Fst≥0.251495）

表2 脱毛症相关候选基因及其主要功能

3 讨论

本论文通过对健康组和病例组进行选择信号分析，通过生物软件提取1号染色体，对其进行遗传分化系数分析，获取前1%的SNPs作为分子标记，经过基因注释获得相关基因53个，其中和皮肤毛囊发育相关的基因有4个，分别是GADD45A、GADD45A、MLPH、SSBP3，已报道与脱毛症相关的基因是SSBP3。

GADD45A（Growth arrest and DNA damage inducible alpha）位于绵羊1号染色体45511896~45515027 bp范围内，属于GADD45A基因家族，是DNA损伤修复的重要基因，该基因是抵抗诱导紫外线照射肿瘤的关键基因，在细胞增殖上使GADD45A沉默，能通过p53信号通路。在小鼠上利用通过RT-qPCR测定mRNA的表达情况，结果发现GADD45A沉默，使得肿瘤通过皮肤SCC中的p53信号通路促进了肿瘤细胞的增殖，并减少凋亡、衰老。而经过辐射引起的继发性损伤的潜在机制可能有助于新型靶向药物的开发，在一些文献报道中，GADD45A是一个受辐射和光照在皮肤中上调的基因，GADD45A可能抑制上皮细胞的迁移和增殖。进一步信号通路分析表明，GADD45A过表达能抑制AKT（蛋白激酶B，PKB）及其P38和JNK磷酸化［11］。

MCCC1（Methylcrotonoyl-CoA carboxylase 1）位于绵羊1号染色体上222513107~222566511 bp之间，该基因编码3-甲基巴豆酰辅酶A羧化酶的大亚基可以起到异二聚体的作用。这个基因发生突变可能与3-甲基巴豆酰甘氨酸尿症有关，降低绵羊的免疫力，从而更多地引发疾病，该基因涉及糖酵解、TCA循环、OXPHOS、糖异生、β-氧化和支链脂肪酸代谢等，并且参与皮肤成纤维细胞抗氧化反应、破坏稳态环境，这些都已通过线粒体功能分析得到了证实［12］。

黑素亲和素MLPH（Melanophilin）位于绵羊一号染色体上范围在3540879~3587459 bp之间。家畜不同的被毛颜色与黑色素沉着的种类和数量有关系，黑色素的生产决定被毛颜色的深浅程度。MLPH会影响黑素小体的转运过程，使得家畜毛色发生改变，MLPH基因能使家畜毛色素稀释，从而改变毛色［13］。

有些狗的皮毛颜色较浅，例如银灰色、沙色、棕色等。这些不同的毛色会随着色素基因表达而被稀释，最后会出现脱发和皮肤炎症，形成颜色稀释脱发症（CDA）［14］。CDA是以逐渐脱发为特征，反复被细菌感染次级毛囊形成毛囊炎。黑素体聚集在表皮和毛囊的黑素细胞内，导致毛发中的大黑素体和皮肤出现明显的干燥［15］。

SSBP3（Single Stranded DNA Binding Protein 3）位于绵羊一号染色体上范围在30346126~30511575 bp之间。该基因在角质形成细胞分化中具有重要作用，角质形成细胞中的SSBP3过度表达会导致表皮分化相关基因的活性显著增加。SSBP3在角质形成细胞分化中具有重要作用。角质形成细胞中的SSBP3过表达会显著增加与表皮分化有关基因的表达程度和活性；相反，SSBP3的低表达会降低表皮分化有关基因的表达程度和活性。此外，银屑病和特应性皮炎是由表皮分化和皮肤脱水引起的皮肤病，在基因上表现为SSBP3的表达水平下降。这些结果表明，SSBP3可能通过积极调节角质形成细胞分化的方式与个体的水合皮肤表型相关联［16］。

由于SSBP3的表达程度会影响与表皮分化有关基因的表达程度和活性，受影响的基因会在一定程度上影响表皮分化，推测可能使毛囊的形成与发育受到抑制，从而导致脱毛。此外，银屑病和特应性皮炎是由表皮分化和皮肤脱水引起的皮肤病，在基因上表现为SSBP3的表达程度下降。而近年有报道称银屑病会伴发瘢痕性脱发［17］，据此认为SSBP3的低表达可能会引起脱毛症。故将SSBP3列为羊脱毛症的候选基因。

4 结论

通过遗传分化系数（Fst）分析，在OAR1中获得分子标记35个，在这些分子标记附近的53个基因，其中有5个基因在基因组上没有被注释。其中影响皮肤发育的基因有GADD45A、MCCC1、MLPH、SSBP3等，已经有文献报道SSBP3与脱毛症相关。对获得的分子标记可以为绵羊分子选育提供参考，可以缩短世代间隔和育种年限、节约成本，最终获得免疫力强的健康绵羊，防止绵羊脱毛症的出现，从而减少农牧民的经济损失。