昆虫气味受体研究进展

祁全梅，李秋荣

（青海省农林科学院/青海省农业有害生物综合治理重点实验室/农业农村部西宁作物有害生物科学观测实验站，青海 西宁 810016）

昆虫是动物界中最大的一个类群，它们通过视觉、听觉、触觉、嗅觉等感官来感受外界环境，能精确嗅到周围环境中气味物质的细微变化，在长期进化过程中，形成了高度特化、极其灵敏的嗅觉系统。昆虫的嗅觉是行为感觉的一种重要信号输入来源，是其生存和繁衍的关键［1］。灵敏的嗅觉对昆虫的生活习性有着直接或间接的影响，在一定距离范围内，昆虫利用嗅觉感器识别环境中各种不同的气味分子，包括寄主植物、异性、天敌等释放的化学信号来确定飞行方向，从而定位寄主植物、寻找配偶、控制交尾、选择产卵场所、警惕和躲避天敌等，因此，嗅觉系统对昆虫生存和繁衍后代尤为关键。

寄主植物挥发性化合物的主要化学成分包括饱和及不饱和脂肪族醛类、酮类、醇类和酯类、烯萜类等，这些成分在化学感受过程中，主要发挥以下3 种功能：一是吸引害虫，帮助搜索食物或选择产卵地；二是驱避害虫，阻止取食植物或阻止产卵；三是吸引瓢虫、食蚜蝇、寄生蜂等天敌昆虫。通过研究挥发性化合物对植食性昆虫桔小实蝇Bactrocera dorsalis的作用，发现香梨、桃、甜橙和柠檬的挥发物对桔小实蝇的嗅觉行为产生影响，它们均对桔小实蝇雌虫具有显著的引诱活性，由此可知，植食性昆虫的嗅觉系统对寄主植物的挥发物反应非常敏感，而且挥发物在昆虫的生存和繁殖中具有重要作用［2-5］。

昆虫性信息素是由雌虫或雄虫分泌，被同种异性个体的嗅觉感受器所接受，并引起异性个体产生觅偶定向、求偶交配等生殖行为反应的微量挥发性化合物，主要功能是调控昆虫的求偶、交尾等性行为，因此，性信息素及相应的嗅觉感受对昆虫繁衍后代尤为关键。有些种类的昆虫还会产生聚集信息素、报警信息素等，这些信息素被同种其他昆虫感受到之后会触发相应的行为。寄主植物挥发物、昆虫性信息素、聚集信息素以及报警信息素被统称为“气味分子”或“信息化合物”。

对昆虫嗅觉的研究起初主要集中在果蝇、家蚕和东亚飞蝗等模式昆虫，随着科学技术不断发展，对其他种类的昆虫嗅觉识别机制的探索也受到了广泛关注，由于昆虫嗅觉系统在昆虫行为中起着十分重要的作用，嗅觉系统中的蛋白成为潜在的防治分子靶标，因此昆虫嗅觉相关基因及其编码蛋白在气味识别过程中所发挥的作用以及嗅觉识别的机制逐渐成为研究热点。在昆虫对气味的识别过程中有多种蛋白质参与，嗅觉系统中的主要蛋白家族包括气味结合蛋白（Odorant-binding Proteins，OBPs）、化学感受蛋白（Chemosensory Proteins，CSPs）、气味受体（Odorant Receptors，ORs）、离子型受体（Ionotropic Receptors，IRs）、感觉神经元膜蛋白（Sensory Neuron Membrane Proteins，SNMPs）和气味降解酶（Odorant Degrading Enzyme，ODE）等［6］，它们在主导调节昆虫的取食、交配和产卵等一系列行为中发挥着重大作用。其中，气味受体是化学感受系统中更为核心的元件，ORs 对气味分子的专一性识别过程是最为关键的环节，而ORs 介导的气味分子与嗅觉神经元的专一性结合是重要的嗅觉识别基础，在决定化学感受的专一性、敏感性及昆虫特定行为的输出方面具有更为重要的作用。

研究昆虫ORs 的气味分子反应谱、ORs-信息化合物-行为三者之间的关系以及ORs 的具体功能，可以解释昆虫行为产生的分子基础，明确害虫经由ORs 调控的嗅觉识别分子机制，有助于了解害虫种间以及与寄主植物、天敌之间的通讯关系，为开发对害虫有效的食物引诱剂、食物驱避剂或聚集信息素等奠定理论基础，从应用角度看，有助于开发新的防控技术与方法，加快食诱剂、拒食剂和聚集信息素等在害虫防控上的应用步伐。研究ORs与挥发性化合物、行为之间的关系，是阐明昆虫对化学信号进行识别的分子机制的一个重要环节，深入探索昆虫嗅觉相关基因的功能，将有助于昆虫嗅觉识别机制的研究，进而通过调节昆虫嗅觉识别过程，控制昆虫相关行为，为害虫的预防和治理提供绿色、安全的新方法，为阐释昆虫行为的产生机理奠定分子基础。

1 昆虫气味受体的鉴定与分类

1.1 气味受体的鉴定

气味受体是一种由嗅觉细胞表达的蛋白，能与气味分子结合，属于多基因超家族。20 世纪90 年代初，首次发现于大鼠和人类的嗅觉上皮细胞［7-8］，随后，科学家经过不断地探索，先后从脊椎动物鸟类、鱼类、两栖动物等体内克隆到相似的ORs 基因［9-10］，从无脊椎动物线虫中筛选得到ORs 基因［11］。昆虫研究者最初通过设计ORs 简并引物进行PCR 扩增，均未能成功，使昆虫ORs 基因的鉴定在一定程度上受阻。而后受益于基因组、转录组技术及生物信息学的快速发展，完成了多种昆虫的基因组测序，使昆虫ORs 基因得以快速鉴定。昆虫的第一个ORs 基因在黑腹果蝇Drosophila melanogaster体内发现，它类似于G 蛋白偶联受体的神经肽受体［12］，通过生物信息学手段、RNA 原位杂交技术等明确了果蝇的19 种嗅觉基因［13］，随后，在双翅目、鞘翅目、膜翅目、鳞翅目、半翅目和直翅目等昆虫体内陆续发现并鉴定得到ORs，从果蝇属Drosophila、赤拟谷盗Tribolium castaneum、中华蜜蜂Apis cerana cerana、家蚕Bombyx mori、冈比亚按蚊Anopheles gambiae、稻水象甲Lissorhoptrus oryzophilus、棉蚜Aphis gossypii、柑橘木虱Diaphorina citri和亚洲小车蝗Oedaleus decorus asiaticus等昆虫中分别鉴定到62、259、170、64、79、41、45、46、60 个ORs 基因［14-22］。

1.2 气味受体的分类

气味受体分为两个大类：一类为传统气味受体（Conventional Odorant Receptors，ORs），另一类为非典型气味受体（Odorant Receptor Coreceptor，ORCO），传统型气味受体又分为普通气味受体（Original Odorant Receptors，OORs）和性信息素气味受体（Pheromone Receptors，PRs），每种昆虫有多个ORs 和1 个ORCO。不同种类昆虫含有的ORs 基因的数量存在较大差别，受体间的同源性较低，仅约20%，且在少数嗅觉神经元中表达；而ORCO 则具高度保守性，同源性最高可以达到99%，在大多数嗅觉神经元中表达。不同种类昆虫的非典型气味受体的名称有所不同，黑腹果蝇的非典型气味受体被命名为Or83b［23］，鳞翅目的非典型气味受体被命名为OR2［24］。非典型气味受体是ORs 形成有选择性的离子通道、正常发挥功能所必须的蛋白组分［25］，不能识别气味分子，与ORs 共表达并协助其完成对气味分子的识别过程。

2 昆虫气味受体的蛋白结构与表达

2.1 气味受体的蛋白结构

昆虫ORs 是位于嗅觉感受神经元树突膜上的一种疏水性膜蛋白，编码约300～600 个氨基酸，其N 端不存在信号肽，但有一个保守的糖基化位点，胞内的环上存在几个潜在的磷酸化位点。由于此类膜蛋白的含量很低，解析它们的蛋白晶体结构困难较大，目前仅有高度保守的非典型气味受体ORCO 的结构被解析［26］。

曾经认为昆虫的ORs 结构与典型的脊椎动物G 蛋白偶联受体（G Protein-Coupled Receptor，GPCR）相同，C 端在细胞膜内，N 端在细胞膜外（图1 左）。但21 世纪初，通过抗体标记实验，在果蝇、冈比亚按蚊体内发现多种ORs 基因的N 端在细胞膜内，而C 端在细胞膜外（图1 右），与脊椎动物的ORs 分子结构恰好相反，此结果符合隐含马尔科夫模型。因此，推断昆虫的ORs 基因不属于G 蛋白偶联家族，说明昆虫和脊椎动物在进化过程中可能形成了两种不同的嗅觉系统，昆虫ORs基因可能与典型的GPCR有不同的进化起源。

图1 哺乳动物（左）和昆虫（右）的气味受体结构模式［26］Fig.1 Structural model of odorant receptors in mammalian（left）and insect（right）

昆虫ORs 蛋白结构的典型特征是大多包括7个长度为19～26 个氨基酸的疏水区，即7 次α-螺旋跨膜蛋白（TM）形成的结构域，该区域包含一个保守片段〔Phe-Pro-X-Cys-Tyr（X）20-Trp〕，其中，保守性最高的是横跨第6 和第7 跨膜区域的C 端。除保守区外，跨膜3、4、5 区的序列都显示出高度多样性，类比7 次α-螺旋跨膜蛋白结构，发现3、4、5 区是气味分子识别和结合区域的一部分，已在3、4、5 区确定了 17 个高度可变的氨基酸残基，ORs 跨膜3、4、5 区的可变氨基酸残基可能与气味识别多样性有关。

2.2 气味受体的表达

不同气味受体基因在昆虫发育各个阶段的表达情况不尽相同。从果蝇基因组中发现了60 个ORs 基因，其中，只有23 个在幼虫期表达，43个在成虫期表达［27］，中黑盲蝽AsutOrco主要在成虫期表达，且在雌、雄虫触角内高表达［28］，烟夜蛾HassOr83b在幼虫各龄期皆有表达，HassOr83b和HassOr18在烟夜蛾成虫触角和喙内高表达，而其他虫体组织无表达［29-30］，柑桔木虱DcitOrco在若虫和成虫期表达量较低且稳定，而8 个DcitORs在该虫各发育阶段均表达，且在若虫期表达量更高［31］。

普通气味受体基因在昆虫不同性别、不同组织或器官中的表达存在一定差异。甜菜夜蛾SexiOR3和SexiOR18这两个气味受体基因主要在触角表达，且在雌虫触角中的表达量明显高于雄虫触角［32］；李兆群采用转录组测序技术，从大草蛉、中华通草蛉体内分别鉴定得到39 个、37 个ORs 基因，这些ORs 基因在触角内高表达或特异表达，其中，CpalOR11、CpalOR14、CpalOR17及CpalOR25在除触角外的其他组织也有少量表达［33］；采用半定量PCR 分析ORs 基因在小菜蛾触角和其他嗅觉感器中的表达，发现ORs 主要在触角内表达，其中，PxylOR16、PxylOR17和PxylOR18在触角中大量表达，且雌雄成虫之间没有显著差异，PxylOR17在雌蛾生殖器中有一定表达，PxylOR18在雌蛾腹部也有表达［34］；中华按蚊Anopheles sinensis和中华蜜蜂Apis cerana cerana的气味受体基因ORs 在触角的表达量显著高于其他组织［35-36］；对绿盲蝽110个ORs 在4 种组织进行半定量，其中，两性成虫触角中各有2 个特异表达的AlucORs，分别有10个和18 个ORs 在雌、雄虫触角中的表达量高于头部、胸部和腹部等其他组织［37］。

非典型性气味受体基因在同种昆虫的不同组织或器官中的表达量各异。桃蛀螟CpunOrco主要在雌、雄蛾触角及下颚表达，在胸部、腹部和足等组织也有少量表达［38］，甜菜夜蛾SexiOR2在毛形、腔锥形和锥形感器中有表达，在栓锥形和刺形嗅觉感器中无表达［24］，绿盲蝽AlucOrco在雌成虫触角中的表达量显著高于雄成虫触角［39］，丽蝇科丝光绿蝇LserOrco和大头金蝇CmegOrco在触角和下颚须中大量表达，在雌虫产卵器中微量表达，而在胸部无表达，且这两种丽蝇科昆虫非典型气味受体基因的表达量均随虫龄增长而增加［40］，埃及伊蚊Aedes aegypti和致倦库蚊Culex quinquefasciatus的ORCO 基因在它们的触角、下颚须和喙中均有表达［41-42］，而ORCO 只在斜纹夜蛾Spodoptera litura和中红侧沟茧蜂Microplitis mediator的触角中特异表达［43-44］。在昆虫的不同嗅觉神经元上，表达的ORs 基因的数量也存在差异。一个嗅觉神经元可以表达一个气味受体基因，可以表达多个ORs 基因，也有些神经元不表达ORs 基因［45］。

3 昆虫气味受体的功能

3.1 气味受体功能研究方法

3.1.1 解析气味受体配体的方法 研究昆虫气味受体基因的功能，可为深入了解昆虫识别气味分子的嗅觉分子机制提供理论依据。研究昆虫气味受体的功能，可通过测定ORs 的气味分子反应谱，从中筛选有生物学功能的配体，解析ORs 配体的方法主要有两种：

一是体外验证法，即通过异源细胞表达系统筛选，异源细胞表达系统包括：（1）非洲爪蟾卵母细胞表达系统，是在体外研究昆虫ORs基因功能、验证ORs 基因配体方面的一个较常用、较成功的系统。该技术先在体外合成ORs 和ORCO 基因的cRNA，注射到爪蟾卵母细胞中，经过孵育培养，使用双电压电压钳在浴液中记录卵细胞对气味刺激的反应，爪蟾卵母细胞个体大、易培养且利于膜蛋白-ORs 基因表达。利用非洲爪蟾卵母细胞表达系统，已完成了甜菜夜蛾Spodoptera exigua［46］、斜纹夜蛾S.litura［47］和烟青虫Heliothis assulta［48］等多种昆虫ORs 的功能验证。（2）其他异源细胞表达系统，主要有草地贪夜蛾Spodoptera frugiperdaSf9 卵巢细胞表达系统、HEK293 人胚肾细胞表达系统，HEK293 细胞表达系统是一个较为常用的研究外源基因功能的细胞系统，Sf9 细胞是一种昆虫表达系统的宿主细胞，这两个表达系统类似，将外源ORs 和Orco在细胞中共表达后，用不同的气味分子刺激细胞，通过钙成像系统测得受刺激后细胞内的Ca2+浓度升高［49］。（3）果蝇“空神经元”表达系统，通过分子遗传学方法构建UAS/GAL4 基因异位表达调控系统，可将任何基因在果蝇的特定组织和细胞内表达。利用此种方法建立了果蝇的锥形感器和毛形感器这两种感器的受体神经元缺失品系，可为不同感器中表达的气味受体提供与虫体内相似的生理环境。果蝇的锥形感器中包含2个神经元ab3A 和ab3B，ab3A 中表达的是OR22a和OR22b，人工敲除OR22a 和OR22b 基因获得的神经元被称为△ab3A 空神经元是常用的果蝇受体神经元缺失突变体。通过UAS/GAL4 系统将外源ORs 特异性地表达于△ab3A 空神经元中，由OR22a 启动子驱动表达，利用单感器（Single Sensillum Recording，SSR）记录锥形感器ab3，从而获得外源ORs 对应的气味分子反应谱［50］。此外，开发了果蝇毛形感器受体神经元OR67d 缺失品系，通过将外源气味受体基因ORs 特异的表达在黑腹果蝇的毛形感器△T1 空神经元中，在OR67d启动子驱动下表达，通过SSR 记录发现目的ORs对某些信息素受体有很好的反应谱，解决了在毛形感器中某些ORs 不适合在锥形感器中表达的问题［51］。可能是由于果蝇感器能为ORs 基因提供类似于昆虫体内的生理环境和蛋白组件，果蝇“空神经元”表达系统反应比其他方法更灵敏，实验结果更为精确，已有果蝇、冈比亚按蚊Anopheles gambiae和灰翅夜蛾Spodoptera littoralis的ORs基因家族使用果蝇“空神经元”法验证了它们的气味配体种类［49-51］。

二是体内验证法，即在昆虫体内筛选，利用即刻早期基因（Immediate Early Genes，IEGs）可以指示ORs 对外界气味分子的反应这一原理，筛选目标ORs 的配体，这种方法首先在小鼠、果蝇和家蚕上得到验证，家蚕在受到蚕蛾醇这种性信息素刺激后，其性信息素受体基因BmorOR1与即刻早期基因BmHr38共表达与同一个神经元中［52］，而这种方法到目前应用仍很少。

3.1.2 RNAi 技术 RNAi 是一种转录后基因调控机制，主要用于靶标基因沉默，由于具有高度的序列特异性，而且抑制效果良好，操作简单，周期短，成为基因功能研究的重要工具。斑翅果蝇在注射ORCO dsRNA 24 h后很难准确找到食物源，且大多数个体飞行无规则，化学行为明显降低，而注射无RNase 水的斑翅果蝇大多数能准确找到食物源且较活跃，说明dsRNA 沉默了ORCO 基因的表达，降低了该虫的嗅觉能力，证实了ORCO在斑翅果蝇的嗅觉感受中发挥着重要作用［53］。利用RNAi 技术沉默松墨天牛Monochamus alternatus非典型性气味受体基因ORCO，导致引诱剂、松节油及性信息素引起的电位降低，使该虫对气味分子的行为趋向表现为随机性，因此，ORCO 基因的沉默可能会对松墨天牛正常的嗅觉识别过程造成影响［54］。

3.1.3 新一代基因编辑技术CRISPR/Cas9 技术基因组编辑是对基因功能进行分析的一种重要的生物学工具，CRISPR/Cas9 基因编辑技术是继TALEN 基因编辑技术之后又一重大突破，该技术通过RNA 指导Cas9 核酸酶对靶向基因进行特定DNA 编辑，效率更高，Cas9 系统的载体构建与使用也更加便捷，是目前使用广泛的新一代基因编辑技术。利用CRISPR/Cas9 技术将东亚飞蝗的聚集信息素受体LmigOR35基因敲除后，东亚飞蝗触角对 LmigOR35 的配体4-乙烯基苯甲醚（4-vinylanisole，4VA）的电生理反应以及4VA 对飞蝗的吸引效应显著降低［55］。烟草天蛾Manduca sexta的非典型性气味受体基因ORCO 被敲除后，该虫的觅食行为受到影响，而产卵行为不受影响［56］。

3.2 传统气味受体的功能

气味受体分布在嗅感神经元树突的膜表面，气味分子或是其与OBPs 的复合物可以激活相应的ORs 传递嗅觉信号，使昆虫产生反应，ORs 主要起识别气味分子的作用。果蝇的气味受体基因DOr43能被环己酮、环己醇、苯甲醛和苯甲醇等气味物质激活［57］，稻纵卷叶螟Cnaphalocrocis medinalis气味受体基因CmedOr1的唯一配体是苯乙醛，而苯乙醛可诱集多种鳞翅目昆虫［58-59］，家蚕的气味受体基因BmOr1能够识别、感知蚕蛾醇这种性信息素［60］，烟青虫H.assulta、欧洲玉米螟Ostrinia nubilalis、棉铃虫Helicoverpa armigera等鳞翅目昆虫的个别ORs 基因也可以识别性信息素［61-62］。果蝇的气味受体基因DOr22a和DOr22b 被敲除后，其失去了对气味分子的敏感性［63］，埃及伊蚊AaOr8 和AaOr49 对该虫定位宿主、吸血具有很重要的作用［64］。

3.3 非典型气味受体的功能

昆虫的非典型气味受体ORCO 的功能与传统ORs 不同，ORCO 不能单独识别气味分子，该基因的缺失会使昆虫嗅觉受损，细胞系通常需要将ORs 和ORCO 基因同时导入到细胞中，与ORs基因形成复合体才能把外界的气味分子正确定位到体内嗅觉神经元的位点上，从而提高ORs 基因对气味分子反应的灵敏度，除非细胞系细胞可以表达内源性的类似ORCO 的蛋白ORCO 介导的气味分子和嗅觉神经元的特异性结合是昆虫重要的嗅觉识别基础，其与ORs 相互作用形成的异源二聚体对昆虫的嗅觉具有重要作用［65］。家蚕的BmorOrco基因被敲除后，其对两种性信息素（E，Z）-10，12-十六碳烯醇和反-10，顺-12-十六碳二烯醛均无反应，且影响成虫的交配和幼虫对桑叶的选择行为［66］，果蝇的DOrco基因被敲除后，其丧失了对供试气味的选择性，经过转基因技术营救后又能恢复正常［21］。沉默ORCO基因后，导致赤拟谷盗的对引诱剂、性信息素以及气味剂的感受能力下降，正常的气味识别过程被影响［67］。可见，昆虫的ORCO 基因在其嗅觉中占有不可或缺的地位。

4 问题与展望

由于普通气味受体在不同昆虫之间的同源性较低，最初用生物序列的同源性搜索方法寻找昆虫的气味受体基因并未能成功，后来，研究者利用用分子生物学和生物信息学方法，第一次从昆虫——果蝇的基因组中鉴定到气味受体基因。大量研究表明，成功筛选并鉴定气味受体基因主要是建立在对昆虫基因组学研究的基础上，同时，证明气味受体基因广泛存在于昆虫基因组中［68］，随着越来越多昆虫基因组测序完成，气味受体基因的筛选和鉴定工作得到了迅猛发展。受益于现代分子生物学技术，从爪蟾卵母细胞表达系统、HEK293、Sf9 细胞表达系统和果蝇“空神经元”表达系统等异源细胞表达系统，到昆虫本体内筛选技术，再到RNAi 技术、新一代基因编辑CRISPR/CAS9 技术等新型技术的快速发展及其在气味受体功能研究中的应用，使人们对气味受体的功能及分子作用机制的认识也越来越深入。然而，研究昆虫气味受体基因的功能所采用的一些技术仍存在一定局限性。虽然通过爪蟾卵母细胞表达系统、HEK293、Sf9 细胞表达系统，可大量筛选外源OR 的配体，操作也不复杂，但是这3 种异源细胞表达系统均缺乏CSP、OBP 和SNMP 成分，无法完全真实体现OR 的反应特征；而果蝇“空神经元”表达系统虽能真实体现外源OR 的反应特征，部分外源ORs 却不能在该系统成功表达，加之操作难度较大，不利于高通量研究ORs 功能。研究对象亦存在局限性，虽然昆虫气味受体功能的研究对象由早期的模式昆虫如家蚕、果、蚊子和飞蝗，已转为研究重要的农作物、蔬菜害虫，却鲜见对于林业重要害虫OR 功能方面的研究报道。当前，研究重点也主要放在了农作物、蔬菜害虫对植物挥发物、性信息素的嗅觉感受功能与机制上，而忽视了对害虫聚集信息素受体的鉴定和功能验证，聚集行为在许多害虫群体中是一种很常见的现象，聚集也是导致害虫对农作物、蔬菜和林木造成重大灾害的重要条件，今后有必要加强对害虫聚集信息素受体的功能研究。

深入研究气味受体基因的功能，阐明昆虫觅食、交尾和产卵等的嗅觉行为反应分子机理，并将其与传统的化学生态学、行为学相结合，有助于从分子生物学角度解释气味受体基因在昆虫定位寄主植物、寻找交尾对象及产卵场所等行为过程中发挥的重要作用，进一步了解昆虫一系列行为产生的机制机理，同时也可为研发绿色、高效的食物引诱剂和、驱避剂、性信息素引诱剂及聚集信息素等行为调控剂提供理论依据和技术支持。