解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)XZ-1发酵条件的优化

杨冬静,赵永强,孙厚俊,张成玲,徐 振,谢逸萍

(江苏徐淮地区徐州农业科学研究所/中国农业科学院 农业部甘薯生物学与遗传育种重点实验室,江苏 徐州 221131)

解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)XZ-1发酵条件的优化

杨冬静,赵永强,孙厚俊,张成玲,徐 振,谢逸萍*

(江苏徐淮地区徐州农业科学研究所/中国农业科学院 农业部甘薯生物学与遗传育种重点实验室,江苏 徐州 221131)

采用单因素试验和正交试验,对解淀粉芽孢杆菌菌株XZ-1的发酵培养基成分和发酵条件进行了优化。结果表明：XZ-1的发酵培养基的最佳碳源、氮源和无机盐分别为糊精、蛋白胨和氯化钾；其培养基最佳组分为糊精10 g/L,蔗糖5 g/L,蛋白胨10 g/L,氯化钠7 g/L;最佳发酵培养条件为培养基初始pH值6,发酵温度27 ℃,发酵时间36 h,装液量100 mL/250 mL,接种量3%,转速150 r/min。

解淀粉芽孢杆菌;单因素试验;正交试验;发酵条件;优化

Abstract： The fermentation medium components and fermentation conditions forBacillusamyloliquefaciensstrain XZ-1 were optimized through single-factor test and orthogonal test. The results illustrated that the optimal carbon source, nitrogen source and inorganic salt in fermentation medium for XZ-1 were dextrin, peptone and potassium chloride, respectively. The best medium components included dextrin 10 g/L, sucrose 5 g/L, peptone 10 g/L and sodium chloride 7 g/L. The optimized fermentation conditions were initial pH-value 6 for medium, fermentation temperature 27 ℃, fermentation time 36 h, liquid medium volume 100 mL/250 mL, inoculum size 3%, and rotate speed 150 r/min.

Keywords：Bacillusamyloliquefaciens; Single-factor test; Orthogonal test; Fermentation condition; Optimization

随着我国经济的高速发展、人们生活水平的不断提高,人们的消费观念已经逐渐转变,对农业生产从单纯追求高产,到今天已经在追求优质安全。由于化学药剂防治带来的环境污染、农药残留严重影响了人类的健康,因此生物防治以其无毒、无残留、对环境友好等优势吸引了国内外大量植保科研工作者的注意。其中,解淀粉芽孢杆菌是众多生防菌种中的一种,是自然界中广泛存在的一种细菌,它繁殖迅速,对人畜无毒无害,与环境友好,且可产生芽孢并由此具有较强的耐逆性[1]。已有的研究结果表明,解淀粉芽孢杆菌与枯草芽孢杆菌亲缘关系很近,可产生脂肽类和蛋白类抗菌物质,具有广谱抗细菌和抗真菌活性[2-3],已得到广泛的生产和应用,如德国ABiTEP GmbH 公司已将解淀粉芽孢杆菌BacillusamyloliquefaciensFZB42登记并产业化[4]。此外,解淀粉芽孢杆菌还能提高植物的抗盐能力,如Chen等(2017)研究表明解淀粉芽孢杆菌菌株SQR9通过产生亚精胺可诱导拟南芥和玉米产生抗盐性[5]。可见,解淀粉芽孢杆菌已成为农作物安全生产的重要资源之一。

本课题组从江苏省徐州市铜山区班井村甘薯种植地分离筛选出解淀粉芽孢杆菌菌株XZ-1,该菌株具有广谱抗真菌活性,对草莓炭疽病菌、丝瓜炭疽病菌、甘薯干腐病菌、小麦全蚀病菌、大豆菌核病菌、大蒜叶枯病菌、甜瓜枯萎病菌以及小麦纹枯病菌等病原真菌均有较强的拮抗活性(另文发表)。鉴于此，我们采用单因素试验设计和正交试验设计,进一步对解淀粉芽孢杆菌XZ-1开展了发酵培养基及发酵条件的优化研究,以期为该菌株的大规模生产应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1供试菌株

解淀粉芽孢杆菌XZ-1从江苏省徐州市铜山区班井村甘薯根际土壤中分离,经本课题组筛选鉴定后保存于-20 ℃冰箱中待用。

1.2培养基

牛肉膏蛋白胨(NB)培养基:牛肉膏3.0 g,蛋白胨10.0 g,葡萄糖2.5 g,蒸馏水1000 mL,用于XZ-1活化以及发酵液的制备;该培养基于121 ℃下高压蒸汽灭菌20 min,备用[6]。

1.3菌体生物量的测定

采用酶标仪(Thermo Multiskan GO, USA),取300 μL发酵液于酶标板中,以液体培养基为对照,测定OD600值；以OD600值作为判断菌体生物量大小的标准,若OD600值越大则菌量越大[7]。

1.4培养基成分的优化

碳源:分别用5 g/L的蔗糖、可溶性淀粉、麦芽糖、柠檬酸、木糖和糊精替代NB发酵培养基中的葡萄糖,制成培养基进行发酵培养。分别取50 μL种子发酵液，接种到各种含不同碳源的液体培养基中,在250 mL三角瓶中装液体培养基的量为150 mL,在28 ℃、180 r/min转速下培养24 h后取出,用酶标仪测定OD600值；每个处理3次重复,筛选出最佳碳源。

氮源:分别用10 g/L的蛋白胨、尿素、NH4Cl、酵母提取物、NH4NO3、(NH4)2SO4和酵母膏代替NB培养基中的蛋白胨和牛肉膏,其他接种、培养和测定方法同上；每个处理3次重复,筛选出最佳氮源。

无机盐:分别在NB培养基中加5 g/L的氯化钠、氯化钾、氯化镁、氯化钙、硫酸锌、硫酸铜和硫酸铁,其他接种、培养和测定方法同上；每个处理3次重复,筛选出最佳无机盐。

多因素正交试验:尽管以氯化钾为无机盐条件下发酵液的OD600值显著高于以氯化钠为无机盐条件下的,但是市场上氯化钾的价格约为氯化钠价格的2倍,因此考虑到生产成本问题,笔者在单因素试验筛选出最佳碳源糊精和蔗糖、最佳氮源蛋白胨以及无机盐氯化钠的基础上，采用如表1所示的L9(34)正交表进行培养基优化试验,培养基pH值为7.0,发酵温度为28 ℃,在转速为180 r/min的摇床中振荡培养24 h,每个处理3次重复，以OD600值分析4因素3水平对菌体生物量的影响,以确定最佳的培养基配方[8]。

1.5发酵条件的优化

培养基初始pH值:在优化得到的培养基的基础上,分别对培养基初始pH值、发酵温度、发酵时间、装液量、接种量以及转速进行进一步的优化。用0.1 mol/LHCl和0.1 mol/L NaOH将培养基的初始pH值分别调成5、6、7、8、9、10,每个处理装液量为150 mL,然后接种50 μL种子发酵液,在转速180 r/min、发酵温度28 ℃条件下培养24 h，最后测定OD600值。发酵温度设置21、24、27、30、34、37 ℃;发酵时间设置12、36、48、60、72、96 h;装液量设置在250 mL三角瓶中分别装培养基50、75、100、125、150、175 mL;按体积分数将接种量设置为1%、3%、5%、7%、9%、10%;转速设置90、120、150、180、210、240 r/min。在其他条件不变的情况下，改变某一发酵条件进行试验,分别测定和记录OD600值,每组试验重复3次[9]。

表1 L9(34)正交试验设计

1.6数据统计分析

采用Excel软件处理数据和作图,采用生物统计分析软件DPS进行差异显著性分析。

2 结果与分析

2.1培养基成分的筛选

由图1可见：在供试的7种碳源中,当以糊精作为碳源时XZ-1的生长量最大,其发酵液的OD600值达到0.662；在其他碳源条件下XZ-1的生长量从大到小依次为蔗糖0.642、麦芽糖0.387、葡萄糖0.332、木糖0.318、柠檬酸0.210和可溶性淀粉0.177。由于以蔗糖作为碳源时XZ-1发酵液的OD600值与以糊精为碳源时的没有极显著差异,因此考虑用糊精和蔗糖作为复合碳源。

图中不同大写字母表示1%极显著差异。

从图2可以看出：在供试的7种氮源中,当以蛋白胨作为氮源时XZ-1的生长量最大,其OD600值高达0.825,极显著高于其他6种氮源条件下XZ-1的生长量；在其他6种氮源下XZ-1发酵液的OD600值从大到小依次为酵母提取物0.802、酵母膏0.579、硫酸铵0.335、氯化铵0.299、硝酸铵0.275、尿素0.242,因此,选择以蛋白胨作为最佳氮源。

图2 不同氮源对解淀粉芽孢杆菌XZ-1生长的影响

由图3可见：在供试的7种无机盐中,当以氯化钾和氯化钠作为无机盐时,XZ-1的生长量居前两位,其OD600值分别为0.743和0.702;在硫酸铁、氯化镁和氯化钙作为无机盐的条件下,XZ-1的生长量其次,其OD600值分别为0.581、0.578和0.548;硫酸锌和硫酸铁则显著抑制XZ-1的生长。结合考虑生产成本,我们选择氯化钠作为无机盐进行后续的正交试验。

图3 不同无机盐对解淀粉芽孢杆菌XZ-1生长的影响

2.2优化培养基成分的正交试验结果

以从2.1中筛选出的糊精(或蔗糖)、蛋白胨和氯化钠分别作为最佳碳源、氮源和无机盐,按照表1的设计进行优化培养基成分的正交试验。由表2和表3可见,不同水平的糊精对XZ-1的生长量有一定的影响,具体表现为糊精的浓度越高,XZ-1的生长量越低,极差为0.099;不同水平的蔗糖对XZ-1的生长量也有一定的影响,随着蔗糖浓度从5 g/L增加到10 g/L,XZ-1的生长量逐渐增加,但是随着蔗糖浓度从10 g/L进一步增加到15 g/L,XZ-1的生长量反而下降,极差为0.071;不同水平的蛋白胨对XZ-1生长量的影响也表现为先升后降,极差为0.065; XZ-1的生长量随着氯化钠浓度的增加而增加,极差为0.130。结合正交试验结果,认为菌株XZ-1的发酵培养基的最适成分为:糊精10 g/L、蔗糖5 g/L、蛋白胨10 g/L和氯化钠7 g/L。

表2 优化发酵培养基组分的正交试验统计结果

注：括号外为各因素的水平值，括号内为各因素的实际值(g/L)。

表3 培养基组分正交试验评价结果(发酵液OD600值)

2.3XZ-1培养条件的优化

2.3.1 培养基的初始pH值 从图4-1可见：在初始pH值为5、6时,XZ-1菌株的生长量居前2位；在pH值为6时,XZ-1发酵液的OD600值达到0.830,极显著高于其他pH条件下的；随着pH在6～10范围内逐渐增加,发酵液的OD600值逐渐下降；当培养基初始pH值达到9以上时,该菌株的生长量极低。因此,可将发酵培养基的初始pH值调节在6左右。

2.3.2 培养温度 从图4-2可以看出：当培养温度为27 ℃时,XZ-1的生长量极显著高于其他温度下的；XZ-1在其他几个温度下的发酵液生长量表现为30 ℃>24 ℃>34 ℃>21 ℃>37 ℃。所以,该菌株最佳的发酵温度为27 ℃。

2.3.3 培养时间 图4-3表明：XZ-1菌株在培养时间为12～36 h时,其发酵液的OD600值显著升高,当摇培36 h时发酵液的OD600值高达1.172;当继续增加摇培时间时,菌株的生长量逐渐下降。由此推测该菌株从36 h之后逐渐进入生长衰退期,因此,我们认为该菌株的最佳发酵时间为36 h。

2.3.4 装液量 不同装液量的试验结果如图4-4所示,在250 mL三角瓶中,XZ-1的生长量起初随着装液量的增加而增加,当装液量达到100 mL时,XZ-1发酵液的OD600值最高,为0.923;此后随着装液量继续增加,XZ-1发酵液的OD600值逐渐下降。说明XZ-1的生长对通气量有一定的要求,通气量过大或过小都不利于该菌株的生长。由此,我们认为XZ-1的最佳装液量为在250 mL三角瓶中装液100 mL。

2.3.5 接种量 XZ-1的生长也在一定程度上受接种量的影响,结果如图4-5所示,当接种量从1%增加到3%时,XZ-1发酵液的OD600值逐渐上升,当接种量为3%时,XZ-1发酵液的OD600值达到最高(0.829);此后随着接种量的继续增加,XZ-1发酵液的OD600值逐渐下降。因此我们认为XZ-1的最佳接种量为3%。

2.3.6 转速 从图4-6可以看出,摇床的转速对XZ-1的生长有较大的影响,当转速低于150 r/min 时,该菌株的生长量较小;当转速在150 r/min时,该菌株的生长量达到峰值,其发酵液的OD600为0.860;当转速继续升高后,其OD600值又逐渐下降。因此,XZ-1的最适转速为150 r/min。

图4 不同发酵条件对解淀粉芽孢杆菌生长的影响

3 讨论与结论

发酵培养是生防菌应用推广的工业基础,而发酵技术是制备生物产品的重要手段,其中发酵培养基成分、发酵液的溶氧量、发酵液的pH值、发酵时间以及摇床转速等多种因素对发酵产品均有较大的影响。近年来，关于生防菌株发酵培养基成分以及发酵条件优化的研究报道有很多[10,13],其中关于解淀粉芽孢杆菌发酵条件优化的报道也不少,如洪鹏等(2013)研究发现葡萄糖和蔗糖为解淀粉芽孢杆菌菌株HF-01生长的最佳碳源,有机氮源有利于该菌株菌体的生长，而铵态氮源不利于该菌体的生长,其最适pH值为6.0～ 6.5,最适发酵时间为48 h[14];章小洪等(2012)研究发现解淀粉芽孢杆菌菌株BW-13的最佳碳源为玉米粉,最佳氮源为蛋白胨,最佳金属离子为Mn2+,发酵液最佳pH值为5.0,最佳装液量为30 mL/250 mL,最佳接种量为4%,最佳发酵温度为28 ℃,最佳转速为200 r/min,最佳发酵时间为144 h[15]。据卢彩鸽等(2015)报道，解淀粉芽孢杆菌菌株MH71的最佳发酵培养基组成成分为玉米粉36.6 g/L,葡萄糖14.0 g/L,牛肉膏3.2 g/L,蛋白胨7.0 g/L, NaCl 1.33 g/L, K2HPO40.8 g/L, MgSO4·7H2O 0.4 g/L, CaCO38.0 g/L；其最佳发酵条件为发酵温度30 ℃,转速200 r/min,培养基初始pH值7.0,最佳接种量3%,最佳装液量100 mL/500 mL,最佳发酵时间72 h[16]。这些结果与本研究得出的部分结果有所差异,可见,由于菌株的来源不同,菌株本身的生物学特性存在差异,其发酵培养条件不能一概而论。因此,选择适合菌株本身生长的培养基成分和发酵条件,有利于增加菌体产量,使菌株的生防潜力得到充分的发挥。

本文采用单因素试验设计和正交试验设计方法,对解淀粉芽孢杆菌菌株XZ-1的发酵培养基配方和发酵条件进行了优化,结果表明：XZ-1发酵培养基的最佳碳源为糊精,最佳氮源为蛋白胨,最佳无机盐为氯化钾；最佳培养基组分为糊精10 g/L,蔗糖5 g/L,蛋白胨10 g/L,氯化钠7 g/L; XZ-1的最佳发酵条件为培养基初始pH值6,发酵温度27 ℃,发酵时间36 h,装液量100 mL/250 mL,接种量3%,转速150 r/min。

此外,受环境和不同发酵条件的影响,生防菌的抑菌能力往往存在较大的差异。下一步我们还将开展不同发酵培养基成分以及不同发酵条件对XZ-1发酵液抑菌活性的影响研究,为该生防菌株的开发应用提供理论依据。

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(责任编辑:黄荣华)

OptimizationofFermentationConditionsforBacillusamyloliquefaciensStrainXZ-1

YANG Dong-jing, ZHAO Yong-qiang, SUN Hou-jun, ZHANG Cheng-ling, XU Zhen, XIE Yi-ping*

(Xuzhou Institute of Agricultural Sciences in Xuhuai Area in Jiangsu / Key Laboratory of Sweet Potato Biology and Genetic Improvement of Agricultural Ministry, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Xuzhou 221131, China)

S482.292

A

1001-8581(2017)10-0035-05

2017-06-02

国家现代农业产业技术体系建设专项(CARS-11-B-09)。

杨冬静(1983─),女,四川射洪人,助理研究员,硕士,主要从事植物病理学研究。*通讯作者:谢逸萍。