杆菌霉素D合成基因对解淀粉芽孢杆菌B9601-Y2抑菌及定殖玉米能力的影响

卢丽娜，何鹏飞*，何鹏搏，李咏梅，夏梦媛，李兴玉，王跃虎，吴毅歆*，何月秋*

（1.云南农业大学 省部共建云南生物资源保护与利用国家重点实验室，云南 昆明 650201；2.中国科学院 昆明植物研究所 资源植物与生物技术重点实验室，云南 昆明 650201）

解淀粉芽孢杆菌作为一类重要的根际微生物，在其生长代谢过程中会分泌多种抑菌物质［1］，包括脂化类、多烯类、氨基酸类及核酸类等次生代谢物及挥发性物质［2-5］。这些抗菌物质能够有效抑制细菌、真菌及病毒等的生长与增殖，是芽孢杆菌在土壤中抑制病原菌的重要武器［6］。脂肽类抗生素是其中最为常见的一类抑菌化合物。根据化学结构的差异，芽孢杆菌脂肽类抗生素被划分为伊枯草菌素（iturin）家族［7］、表面活性素（surfactin）家族［8］、芬荠素（fengycin）家族［9］以及一些结构未知的环状分子。surfactin对细菌和病毒表现出很强的拮抗活性，具有很强的溶血活性，但是对真菌的拮抗能力较弱［10］。Xiong等［11］发现由Bacillus subtilis JK6产生的surfactin对番茄青枯病原菌具有很强的拮抗活性。fengycin对丝状真菌表现出极强的抑菌活性，但对酵母或细菌没有抗生素活性［12］。iturin在离体环境下拥有很强的抗真菌能力和溶血能力，但是对细菌和病毒的拮抗活性较弱。杆菌霉素D（Bacillomycin D）属于iturin家族，它与iturinA的结构类似，但氨基酸组成不同，也是目前已知的在微生物次生代谢产物中唯一能抑制黄曲霉（Aspergillus flavus）的化合物［13］。脂肽类抗生素除了对病原菌具有直接的拮抗作用外，还参与诱导寄主植物产生抗性、运动性（motility）、生物膜（biofilm）形成，以及芽孢杆菌在寄主植物上的定殖［14］。芽孢杆菌的生防能力与其能否在寄主植物体内以及在其他环境稳定地定殖息息相关。芽孢杆菌在植物体环境的定殖涉及到趋化运动、对寄主植物防卫反应的压制（耐受/逃逸），以及生物膜的形成等诸多环节［15-16］。先前有研究显示杆菌霉素D为贝莱斯芽孢杆菌SQR9的生物膜形成所必需［17］。相关研究结果证实在缺乏surfactin后B. subtilis UMAF 6614不能在甜瓜叶片表面形成复杂的生物膜并且稳定定殖［18］。因此，枯草芽孢杆菌产生的脂肽类抗生素在不同程度上参与了菌株在寄主植物上的定殖过程，研究脂肽类抗生素在枯草芽孢杆菌定殖过程中的作用，有助于深入了解枯草芽孢杆菌的生防机制。虽然有很多研究报道指出脂肽类能够杀菌，但是对其杀菌对象的范围以及作用机理研究并不太多，这严重阻碍了芽孢杆菌的针对性使用；虽然已经认识到杆菌霉素和芬荠素对生物膜的形成很重要，但更多的是停留在室内研究上，缺乏对植物体环境下的生物膜研究。

B9601-Y2（以下简称Y2）是本实验室从小麦根际土壤中分离到的1株解淀粉芽孢杆菌。前期的研究发现此菌株除在盆栽和大田试验中表现出显著的促生、防病效果外，还能够分泌包括杆菌霉素D和芬荠素在内的多种脂肽类物质，但尚未明确这些脂肽类抗生素在Y2发挥植物益生活性中所扮演的角色。为此，本研究通过同源重组敲除Y2染色体内部的杆菌霉素D合成基因，比较观察了脂肽类突变体抗真菌活性的变化，探测了其在小麦近缘作物——玉米及其根际环境的定殖动态，以期为更好地应用此生防细菌及后续工程改造提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 实验材料

1.1.1 供式菌株和培养条件 大肠杆菌（Escherichia coli） DH5α、解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）B9601-Y2-comK（简 称Y2-comK，携带pHT01-comK）、ΔbmyA，以及病原真菌香蕉枯萎病菌（Fusarium oxysporum f. sp. cubensis）均由本实验室构建或分离。

若无特别说明，供试的病原真菌使用PDA平板于28 ℃培养；大肠杆菌和芽孢杆菌置于37 ℃（未）含有抗生素的LB液（固）体培养基中生长，其中液体培养时的转速为160 r/min。Y2的相关突变体均是以Y2-comK为初始菌株构建的，培养时所使用的抗生素种类及其终浓度分别为氯霉素（Chloramphenicol）10 μg/mL、卡那霉素（Kanamycin）30 μg/mL、红霉素（Erythromycin）20 μg/mL及氨苄青霉素（Ampicillin）100 μg/mL。

本研究所使用的质粒pUC19及pMD18-ermR由本实验室保存；绿色荧光蛋白质粒pHAPII由南京农业大学沈其荣教授馈赠。

1.1.2 引物序列的合成 根据NCBI数据库中解淀粉芽孢杆菌Y2的全基因组序列信息（HE77 4679.1），利用软件Primer 5设计出本研究所使用的引物（表1），随后交由上海捷瑞生物工程有限公司合成。

表1 引物序列的情况

1.2 实验方法

1.2.1 Y2杆菌霉素D合成缺陷突变体ΔbmyA的构建 利用酚仿法［19］从Y2菌株的LB过夜培养物中提取Y2-comK的基因组DNA。以Y2-comK基因组DNA为模板，使用引物对bmyA-F/bmyA-R从中扩增出杆菌霉素D（Bacillomycin D）生物合成基因簇基因成员bmyA的部分序列（1.6 kb，中间含有BamHI单一切点）；根据生产厂家的使用说明书，利用胶回收试剂盒（上海生工）回收PCR产物；分别使用EcoRI/XhoI和EcoRI/SalI酶切上述回收的bmyA PCR产物和pUC19，产物经纯化试剂盒纯化后在T4连接酶作用下连接；次日，转化导入大肠杆菌TG1感受态细胞，筛选出含有中间载体pUC19-bmyA的阳性转化子；BamHI单切pMD18-ermR，然后将回收到的红霉素抗性套件（ermR）插入到含有相同黏性末段的pUC19-bmyA内部，获得最终的bmyA敲除自杀型质粒pUBE。

参考前人的实验方法，将敲除载体pUBE导入到Y2-comK的自然感受态细胞内，取适量的菌液涂布于含有红霉素的LB固体平板，在37 ℃下培养16~36 h。利用引物对bmyA-F/R检测抗性转化子的阴阳性，以Y2野生型基因组DNA为对照。此外，还使用HPLC-MS进一步检测转化子杆菌霉素D的合成情况。将最终获得的阳性转化子命名为Y2 ΔbmyA。

1.2.2 Y2及其ΔbmyA突变体生长曲线的测定 将野生型Y2与突变体ΔbmyA分别在LB平板上划线，在37 ℃下培养24 h；待其分别长出单菌落后，挑取少量新鲜单菌落，将其接入50 mL液体LB培养基中，在37 ℃下以160 r/min的转速培养12 h，制成种子液；借助紫外分光光度计，用新鲜无菌液体LB将种子液的浓度统一调整至OD600为1.0；然后按1%的接种比例将种子液分别转接至装有300 mL液体LB培养基的500 mL三角瓶中，在37 ℃下以160 r/min振荡培养；此试验每个处理重复3次。在转接培养后的0~24 h，每隔2 h测定1次溶液的OD600值；在培养后的24~40 h每隔4 h测定1次；在40~124 h每隔12 h测定1次。以吸光值为纵坐标，以培养时间为横坐标，分别绘制Y2野生型与突变体的生长曲线，比较2个生长曲线的差异。

1.2.3 Y2ΔbmyA突变体的HPLC-MS检测 从-80℃冰箱取出Y2野生型及其脂肽类突变体的甘油菌，划线于含相应抗生素的LB琼脂平板，过夜培养。次日，挑取单菌落，接种至含有相应抗生素的LB液体培养基内，在37 ℃下以160 r/min培养24 h。按1∶20的体积比转接入Landy培养基，在30 ℃下以170 r/min培养60 h。参考前人的方法（略有改动），利用酸沉淀法提取解淀粉芽孢杆菌合成的脂肽类化合物，具体操作如下：在4 ℃下以12000 r/min离心10 min，然后收集上清液；利用6 mol/L HCl将上清液的pH值调至2.0，在4 ℃下过夜放置；在4 ℃下以8000 r/min离心20 min，收集沉淀；真空冷冻干燥沉淀，加入甲醇浸提，合并抽提液；甲醇粗提物冷冻干燥后，加入适量体积的甲醇溶解，使用孔径为0.22 μm的滤膜过滤，获得无菌粗提物；使用UltimateAQ-C18色谱柱，进样5 μL，梯度洗脱流速为1 mL/min，柱温为35 ℃，检测波长为210 nm。流动相A和流动相B分别为乙腈和0.5%TFA（三氟乙酸）水溶液。洗脱程序如表2所示。

表2 梯度洗脱程序

1.2.4 Y2ΔbmyA对香蕉枯萎病菌的拮抗活性测定采用平板对峙法观测Y2脂肽类合成缺陷突变体对香蕉枯萎病菌的拮抗活性。利用直径为9 mm的打孔器在生长于PDA平板3 d的尖孢镰刀菌菌落边缘处打取菌饼，随后使用无菌挑针将菌饼转接入PDA平板的中央，使长有菌丝的一面紧贴于PDA培养基。在28 ℃下培养1 d后，在距离菌饼中心2 cm处，使用移液器分别接入1.0 μL Y2ΔbmyA和Y2。在28 ℃下培养5 d后，观测平板上各芽孢杆菌的抑菌情况并拍照。每个菌株重复6次，每个重复1皿。独立重复本试验3次。

1.2.5 Y2-comK及其ΔbmyA突变体的绿色荧光蛋白标记 利用诱导自然转化法［20］向Y2-comK和Y2ΔbmyA导入绿色荧光蛋白表达质粒pHAPII，具体步骤如下：挑取在含相应抗生素的LB固体平板上生长的Y2-comK和Y2ΔbmyA单菌落，分别接种至含氯霉素的LB液体培养基，在37 ℃下以160 r/min振荡过夜培养；按照1∶100的接种比例向GCHE培养基中接入上述细菌的LB过夜培养物，在37 ℃下以160 r/min振摇培养至OD600≈0.6；向GCHE培养基中加入终浓度为0.1 mmol/L的IPTG，在相同条件下继续培养1.5 h，然后在室温下以5000 r/min离心5 min；取适量的上清液悬浮菌体细胞沉淀，加入1 μg质粒pHAPIIDNA，在37 ℃下以75~90 r/min振摇30 min；随后添加适量体积的含亚致死浓度卡那霉素的液体LB培养基，在37 ℃下以160 r/min培养1.5~2.0 h；取适量体积的培养物，均匀涂布于含卡那霉素的LB琼脂平板，在37 ℃下倒扣培养，在光电折射仪下观察抗性转化子的荧光表现，分别命名为Y2-comK-gfpmut3a和Y2ΔbmyA-gfpmut3a。挑取发绿色荧光的抗性菌落，转入含卡那霉素的LB液体培养基振摇培养，随后加入等体积的无菌的40%（体积分数）甘油，混匀后在-80 ℃下保存。

1.2.6 Y2ΔbmyA定殖玉米的动态测定 将玉米种子依次浸泡于1%（体积分数）NaClO中30 s和75%（体积分数）酒精中90 s，以作表面消毒处理，随后用无菌水清洗3~4次。播种表面消毒过的玉米种子于装有无菌育苗基质的培养钵中，直至2片真叶长出。移栽玉米幼苗至预先装有无菌土（300 g/盆）的盆钵中，每盆栽植3株，沿玉米幼苗根系周围土壤浇灌Y2ΔbmyA-gfpmut3a或Y2-comK-gfpmut3a菌体细胞悬浮液（1×107cfu/mL），每盆浇灌50 mL。然后，将盆钵全部移入光周期为16 h光照/8 h黑暗的25 ℃（昼温）/20 ℃（夜温）的光照培养箱内。仿照本实验室前人的操作［21］，在接种后的第3、5、9及15天分别对玉米根系组织取样（3盆/次）并研磨，取适当倍数的稀释液涂布于含卡那霉素的LB固体平板，在37 ℃下培养，直至长出菌落。在光电折射仪下观察并统计荧光菌落的数量。

2 结果与分析

2.1 Y2的ΔbmyA突变体的验证

利用引物对bmyA-F/R对Y2的ΔbmyA基因组DNA进行PCR扩增。琼脂糖凝胶电泳结果显示从突变体扩增出的条带长度明显大于从Y2-comK中扩得的条带长度，超出1.2 kb左右（图1），初步表明Y2体内的bmyA基因被成功地破坏。此株突变体脂肽类粗提取物的LC-MS检测分析结果如图2所示，Y2野生型产杆菌霉素D的质量峰在23.123 min和24.300 min这2个保留时间均检测到m/z 1031.55、1045.56；相较于Y2野生型，突变体Y2ΔbmyA在上述相同保留时间没有检测到m/z 1031.55、1045.56这2个离子信号峰。上述结果进一步表明bmyA被插入破坏，导致Bacillomycin D的生物合成在Y2的ΔbmyA对应缺失。

图1 突变体Y2ΔbmyA的PCR验证结果

图2 Y2-comK、Y2ΔbmyA产杆菌霉素 D 的ESI质谱分析结果

2.2 Y2及Y2ΔbmyA生长曲线的比较

明确bmyA基因敲除后对菌株生长是否存在影响是后续研究的基础。野生型菌株Y2与突变体Y2ΔbmyA生长曲线的比较结果如图3所示，发现脂肽类物质合成缺陷突变体与野生型并没有存在显著差异，生长趋势基本一致，说明敲除bmyA基因并不影响菌株的生长。

图3 Y2与突变体Y2ΔbmyA的生长曲线

2.3 Y2ΔbmyA对尖孢镰刀菌的拮抗活性

通过室内平板对峙培养实验，观测了杆菌霉素D合成缺陷突变体对尖孢镰刀菌的拮抗活性，结果如图4所示，相较于Y2野生型，在接种有Y2ΔbmyA的区域，尖孢镰刀菌菌丝已经与细菌菌落接触并蔓延。野生型的抑菌圈直径为（0.85±0.02）cm，突变体Y2ΔbmyA的抑菌圈直径仅为（0.14±0.03）cm，表明杆菌霉素D的缺失导致突变体对尖孢镰刀菌的拮抗能力下降。

图4 Y2ΔbmyA对香蕉枯萎病菌的拮抗作用

2.4 Y2ΔbmyA在玉米植株及根际土中的定殖动态

从表3可以看出：在处理0~15 d后，在玉米根际土和根系组织中均分离获得了Y2和Y2ΔbmyA；无论是在玉米根际土中还是在根系组织中，Y2-comK-gfpmut3a的定殖密度均显著高于突变体Y2ΔbmyA。对菌株在玉米根际土中定殖量的检测发现，在接种3 d后野生型菌株Y2的定殖量最大，达4.71×103cfu/g（鲜重）；而与野生型菌株相比，Y2ΔbmyA在根际土中的定殖量降低了42.25%。在根系组织中检测发现，在接种5 d后野生型Y2的定殖密度达到最大值4.74×103cfu/g（鲜重）；与野生型菌株相比，Y2ΔbmyA在根系组织中的定殖量降低了16.88%。

表3 Y2和Y2ΔbmyA在玉米根际土及根系组织内的定殖菌量 cfu/g（鲜重）

3 讨论

作为一类重要的生防资源，芽孢杆菌可通过合成抗菌化合物抑制病原真菌来防控病害并促进植物健康。目前报道的与芽孢杆菌生防活性紧密相关的抗菌化合物主要有几丁质酶、1，3-1，4-葡聚糖酶及脂肽类等。其中，脂肽类化合物如芬荠素、伊枯草菌素（含杆菌霉素D）和表面活性素家族被认为是芽孢杆菌拮抗病原、诱导植物系统抗性以及促进生物膜形成的关键因子。许多研究发现由芽孢杆菌分泌的脂肽类分子对包括芸苔根肿菌（Plasmodiophora brassicae）［22］、稻瘟病菌（Magnaporthe grisea）［23］、灰霉病菌（Botrytis cinerea）［24］、苹果环腐病菌（Botryosphaeria dothidea）［25］及镰刀菌（Fusarium sp.）等［26］在内的植物病原真菌具有很强的抑制活性，但关于各种脂肽类抗生素拮抗的病原真菌最佳对象的研究并不多。

本研究通过定点敲除以及后续验证，成功地获得了植物促生根际细菌——解淀粉芽孢杆菌B9 601-Y2的杆菌霉素D突变体。对峙培养实验结果显示杆菌霉素D合成能力的缺失使突变体对香蕉枯萎病菌的抑制能力下降，表明杆菌霉素D可能是Y2抑制尖孢镰刀菌的主要脂肽类物质，这与前人的研究结果［17］一致。值得一提的是，脂肽类抗生素的另一个重要成员——表面活性素在Y2体内先天缺失［27］，但笔者发现与其正常合成表面活性素的近缘解淀粉芽孢杆菌FZB42菌株相比，Y2对尖孢镰刀菌的抑制活性与之相当，暗示表面活性素可能并非芽孢杆菌拮抗尖孢镰刀菌的唯一抗生素。前期也有报道［28］称，贝莱斯芽孢杆菌SQR9的表面活性素参与对核盘菌、立枯丝核菌以及腐皮镰刀菌的拮抗过程，未参与对尖孢镰刀菌的抑制过程。这间接地印证了我们的推测。

本研究还发现，在玉米根系组织内部以及根际土壤中，Y2ΔbmyA的定殖密度均低于其野生型，表明杆菌霉素D的缺失的确影响到了Y2菌体在玉米根系组织及其相关环境中的定殖。但突变体Y2ΔbmyA是否通过破坏生物膜的形成来削弱菌体细胞的定殖能力，仍需要通过原位观察等试验来证实。