内生金黄短杆菌CT-A16的生物学特性及其生防机制研究

袁宗胜

（闽江学院 海洋研究院，福建 福州 350108）

植物内生细菌是指其生活史的一定阶段或全部阶段均生活在健康植物的各种组织和器官内部，并且与植物建立了和谐联合关系的细菌［1］。内生细菌通过自身产生代谢产物或借助信号转导对宿主植物生长发育产生重要影响，主要表现在促进宿主植物生长、增强宿主植物抗性及提高植物修复能力等方面［2-6］，例如，Microbacterium具有促进植物生长的作用［7］，Bacillus具有良好的生防潜力［8］，Sphingomonas对植物有自我修复功能［9］等。内生菌对植物病害的防病作用通过产生抗生素类物质［10］、产生水解酶［11］、产生生长调节剂［12］、内生菌与病原菌竞争营养物质［13］等途径抑制病原菌的生长。

据不完全统计，食用菌生产栽培过程中由于病虫的危害，可导致减产10%~30%，严重时甚至会颗粒无收［14］。防治病虫害最常见的方法就是化学药剂，但是长时间使用单一的化学药剂会使得病虫害的抗性增强和防治效果下降，而且药品的残留量大都会对人的身体健康造成威胁，也会导致严重的环境污染，因而针对病虫害的生物防治近年来受到世界各地的高度重视［15］。国内外研究人员在内生菌对于防治植物病害方面进行了大量的研究，也取得了非常显著的效果。本文选取对主要食用菌病原菌具有较好拮抗效果的内生细菌菌株CT-A16，研究其生物学特性及其对3种食用菌病害的生防机制，为食用菌病虫害的生物防治奠定基础。

1 材料与方法

1.1 供试菌株

1.1.1 内生细菌菌株CT-A16 该菌株由本实验室分离并筛选出，其对主要食用菌病原菌具有较好拮抗效果，初步鉴定为金黄短杆菌。

1.1.2 供试食用菌病原菌 疣孢病菌为疣孢霉（Mycogone perniciosa）；蛛网病菌为葡枝霉（Cladobotryum semicirculare）；油疤病菌为木栖柱孢霉（Scytalidium lignicola）。

1.2 培养基及主要试剂

内生细菌培养采用NA培养基：牛肉膏3 g、蛋白 胨5 g、NaCl 5 g、琼 脂18 g、水1000 mL，pH值7.0~7.2（液体培养基则不加琼脂）。

PDA培养基：马铃薯200 g、琼脂粉20 g、葡萄糖20 g，水1000 mL。

主要试剂：所用试剂均为国产分析纯。

1.3 金黄短杆菌CT-A16的生物学特性

1.3.1 培养特征和形态特征 取供试金黄短杆菌CT-A16接种于NA平板培养基上，28 ℃培养2~3 d，观察菌落颜色和形态，包括菌体形状和芽孢形态等重要鉴别特征。对菌体进行革兰氏染色、芽孢染色、荚膜染色，在显微镜下观察染色结果，细菌形态观察方法参照东秀珠等［16-17］的方法。

1.3.2 最适温度的测定 在洁净试管中加入10 mL NB液体培养基，灭菌冷却后将金黄短杆菌CTA16 按1%接种量接种于液体培养基试管中，分别置于15、20、25、30、35、40 ℃等 6个温度梯度下、180 r/min 振荡培养24 h，以不接种金黄短杆菌CTA16的NB液体培养基作为对照，每个处理3次重复，测定OD600值，以确定其生长的最适温度。

1.3.3 最适pH值的测定 在洁净试管中加入10 mL NB液体培养基，用1 mol/L HCl或1 mol/L NaOH调整液体培养基的初始pH值，使培养基pH值梯度为3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0，每个处理3个重复。接种金黄短杆菌CT-A16于培养基后，在30 ℃下、180 r/min振荡培养24 h，再测定OD600值，以确定其生长的最适pH值。

1.3.4 生长曲线的测定 在洁净试管中加入10 mL NB液体培养基，灭菌冷却后，按1%的接种量接种金黄短杆菌CT-A16，在30 ℃、180 r/min下振荡培养。以开始放摇床振荡培养开始进行第1次取样（零小时取样），测量其OD600值，以后隔2 h定时取样，测定菌液的OD600值。

1.4 金黄短杆菌CT-A16对主要食用菌病害的生防机制

1.4.1 金黄短杆菌CT-A16发酵过滤液的制备 取供试金黄短杆菌CT-A16，分别用无菌接种环挑取单菌落，接种于装液量为100 mL的NB液体培养基的三角瓶中，在28 ℃、180 r/min的条件下培养3 d，再4 ℃，10000 r/min离心15 min，取得上清液。在无菌条件下，经0.22 μm 微孔滤膜过滤后将所得滤液，即为金黄短杆菌CT-A16发酵过滤液。

1.4.2 金黄短杆菌CT-A16发酵灭菌液的制备取供试金黄短杆菌CT-A16，分别用无菌接种环挑取单菌落，接种于装液量为100 mL的NB液体培养基的三角瓶中，在28 ℃、180 r/min的条件下培养3 d，放入高压灭菌锅，121 ℃条件下灭菌30 min，即为金黄短杆菌CT-A16发酵灭菌液。

1.4.3 金黄短杆菌CT-A16发酵过滤液对病原菌菌丝生长的实验设计 采用菌落生长法测定金黄短杆菌CT-A16过滤液的抑菌活性，将上述金黄短杆菌CT-A16过滤液与PDA培养基混合制成混合平板（浓度分别为5%、10%、15%、20%），以不加过滤液的PDA平板为对照。分别在平板中央接入病原菌菌原片，每个处理3次重复，置于28 ℃恒温培养，然后观察病原菌的菌丝生长状况，待对照CK满板时采用十字交叉法测量菌丝直径，并计算相对抑制率。

相对抑制率/%=（对照菌落直径-处理菌落直径）/对照菌落直径×100%

1.4.4 金黄短杆菌CT-A16发酵灭菌液对病原菌菌丝生长的实验设计 采用菌落生长法测定金黄短杆菌CT-A16灭菌液的抑菌活性，将上述金黄短杆菌CT-A16灭菌液与PDA培养基混合制成混合平板（浓度分别为5%、10%、15%、20%），以不加灭菌液的PDA平板为对照。分别在平板中央接入病原菌菌原片，每个处理3次重复，置于28 ℃恒温培养，然后观察病原菌的菌丝生长状况，待对照（CK）满板时采用十字交叉法测量菌丝直径，并计算相对抑制率。

1.4.5 金黄短杆菌CT-A16发酵过滤液对病原菌孢子萌发的实验设计 取上述金黄短杆菌CT-A16过滤液，将过滤液按照20%、40%两个比例与PDA培养基混合，分别制成混合培养基平板。在生长成熟的3个病原菌的培养皿中加入无菌水，收集病原菌孢子，制成孢子悬浮液，然后用移液枪将孢子悬浮液加入上述混合培养基平板上，用涂布棒均匀涂抹。每个处理3次重复，置于28 ℃恒温培养，然后观察病原菌的孢子萌发状况，并计算相对抑制率。

1.4.6 金黄短杆菌CT-A16发酵灭菌液对病原菌孢子萌发的实验设计 取上述金黄短杆菌CT-A16灭菌液，将灭菌液按照20%、40%两个比例与PDA培养基混合，分别制成混合培养基平板。在生长成熟的3个病原菌的培养皿中加入无菌水，收集病原菌孢子，制成孢子悬浮液。然后用移液枪将孢子悬浮液加入到上述混合培养基平板上，用涂布棒均匀涂抹。每个处理3次重复，置于28 ℃恒温培养，然后观察病原菌的孢子萌发状况，并计算相对抑制率。

1.4.7 金黄短杆菌CT-A16挥发性物质对病原菌菌丝生长的影响 将3个病原菌菌株（疣孢病菌、蛛网病菌、油疤病菌）和金黄短杆菌CT-A16分别转接到不同的PDA平板上，并分别在适宜的温度条件下培养2 d后，在无菌条件下去掉平板盖，将接有病原菌的培养皿相对扣合，并用封口膜沿边缘封口，防止挥发性物质漏出。以不接金黄短杆菌CT-A16的PDA平板作为对照，置于28 ℃恒温培养，每个处理3次重复。观察病原菌的菌丝生长情况，并计算相对抑菌率。

1.5 数据统计与分析

数据统计绘图用Excel 2007，数据统计分析采用 DPS V7.05软件的相应分析功能进行。

2 结果与分析

2.1 金黄短杆菌CT-A16的生物学特性

2.1.1 金黄短杆菌CT-A16的培养特征和形态特征 取供试金黄短杆菌CT-A16接种于NA平板培养基上，28 ℃培养3 d，观察到菌落颜色为白色，菌落边缘光滑平整，通过显微镜观察菌体呈短杆状。对菌体进行革兰氏染色、芽孢染色、荚膜染色，结果显示金黄短杆菌CT-A16为革兰氏染色为阳性，无芽孢，有荚膜。

2.1.2 金黄短杆菌CT-A16最适温度的测定 由图1可知，金黄短杆菌CT-A16的OD值随着培养温度的逐步升高而升高，在培养温度为30 ℃时OD值最大。在30~40 ℃时，随着培养温度的增加，OD值呈下降趋势，因此金黄短杆菌CT-A16的最适生长温度为30 ℃。

2.2 金黄短杆菌CT-A16最适pH值

由金黄短杆菌CT-A16最适pH值的测定结果（图2）表明：随着pH值的升高，金黄短杆菌CTA16菌液的OD值逐步升高，待pH值为6时达到最高值，随后OD值随pH值的增加呈下降趋势。即最佳生长pH值为6.0，适宜金黄短杆菌CT-A16生长的pH值范围为5.0~7.0。

图2 不同pH值对金黄短杆菌CT-A16的影响

2.3 金黄短杆菌CT-A16的生长曲线

金黄短杆菌CT-A16生长曲线（图3）的测定结果表明，由金黄短杆菌CT-A16不同时段内的OD值所反映出的生长曲线呈现出阶段性变化。第一阶段为迟滞期：生长16 h内，OD值呈现逐步增长的趋势，增长速度非常缓慢；第二阶段为对数生长期：生长16~36 h内，OD值呈现快速增长趋势，36 h时OD值达到峰值；随后进入稳定期：生长36~40 h（或40 h以后）内OD值不再增加并出现降低现象。综上所述，在测定时间内,内生金黄短杆菌CT-A16的生长阶段为：迟滞期细菌接种至培养基后，对新环境有一个短暂适应过程；对数生长期细菌快速繁殖增长，菌数显著增多，此时期活菌数直线上升，细菌以稳定的几何级数极快增长;第三阶段稳定期培养40 h时内生细菌基本上是处于稳定期的阶段，尚未进入衰退阶段。

图3 金黄短杆菌CT-A16的生长曲线

2.4 金黄短杆菌CT-A16发酵过滤液对病原菌菌丝生长的抑制效果

通过对病原菌菌丝生长情况进行观察，统计不同比例内生金黄短杆菌过滤液对不同病原菌的抑制率（表1），由表1可以看出，内生金黄短杆菌CTA16对病原菌的抑制效果较好，在菌液浓度为20%时，内生金黄短杆菌CT-A16对油疤病菌原菌的抑制效果最好。

表1 不同浓度金黄短杆菌CT-A16过滤液对病原菌菌丝生长的抑制率

2.5 金黄短杆菌CT-A16发酵灭菌液对病原菌菌丝生长的抑制效果

通过对病原菌菌丝生长情况进行观察，统计不同种不同比例内生金黄短杆菌灭菌液对病原菌的抑制率，结果如表2所示，浓度为20%的金黄短杆菌CT-A16灭菌液对油疤病菌的抑制效果最佳，其次是疣孢病菌、蛛网病菌。

表2 不同浓度金黄短杆菌CT-A16灭菌液对病原菌菌丝生长的抑制率

2.6 金黄短杆菌CT-A16发酵过滤液对病原菌孢子萌发的抑制效果

通过对病原菌孢子萌发生长情况进行观察，统计不同比例内生菌过滤液对不同病原菌的抑制率，结果见表3。内生金黄短杆菌CT-A16对于病原菌抑制效果最好的浓度为40%，对疣孢病菌、油疤病菌都能100%地抑制孢子的萌发，对蛛网病菌孢子萌发的抑制效果相对较弱。

表3 不同浓度金黄短杆菌CT-A16过滤液对病原菌孢子萌发的抑制率

2.7 金黄短杆菌CT-A16发酵灭菌液对病原菌孢子萌发的抑制效果

通过对病原菌孢子萌发生长情况进行观察，统计不同比例内生菌灭菌液对不同病原菌孢子萌发的抑制效果，结果见表4。浓度为40%的内生金黄短杆菌CT-A16发酵灭菌液对病原菌的抑制效果最佳，对疣孢病菌和油疤病菌的抑制效果较好。

表4 不同浓度金黄短杆菌CT-A16灭菌液对病原菌孢子萌发的抑制率

2.8 金黄短杆菌CT-A16挥发性物质对病原菌菌丝生长的抑制效果

通过观察病原菌与内生金黄短杆菌CT-A16对接密封的培养皿中病原菌的菌丝生长状况，结果表明：内生金黄短杆菌CT-A16挥发性物质对病原菌菌丝生长具有一定的抑制作用。从表5可以看出，内生金黄短杆菌CT-A16挥发性物质对于油疤病菌、蛛网病菌的抑制效果比较好，对于疣孢病菌的抑制效果相对较弱。

表5 金黄短杆菌CT-A16挥发性物质对病原菌菌丝生长的影响

3 结论与讨论

金黄短杆菌CT-A16的生物学特性测定结果表明，金黄短杆菌CT-A16菌落颜色为白色，菌落边缘光滑平整，通过显微镜观察菌体呈短杆状。对菌体进行革兰氏染色、芽孢染色、荚膜染色，结果显示：金黄短杆菌CT-A16为革兰氏染色为阳性，无芽孢，有荚膜。金黄短杆菌CT-A16进行最适温度为30 ℃，最适pH值为6.0。

由金黄短杆菌CT-A16对3种食用菌病原菌的生防效果可以看出，不同浓度金黄短杆菌CT-A16过滤液和灭菌液对病原菌菌丝生长均具有一定的抑制效果。其中浓度为20%的金黄短杆菌CTA16过滤液对病原菌的抑制效果较好，对疣孢病菌的抑制率达到66.53%，对油疤病菌的抑制率为62.73%，对蛛网病菌的抑制率为83.58%。在不同浓度金黄短杆菌CT-A16过滤液和灭菌液对病原菌孢子萌发的测定中发现，浓度为40%金黄短杆菌CT-A16对于3个病原菌的抑制效果都非常明显；金黄短杆菌CT-A16的挥发性物质对病原菌菌丝生长也表现出一定的抑制作用。

内生菌对植物病害的生物防治已研究多年并取得了很好的应用效果，何红等［18］也证实了分离自辣椒的内生芽孢杆菌对辣椒炭疽病菌有拮抗活性。用植物内生的枯草芽孢杆菌处理辣椒苗，然后再接种病原菌，能够将发病率降低81.49%~93.34%。内生菌的拮抗效果除了在实验室的抑菌效果测定外，还需要在大生产过程中的实际应用，以进一步验证内生菌的拮抗效果，这将是今后内生细菌的研究热点。