一株多粘类芽孢杆菌Paenibacilluspolymyxa对甘薯黑斑病的生物防治效果及作用机理初探

王 波,周涧楠,黄忠勤,丁震乾,常 勇,苏在兴,周兴根

(江苏徐淮地区徐州农业科学研究所,江苏 徐州 221131)

一株多粘类芽孢杆菌Paenibacilluspolymyxa对甘薯黑斑病的生物防治效果及作用机理初探

王 波,周涧楠,黄忠勤,丁震乾,常 勇,苏在兴,周兴根*

(江苏徐淮地区徐州农业科学研究所,江苏 徐州 221131)

XZ-2是本课题组分离到的一株大豆内生多粘类芽孢杆菌。探索了该菌株对甘薯黑斑病的生物防治效果及其作用机理。研究结果表明：与清水对照相比，用XZ-2发酵原液的10～100倍稀释液处理贮藏期薯块，可以极显著地减小黑斑病病斑体积；在所有处理中，以XZ-2发酵原液的10倍稀释液对甘薯黑斑病的防治效果最佳,达73.62%；XZ-2发酵滤液处理对甘薯黑斑病菌的菌丝形态没有明显的影响，但会导致该病菌菌丝产生厚垣孢子，且显著地抑制其分生孢子的萌发。

多粘类芽孢杆菌;甘薯；黑斑病;生物防治效果；作用机理

Abstract：PaenibacilluspolymyxaXZ-2 is a biological control strain isolated from the healthy soybean plants. The biocontrol efficacy of XZ-2 against black rot of sweet potato and its action mechanism were explored. The results showed that: in comparison with the control (pure water), treating the stored sweet potatoes with the 10～100-fold diluent of XZ-2 fermentation broth could very significantly reduce the scab volume of black rot; among all treatments, the 10-fold diluent of XZ-2 fermentation broth had the best control efficacy against black rot of sweet potato, reaching 73.62%; the treatment with the diluent of XZ-2 fermentation broth had no obvious influence on the hyphal morphology of sweet potato black rot pathogen (Ceratocystisfimbriata), but it could cause the generation of chlamydospores, and could significantly inhibit the germination of conidia of this pathogen.

Keywords：Paenibacilluspolymyxa; Sweet potato; Black rot; Biocontrol efficacy; Action mechanism

多粘类芽孢杆菌Paenibacilluspolymyxa是一种能产生芽孢的革兰氏阳性菌,该菌对人畜无致病性。多粘类芽孢杆菌可产生多种抗菌蛋白[1-2]、多粘菌素[3]、核苷类[4]、酚类[5]以及吡嗪类化合物[6]等抗菌物质以及IAA等植物生长调节剂[5]。近年来,有关多粘类芽孢杆菌用于植物抗病和植物促生等方面的研究报道很多,如Hong等(2016)报道了一株植物根围促生菌多粘类芽孢杆菌菌株AC-1可抑制PseudomonassyringaeDC3000的生长并在拟南芥叶片中成功定殖,还可诱导PR-1、FRK1等抗病相关基因的表达[7];Kim等(2016)将根围拮抗细菌多粘类芽孢杆菌菌株APEC128用于苹果炭疽病的防治,其对该病的抑制率高达83.6%[8];Adhikari等(2017)首次将多粘类芽孢杆菌等两种生防菌用于温室西瓜生产中毁灭性种传病害细菌性果斑病的防治,结果表明这两种菌株可以显著提高西瓜总叶绿素含量、植株重量、总鲜重以及总干重[9];Hao等(2017)对一株具有固氮能力的可作为潜在生物肥料的多粘类芽孢杆菌WLY78用gfp基因标记后,发现该菌可在黄瓜和玉米的根、茎、叶等组织中大量定殖[10];Mei等(2014)报道了一株产IAA的多粘类芽孢杆菌菌株可诱导黄瓜的抗病性，提高抗氧化酶活性，并促进黄瓜的生长[11];Zhou等(2016)报道多粘类芽孢杆菌菌株BFKC01可以通过调控根系相关基因的表达来促进拟南芥的铁吸收能力[12];Shi等(2017)发现多粘类芽孢杆菌菌株NSY50通过调控黄瓜根围微生物群落使寄主植物受镰刀菌侵染而发病的几率降低了56.4%[13]。多粘类芽孢杆菌由于其广泛的用途已经被我国农业部列为免做安全鉴定的一级菌种。

甘薯黑斑病(black rot)是我国北方薯区三大重要病害之一,每年造成甘薯产量损失5%～10%。近年来,由于高温高湿天气增多,江淮薯区甘薯黑斑病迅速蔓延,造成的经济损失高达50%左右。该病的病原物甘薯长喙壳菌(CeratocystisfimbriataEllis et Halsted)属子囊菌亚门、长喙壳属真菌,可为害甘薯幼苗的茎基部，还能侵染甘薯块根组织[14],且薯块感染黑斑病后产生的黑疱霉酮等有毒物质可导致人畜食用后中毒[15]。目前,国际上有关甘薯黑斑病防控的相关研究报道极少,Hong等[16]在2016年首次报道了一株红球菌KB6可提高甘薯对黑斑病的抗性;而我国目前尚未见甘薯黑斑病的生防菌株筛选及其应用的相关报道。因此甘薯黑斑病的绿色防控已成为甘薯植保工作者面临的重要课题之一。本课题组从健康大豆植株中分离筛选鉴定获得一株具有广谱抗真菌活性的多粘类芽孢杆菌菌株XZ-2,已有的研究表明XZ-2对甘薯黑斑病菌的平板拮抗活性很强,平均抑菌直径高达35.6 mm[17]。本文进一步测定了XZ-2对贮藏期甘薯黑斑病的防治效果,并对该菌株的作用机理进行了初步探索,以期为甘薯黑斑病生防菌剂的开发应用奠定基础,为甘薯黑斑病的绿色防控提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1供试材料

1.1.1 生防菌株 多粘类芽孢杆菌菌株XZ-2由本课题组分离筛选自江苏省徐州市铜山区班井村大豆健康植物,经过纯化后采用甘油保存于-20 ℃冰箱。

1.1.2 供试病原菌 供试病原菌甘薯黑斑病菌由南京农业大学杀菌剂组赠送并保存于4 ℃冰箱。

1.1.3 培养基 采用PDA培养基(土豆20 g/L,葡萄糖20 g/L,琼脂粉15 g/L,水1000 mL)培养甘薯黑斑病菌;采用LBA培养基(胰蛋白胨10.0 g/L,酵母提取物5.0 g/L,氯化钠10.0 g/L)活化多粘类芽孢杆菌,采用LB液体培养基制备多粘类芽孢杆菌菌株XZ-2的发酵液。将配制的各类培养基于121 ℃下高压灭菌20 min，备用。

1.2多粘类芽孢杆菌XZ-2对薯块黑斑病的防治

1.2.1 薯块的准备 收获徐32的甘薯，将其入库，经高温愈合后,选取无病虫害、大小适中的薯块,将薯块洗净晾干后,用75%酒精消毒并自然晾干,待用。

1.2.2 实验方案设计 共设置5个处理：处理1，清水对照;处理2，XZ-2发酵原液的10倍稀释液;处理3，XZ-2发酵原液的50倍稀释液;处理4，XZ-2发酵原液的100倍稀释液;处理5，多菌灵1600倍稀释液。每个处理供试3个薯块，用孢子悬浮液接种准备好的薯块。

1.2.3 薯块黑斑病菌的接种 参考赵永强等(2011)[18]的方法制备黑斑病菌的孢子悬浮液,用无菌接种针(针头长度为0.5 cm)蘸取孢子悬浮液接种；将已接种黑斑病菌的薯块装入已消毒的周转箱中,加盖消毒纱布保湿；将周转箱置于约为26 ℃的恒温室中,每天往保湿纱布上喷水。待培养10 d左右,切开薯块测量病斑直径和深度,计算病斑体积和防治效果,相关计算公式如下:病斑体积V=1/2×π×h×(d/2)2;防治效果(%) =(对照薯块的病斑体积-处理薯块的病斑体积)/对照薯块的病斑体积×100%。

1.3多粘类芽孢杆菌XZ-2对黑斑病菌菌丝形态以及产孢类型的影响

从XZ-2拮抗黑斑病菌的平板菌落边缘挑取少量菌丝,置于加水的载玻片上,盖上盖玻片,在倒置显微镜(Leica DMILLED, Germany)下观察菌丝形态以及产孢情况,并于40倍物镜下拍照。从未经XZ-2发酵液处理的黑斑病菌平板中挑取菌落边缘的菌丝，作为对照。

1.4多粘类芽孢杆菌XZ-2发酵滤液对黑斑病菌孢子萌发的抑制作用

用22 μm孔径的无菌滤器过滤XZ-2发酵滤液，获得无菌滤液；将黑斑病菌平板中的孢子洗脱并镜检以后,取500 μL孢子悬浮液加入盛有20 mL XZ-2发酵滤液的灭菌平板中,将处理好的平板置于28 ℃恒温生化培养箱中培养，6 h左右后取出,采用上述倒置显微镜观察孢子的萌发情况,并于40倍物镜下拍照记录。以经灭菌水处理的孢子作为对照。

1.5数据分析

采用DPS v.7.05软件对实验数据进行方差分析,应用Duncan氏新复极差法进行统计分析。

2 结果与分析

2.1多粘类芽孢杆菌XZ-2发酵液对薯块黑斑病的防治效果

在接种培养10 d后，取出薯块并拍照，结果如图1所示：经XZ-2 3种不同稀释倍数的发酵液处理的薯块的表面病斑直径均显著小于对照薯块的；经对照化学药剂多菌灵1600倍稀释液处理的薯块的表面病斑直径大于经XZ-2不同稀释倍数的发酵液处理薯块的。

从左到右依次为用清水、XZ-2 10倍稀释液、XZ-2 50倍稀释液、XZ-2 100倍稀释液和多菌灵1600倍稀释液接种处理后的薯块。

图1XZ-2发酵液对薯块黑斑病的生物防治效果

进一步计算各处理的病斑体积和防治效果并采用软件进行统计分析,结果(表1)表明：经清水处理的薯块病斑体积高达35.08 mm3,而经XZ-2发酵原液10倍、50倍、100倍稀释液处理的薯块的病斑体积分别仅有9.27、23.17、17.27 mm3,与清水对照的差异均达到了极显著水平；经XZ-2发酵原液10倍稀释液处理的薯块的病斑体积显著小于经XZ-2发酵原液50倍、100倍稀释液处理薯块的；经多菌灵1600倍液处理的薯块的病斑体积为26.00 mm3,与对照的病斑体积呈显著性差异,与100倍XZ-2发酵稀释液处理的病斑体积呈显著性差异,与10倍XZ-2发酵稀释液处理的病斑体积呈极显著性差异；XZ-2发酵原液10倍稀释液的防治效果最佳,达73.62%，极显著高于50倍XZ-2发酵稀释液和多菌灵1600倍液处理的防效；对照药剂多菌灵1600倍液的防效仅为23.99%。

表1 XZ-2发酵液对甘薯黑斑病的生物防治效果

注:同列数据后附不同小写字母表示经Duncan氏新复极差法检验处理间差异显著(P<0.05);附不同大写字母表示差异极显著(P<0.01)。

2.2多粘类芽孢杆菌XZ-2发酵液对黑斑病菌菌丝形态的影响

由图2可见, 菌株XZ-2的发酵液对甘薯黑斑病菌的菌丝形态没有明显的作用。说明该菌株对黑斑病菌的拮抗机制并不是抑制菌丝生长或者导致菌丝极性改变或者导致菌丝畸形。

2.3多粘类芽孢杆菌XZ-2发酵液对黑斑病菌菌丝产孢的影响

进一步通过显微镜观察,发现菌丝产孢类型发生了明显改变,如图3所示,左图中未经XZ-2处理的菌丝产生的孢子主要为分生孢子,而右图中经XZ-2处理后的菌丝产生的孢子大约50%为分生孢子,另外50%为厚垣孢子。

左图为对照;右图为XZ-2发酵液处理。

2.4多粘类芽孢杆菌XZ-2发酵滤液对黑斑病菌孢子萌发的抑制

培养6 h后，经灭菌水处理的黑斑病菌孢子已正常萌发长出芽管,而经过XZ-2发酵滤液处理的黑斑病菌孢子并未萌发,如图4所示,表明XZ-2发酵滤液可显著抑制黑斑病菌孢子的萌发。

左图为灭菌水处理;右图为XZ-2发酵液处理。

3 小结与讨论

3.1小结

本实验结果表明：与清水对照相比，用多粘类芽孢杆菌XZ-2发酵原液的10～100倍稀释液处理贮藏期薯块，可以极显著地减小黑斑病病斑体积；在所有处理中，以XZ-2发酵原液的10倍稀释液对甘薯黑斑病的防治效果最佳,达73.62%；XZ-2发酵滤液处理对甘薯黑斑病菌的菌丝形态没有明显的影响，但会改变该病菌菌丝的产孢类型，显著抑制其孢子的萌发。因此,推荐使用10倍XZ-2发酵稀释液防治贮藏期甘薯黑斑病。

3.2讨论

据报道[19]，生防菌株对作物病原菌菌丝具有致畸、改变菌丝生长极性以及抑制孢子萌发等作用。本研究发现，菌株XZ-2发酵液处理并未对黑斑病菌菌丝的形态产生明显的影响。这与其他的报道有所不同,可能是由于各生防菌株的来源不同,产生的拮抗活性物质类型不同,其作用机理也有所差异。但是, XZ-2在很大程度上影响了黑斑病菌的产孢类型,经XZ-2处理后的黑斑病菌产生的孢子中有一半左右为厚垣孢子,厚垣孢子具有厚壁,需要经过一段时间休眠后才可萌发,这在很大程度上影响了该病菌的无性繁殖,降低了该病菌的生长速度；但是厚垣孢子同时也具有抗逆性强的特点,在条件适宜的情况下还可再次萌发生长。这可能也是黑斑病菌与该多粘类芽孢杆菌相互作用的机制之一。

本文证明了多粘类芽孢杆菌XZ-2对贮藏期甘薯黑斑病具有很好的防治效果。XZ-2是从大豆植株中分离得到的,而该菌株能否在甘薯体内定殖？能否诱导甘薯抗病相关蛋白基因的表达？能否调控甘薯根围微生物群落？这些问题尚不清楚,有待以后进一步研究。

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(责任编辑:黄荣华)

BiocontrolEfficacyofAPaenibacilluspolymyxaStrainagainstBlackRotofSweetPotatoandItsActionMechanism

WANG Bo, ZHOU Jian-nan, HUANG Zhong-qin, DING Zhen-qian,CHANG Yong, SU Zai-xing, ZHOU Xing-gen*

(Xuzhou Institute of Agricultural Sciences in Xuhuai Area in Jiangsu, Xuzhou 221131, China)

S482.292

A

1001-8581(2017)10-0040-04

2017-06-13

教育部农作物生物灾害综合治理重点实验室/农业部华东作物有害生物综合治理重点实验室开放基金项目;优质多抗超 高产麦稻新品种徐麦31、徐68优201产业化(BA2014074)。

王波(1982─),男,江苏铜山人,硕士,主要从事植物病理学研究。*通讯作者:周兴根。