干热处理对白菜种传黑腐病抑菌效果评价

岳鑫璐，梁 根，李志强，李平东，刘 珍，彭李亚，杨婉琼，胡茂林

（深圳市农业科技促进中心，广东 深圳 518055）

【研究意义】由野油菜黄单胞菌野油菜致病变种（Xanthomonas campestrispv.campestris（Pam.）Dowson，Xcc）引起的十字花科蔬菜黑腐病是目前蔬菜上重要的种传细菌性病害［1］。该病害在幼苗期即可发病，出苗或出苗后子叶呈水浸状，根髓部变黑而死亡；成株期发病一般从叶缘开始，形成“V”字形病斑；受害叶片多数从叶缘开始出现由外向内扩展的黄色楔状斑，黄斑内的网状叶脉呈褐色至紫褐色病变［2-4］，最终至植株腐烂。黑腐病不仅可以通过感染的种子和种苗远距离传播，也可通过风、昆虫、灌溉、雨水、农业设备及人的活动等媒介近距离传播［5-6］。黑腐病通常适于在25～30 ℃条件下发生，在多雨湿热的环境下更易造成该病害的暴发［7］。20世纪50年代末，该病害在我国华北地区首次出现，到80年代在全国普遍发生，且危害逐年加重，严重时导致蔬菜减产70%左右［8］。十字花科蔬菜黑腐病不仅严重影响十字花科蔬菜的产量和品质，同时也危害除十字花科以外的多种蔬菜［9］，做好种传黑腐病的防控具有现实意义。

【前人研究进展】目前，防治种子传带黑腐病等种传病害除了选用无病种子或耐、抗病品种外，主要是采用种子消毒处理。化学药剂消毒及拌种能较快速控制病害，但一些化学处理种子方法可能对种子产生伤害，对于植物、土壤、水体可能会产生不良影响［10］。与化学方法相比，种子热处理方法是利用有效杀菌温度与种子可能受伤害的温度存在一定温差，以此达到抑制或杀死种子携带的病原菌，从而达到防控病害以及保护环境的目的［11］。由于不同作物种子及其携带的病原菌对温度、时间的敏感度不同，因而需要针对特定作物及病原菌设置特定的干热处理条件。种子干热处理可以阻止病原菌在种子表面的进一步繁殖，降低种子的带菌率［12］；孟姗姗对4 种蔬菜种子进行干热处理技术研究，表明干热处理可以有效减少种子上的病原菌，同时降低种子携带病原菌的致病性［13］；张永平等对甜瓜种子携带细菌性果斑病进行干热处理研究，结果表明适宜的干热处理温度和处理时间能有效提高种子活力和出苗率，显著降低甜瓜种子幼苗细菌性果斑病发病率［14］。

【本研究切入点】目前有关蔬菜种子热处理研究大多关注对象为葫芦科及茄果科作物种子，主要研究不同热处理条件对作物种子活力及生长的影响，对种子携带病原菌尤其是十字花科蔬菜种子携带病原菌的热处理研究报道较少。本研究通过设置不同的温度和时间组合干热条件，对黑腐病菌及带菌白菜种子进行处理，综合评价抑菌率及种子活力等指标，筛选安全、适宜的干热处理条件，以期为十字花科蔬菜黑腐病菌防治、病害绿色防控技术提供理论基础和技术支撑。【拟解决的关键问题】本研究旨在探究干热处理对十字花科蔬菜种子及其种传黑腐病菌的影响，筛选出可抑制种传病菌生长同时不影响种子活力的温度与时间组合处理条件。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验于2020 年4 月至2021 年6 月在深圳市农业科技促进中心实验室进行。供试菌株十字花科蔬菜黑腐病菌Xcc 8004，由中国农业大学种子健康中心实验室提供。桂柳四季高脚甜白菜种子由柳州市桂柳农业科技有限公司生产，经前期检测为未携带黑腐病菌的健康种子。

LB 固体培养基：胰蛋白胨10 g，NaCl 10 g，酵母粉5 g，琼脂粉16 g 加蒸馏水定容至1 000 mL，121 ℃灭菌21 min 后备用；LB 液体培养基：不含琼脂粉，其他同LB 固体培养基；改良mCS20ABN 培养基：大豆蛋白胨2 g，细菌胰蛋白胨2 g，磷酸二氢钾1.59 g，磷酸氢二铵0.33 g，七水合硫酸镁0.4 g，谷氨酰胺6.0 g，甲基绿1 mL，可溶性淀粉12.5 g，细菌琼脂粉15 g，蒸馏水定容到1 000 mL，121 ℃灭菌21 min，冷却至55 ℃后迅速加入1 mL 浓度为200 mg/mL 的放线菌酮、1 mL 浓度为20 mg/mL 的新霉素、1 mL 浓度为100 mg/mL 的枯草菌素，充分摇匀后倒入培养皿备用［15］。

仪器：METTLER TOLEDO DL203 电子天平，Eppendorf 5425R 台式高速离心机，FYL-YS-150YLYS-28L 菌株培养箱，知楚ZQTY-70F 台式全温振荡培养箱，Leica DM400B 生物显微镜，WEWO TEM1880 可程式恒温恒湿试验箱，HiPoint FH-1200 植物生长培养箱。

1.2 试验方法

1.2.1 黑腐病菌的活化与培养 病原菌活化：用接种环蘸取冻存的菌株培养液，在LB 固体培养基上划线，在菌株培养箱内于28 ℃、相对湿度＞60%遮光倒置培养2～3 d。

病菌悬浮液制备：用无菌接种环挑取LB 固体培养基上的单菌落，接种到装有200 mL 的LB液体培养基中，150 r/min 培养16 h，制备成浓度为106CFU/mL 的菌液备用。

1.2.2 离体条件下病原菌干热处理 参照孟珊珊［13］所做滤纸片法进行干热处理试验，将2 张1 cm×1 cm 无菌滤纸片浸入制备好的106CFU/mL 菌悬液中，浸泡5 min 后在超净工作台取出晾干备用。随后将晾干后的带菌滤纸片置于直径5 cm、高3 cm 的敞盖圆柱体铝盒内，按照温度（45、50、60、65 ℃）、时间（0.5、1、2、4、6 h）组成的20 个处理条件对带菌滤纸片进行处理。处理完成后将各个滤纸片分别浸泡在5 mL 无菌水中，180 r/min 摇床振荡30 min，制备洗脱液，每个处理的洗脱液稀释成100、10-1、10-2、10-3、10-4梯度，分别吸取100 μL液体于LB固体培养基上涂板，每个浓度3 次重复，以未进行热处理的病原菌为对照。涂板后将平板倒置于28 ℃、相对湿度＞60%黑暗倒置培养48 h 后，记录菌落生长情况并计算病原菌抑制率：

病原菌抑制率（%）=（对照病原菌菌落数量-处理病原菌菌落数量）/对照病原菌菌落数量×100

1.2.3 种子携带黑腐病菌干热处理 带菌种子制备：每组处理随机选取1 000 粒种子于3%NaClO溶液中消毒5 min 后用无菌水冲洗3 次，滤纸吸干种子表面水分，随后将种子放入铺有两层无菌滤纸的培养皿中，于超净工作台中风干。将风干的种子置于无菌培养皿内，加入5 mL 浓度为106CFU/mL 菌悬液，浸泡30 min 后，在超净工作台内吸出菌液，风干后置于直径5 cm、高3 cm 的敞盖圆柱体铝盒内于恒温恒湿箱进行干热处理。

种子携带黑腐病菌的抑制率计算：每组样品干热处理完成后取2 g（1 000 粒）种子按照种子质量∶无菌纯净水=1∶4 的比例置于10 mL 试管中，于180 r/min 摇床振荡30 min，制备洗脱液。随后分别稀释成100、10-1、10-2、10-3梯度，分别吸取100 μL 菌液于改良mCS20ABN 培养基上涂板，每个处理3 次重复。将平板倒置于28 ℃、相对湿度＞60%黑暗培养48 h 后，在4 组稀释梯度平板中选取菌落数在30～300 个之间、无蔓延菌落生长的平板计数菌落总数，统计单粒种子带菌量，计算病原菌抑制率：

单粒种子带菌量（个/粒）=3 皿平板菌落总数/0.3 mL×稀释倍数×8 mL/1 000 粒

病原菌抑制率（%）=（对照单粒种子带菌量-处理单粒种子带菌量）/对照单粒种子带菌量×100

式中，0.3 mL 表示3 皿平板内菌液总量，8 mL 为制备种子洗脱液的量。

1.2.4 种子携带黑腐病菌的活力评价 参照GB/T 3543.4-1995《农作物种子检验规程-发芽试验》，将热处理后的种子置于19 cm×13 cm×8 cm 发芽盒中，每个发芽盒铺两层无菌发芽纸保湿，每盒摆放100 粒种子，3 次重复。将发芽盒置于植物生长培养箱中，在20 ℃、相对湿度＞70%黑暗条件下发芽，待种子出芽后，于20 ℃、相对湿度＞70%、L//D=12 h//12h 条件下培养。以健康的种子为对照。分别测定发芽率、发芽指数、活力指数［16］，综合评价种子活力。

发芽率（%）=第7 天发芽种子数/处理种子数 ×100

发芽指数（GI）=∑（Gt/Dt）

活力指数（VI）=GI×S

式中，Dt为发芽日数，Gt为与Dt相对应的每天发芽数，S 为第7 天正常幼苗鲜重（g）。

2 结果与分析

2.1 十字花科蔬菜黑腐病菌生物学特性

将活化的病原菌在LB 液体培养基培养16 h，稀释成103CFU/mL 后均匀涂布于LB 固体培养基和改良mCS20ABN 固体培养基上（28 ℃、相对湿度＞60%，黑暗倒置培养）。病原菌在LB 固体培养基上培养2 d 后，菌落生长至1～2 mm，前期呈淡黄色，后期呈蜡黄色，圆形、黏稠状、微凸起（图1A、B）；病原菌在改良mCS20ABN 固体培养基上培养2 d，菌落生长到0.5～1 mm，呈淡绿色或半透明、圆形、黏稠状、稍隆起且有光泽，菌落周围被水解淀粉圈包围（图1C、D）。

图1 Xcc 在LB 培养基和改良mCS20ABN 培养基上的生长形态Fig.1 Morphologies of Xcc cultured on LB and modified mCS20ABN media

2.2 干热处理对离体条件下病原菌的抑制作用

采用滤纸片法，按照温度（45、50、60、65 ℃）、时间（0.5、1、2、4、6 h）组成的20 个处理条件对病原菌进行处理，结果（表1）显示，当干热处理温度为45 ℃，处理时间为4 h 及以上，病原菌抑制率达100%。当干热处理温度分别为50、60、65 ℃时，处理时间为0.5 h 及以上，病原菌抑制率均可达到100%。

表1 干热处理对离体条件下Xcc 病原菌的抑制作用Table 1 Inhibition effects of different dry heat treatments on Xcc pathogens in vitro

2.3 干热处理对种子携带黑腐病菌的抑制作用

根据上述干热处理对病原菌的抑制结果，选取温度为45、50 ℃，时间为0、4、8、10 h 的组合条件对带菌种子进行干热处理（0 h 处理表示带菌种子未进行热处理）。

带菌种子干热处理后，制备洗脱液涂板并在改良mCS20ABN 培养基上培养2 d 后，统计病原菌在培养基上的生长情况，并计算抑制率，结果显示，同一温度条件下，随着处理时间的延长，平板上菌落数量随之减少（图2），当温度为50 ℃，持续干热处理8 h 及以上时，平板上菌落数为0，病原菌抑制率达100%（表2）。

表2 不同干热处理对种子携带Xcc 的影响Table 2 Effects of different dry heat treatments on seeds with Xcc

图2 不同干热处理种子携带Xcc 分离情况Fig.2 Xcc isolated from seeds under different dry heat treatments

2.4 干热处理对带菌种子活力的影响

将带菌种子选取50 ℃与0、8、10 h 组合条件进行干热处理（0 h 处理表示带菌种子未进行热处理），以未经处理的健康种子为对照。结果显示，在50 ℃条件下干热处理8 h，对种子发芽率、发芽指数以及活力指数没有显著影响，且活力高于未进行干热处理的带菌种子；在50 ℃条件下干热处理10 h，对发芽率影响显著。

表3 不同干热处理对种子活力的影响Table 3 Effects of different dry heat treatment on seed vigor

3 讨论

种子干热处理利用干热空气对种子进行高温处理，利用热力及有效杀菌温度与种子耐受温度的差距来杀灭病菌［17］。前人利用不同作物品种及种传病原菌为试验材料，探究热处理对种子活力及杀菌的影响，已有相关成果。刘永胜研究了不同干热处理对油菜种子发芽及幼苗生长的影响，得出50 ℃处理是油菜种子较为理想的干热处理温度［18］。刘正鲁等探究干热处理的不同温度和时长对黄瓜种子发芽及植株生长发育的影响，得出干热温度75 ℃、时长24 h 处理的种子育苗，黄瓜的茎粗、植株鲜质量和干质量均显著高于对照，且未发生病毒病［19］。宋顺华等研究了干热处理对不同种类葫芦科瓜菜种子活力的影响，结论为干热处理会降低种子的活力，其影响程度会因不同作物种类及同一种类不同品种而异［20］。本研究在前人的研究基础上，设置干热处理对黑腐病菌及人工拌菌白菜种子进行处理，综合评价病原菌抑制率、带菌种子苗期发病率及种子活力。

从试验结果看，本研究对桂柳四季高脚甜白菜种子携带黑腐病菌所筛选能有效抑制黑腐病菌同时显著提高带菌种子活力的处理条件为50 ℃持续干热8 h。宋顺华等研究表明，80 ℃处理3 d能完全抑制带菌种子上的黑腐病菌，并对不带菌的京春白、京春黄和新奶白品种的种子发芽率和发芽势没有影响［21］。本研究结果验证了宋顺华等的观点，即同一种作物种子不同品种对高温的敏感度不一样，针对不同的品种应选择适宜的高温［21］。

从试验条件上分析，宋顺华等［21］的试验，干热条件预设35 ℃ 24 h、55 ℃ 24 h 对白菜种子进行前置处理，目的在于控制种子含水量低于4%，而本研究未对种子进行前置处理，种子含水量变化致使不同条干热条件对种子活力的影响有待进一步研究。

从试验对象上看，宋顺华等［21］对带菌京春白种子干热处理，其种子在65、70、75、80 ℃干热处理72 h，单粒种子上病原细菌的带菌量比对照分别减少92%、99%、99%和100%，推测其种子为内外部均携带黑腐病菌的自然种子。而本研究则对健康种子进行人工拌菌，从而模拟种子表面带菌，干热处理后180 r/min 摇床振荡30 min，可将种子表面携带病原菌洗脱，统计单粒种子带菌量种子；结果显示50 ℃持续干热处理8 h 病原菌抑制率达100%，其结果基于种子表面携带病原菌进行探究，种子内部携带病菌相关分析有待进一步探究。

4 结论

本研究通过对黑腐病菌及带菌白菜种子进行干热处理，对比分析了不同热处理条件对病原菌抑制效果、种子的灭菌效果以及种子活力指标。筛选出温度为45 ℃持续干热处理4 h 及以上或温度为50、60、65 ℃持续干热处理0.5 h 及以上的干热处理条件能使离体黑腐病菌失活；温度为50℃持续干热处理8 h 能完全抑制带菌种子携带病原菌，且能提高种子的活力。综合研究结果表明，50 ℃持续干热处理8 h 能有效抑制黑腐病菌生长，对种子具有灭菌效果，同时能提高种子的活力。