英红九号红茶生化成分指纹图谱初探

凌彩金，范杰文，王秋霜，周巧仪，刘淑媚

（1.广东省农业科学院茶叶研究所/广东省茶树资源创新利用重点实验室，广东 广州 510640；2. 华南师范大学化学与环境学院，广东 广州 510006）

英红九号是从云南大叶有性群体品种中单株分离，经30多年系统选育而成的无性系大叶红茶品种［1］。以英红九号为原料加工而成的英德红茶，可与世界上著名的印度红茶、斯里兰卡红茶媲美，被茶界誉为后起之秀，同时与国内的滇红、祁红被认定为中国三大著名出口红茶［2］。目前，英红九号红茶的品质审评主要采用感官审评，即在一定的环境、设备条件下，茶叶评审人按茶叶色泽、香气、滋味、性状、叶底分别进行评价，以确定茶叶的品质和等级。但是通过感官审评对英红九号红茶的品质进行评定，其结果受审评环境、设备及审评员工作经验等多种不稳定因素的影响。

目前，国内外对茶叶指纹图谱的研究主要采用高效液相色谱法（HPLC）［3］，以茶叶各色谱峰的峰面积为因子，运用相关系数、聚类分析等方法构建茶叶HPLC指纹图谱［4-5］。有研究报道，通过构建绿茶指纹图谱可用于预测绿茶的抗氧化能力［6］。但在茶叶生化成分、微量元素等常规理化指标方面而构建的指纹图谱研究较少。本研究采用国家茶叶标准中的方法测定春、夏、秋三季英红九号红茶常规生化成分的含量，分析不同季节各生化成分的差异，构建数字化的英红九号红茶生化成分指纹图谱，为英红九号红茶的常规生化成分指纹图谱的构建提供参考，在区分英红九号与其他品种红茶，对不同季节英红九号红茶进行分类提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

春、夏、秋三季英红九号红茶样本由广东省农业科学院茶叶研究所提供，共23个样品；另有来自其他企业的6个红茶茶样作为对照样品（表1）。茶叶采摘标准为一芽二叶，茶样采摘、加工处理后密封贮存，贮存条件按GB/T 30375-2013 执行［7］。

试剂：磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、碱式醋酸铅、硫酸亚铁、酒石酸钾钠、硫酸、盐酸、茚三酮、氯化亚锡、蒽酮，均为分析纯；试验用水为蒸馏水。

仪器：AE200型分析天平（上海梅特勒-托利多公司）、HWS-26型电热恒温水浴锅（上海一恒科技仪器有限公司）、PHS-3C型pH计（上海雷磁仪器厂）、725N型紫外分光光度计（上海菁华科技仪器有限公司）、ML-50 型快速水分测定仪（日本AND公司）。

1.2 试验方法

1.2.1 茶样准备 称取经粉碎过孔径0.250 mm筛的样品1.000 g（精确至0.001 g），放入250 mL锥形瓶中，加入90 mL沸水，浸提45 min，每隔10 min振荡1次。浸提完毕后，趁热过滤，待茶汤冷却至室温后加水定容至100 mL，备用。

表1 样品信息

1.2.2 理化指标测定 水分含量测定采用快速水分测定仪进行测定；茶多酚含量测定采用福林酚法，按GB/T 8313-2008执行［8］；游离氨基酸总量测定采用茚三酮比色法，按GB/T8314-2013执行［9］；咖啡碱含量测定采用紫外分光光度法，按GB/T8312-2013执行［10］；可溶性糖含量测定采用蒽酮比色法［11］；水浸出物含量测定采用全量法，按GB/T8305-2013执行［12］。

试验数据采用Microsoft Excel 2007软件处理，用SPSS19.0软件进行方差分析和显著性检验。

1.3 生化成分指纹图谱的构建与分析

通过对不同品种、不同季节红茶中各生化成分含量进行分析，检验不同品种、不同季节间的生化成分含量差异。然后以茶多酚、氨基酸、咖啡碱、可溶性糖及水浸出物5种生化成分含量为变量，运用SAS 9.4软件中的系统聚类分析（离差平方和法）对29个茶样进行聚类，以构建聚类数字化的英红九号红茶生化成分指纹图谱，并对图谱进行分析。

具体步骤如下：（1）用标准差标准化方法，对茶多酚、氨基酸、咖啡碱、可溶性糖、水浸出物等5项指标的原始数据进行处理；（2）计算样品的离差平方和；（3）采用WARD法得到样品间的平方距离，依据不同的聚类标准（半偏R2），对各样本进行聚类，并作出聚类谱系图。

2 结果与分析

2.1 生化成分含量

采用国家茶叶标准方法测定了春、夏、秋三季英红九号红茶与对比茶样的常规生化成分含量，结果见表2；对春、夏、秋三季英红九号红茶的水分、茶多酚、氨基酸、咖啡碱、可溶性糖、水浸出物含量进行差异性分析，结果见表3。另外，对英红九号春茶、云南滇红春茶及凌云白毫春茶3个红茶品种的各种生化成分含量进行差异性分析，结果见表4。

表2 春、夏、秋三季英红九号红茶与对比茶样的生化成分含量（%）

表3 英红九号红茶不同季节间各生化成分含量差异性分析

表4 不同品种红茶生化成分含量差异性分析

2.1.1 茶多酚 从表2可以看出，英红九号红茶的茶多酚含量为14.15%，其中夏季英红九号的茶多酚含量最高、为17.31%，春季的茶多酚含量最低、为13.40%，英红九号红茶的茶多酚含量在不同季节中总体表现为夏季＞秋季＞春季（表2）。已有研究表明，在其他因素较一致的情况下，气温、日照影响着鲜叶中生化成分的含量变化［13］，而茶多酚的基本规律为温度和光照有利于茶多酚物质的积累［14］。

采用SPSS19.0软件对英红九号春、夏、秋三季红茶的茶多酚含量进行差异性分析，结果（表3）显示，英红九号红茶不同季节间茶多酚含量差异极显著。对英红九号春茶、云南滇红春茶及凌云白毫春茶3个红茶品种进行差异性分析，结果（表4）显示，不同品种红茶间茶多酚含量差异显著。

2.1.2 氨基酸 不同季节的英红九号红茶的氨基酸含量为4.00%，其中夏季英红九号的氨基酸含量最高、均值为4.13%，春季的氨基酸含量最低、均值为3.85%，英红九号红茶的氨基酸含量在不同季节中总体表现为夏季＞秋季＞春季（表2）。氨基酸是重要的滋味物质［15］，其含量则茶叶滋味鲜醇、香气也好［16］。一般来说，春茶氨基酸含量高于夏秋茶，春茶的滋味也因此更鲜爽、香气更加浓烈。本研究中，春季英红九号红茶的氨基酸含量略低于夏秋季，可能因种植过程中受气温、雨量等气候因素的影响所致。

对英红九号春、夏、秋三季红茶的氨基酸含量进行差异性分析，结果（表3）显示，英红九号红茶不同季节间氨基酸含量无显著性差异。对英红九号春茶、云南滇红春茶、凌云白毫春茶等3个红茶品种进行差异性分析，结果（表4）显示，不同品种红茶间氨基酸含量差异极显著。

2.1.3 咖啡碱 不同季节的英红九号红茶的咖啡碱含量为3.20%，其中夏季英红九号的咖啡碱含量最高、均值为3.79%，秋季的咖啡碱含量最低、均值为3.05%，英红九号红茶的咖啡碱含量在不同季节中总体表现为夏季＞春季＞秋季（表2）。茶叶中的咖啡碱含量与茶树的生长条件、品种、产地、加工方法和采收期等诸多因素相关，一般规律是遮光条件下栽培的茶树咖啡碱含量较高，细嫩茶叶比粗老茶叶含量高，夏茶比春茶含量高［17］，本研究结果与此规律相符。

对英红九号春、夏、秋三季红茶的咖啡碱含量进行差异性分析，结果（表3）显示，英红九号红茶不同季节间咖啡碱含量差异极显著。对英红九号春茶、云南滇红春茶、凌云白毫春茶等3个红茶品种进行差异性分析，结果（表4）显示，不同品种红茶间咖啡碱含量无显著差异。

2.1.4 可溶性糖 不同季节的英红九号红茶的可溶性糖含量为3.19%，其中春季英红九号的可溶性糖含量最高、均值为3.70%，夏季的可溶性糖含量最低、均值为2.74%，英红九号红茶的可溶性糖含量在不同季节中总体表现为春季＞秋季＞夏季（表2）。可溶性糖是茶汤呈甜味的主要物质，可缓解茶多酚、咖啡碱造成的茶汤苦涩味。春季英红九号的可溶性糖高于夏季及秋季，故英红九号春茶的滋味更香甜［18］。

对英红九号春、夏、秋三季红茶的可溶性糖含量进行差异性分析，结果（表3）显示，英红九号红茶不同季节间可溶性糖含量无显著差异。对英红九号春茶、云南滇红春茶、凌云白毫春茶等3个红茶品种进行差异性分析，结果（表4）显示，不同品种红茶间可溶性糖含量差异显著。

2.1.5 水浸出物 不同季节的英红九号红茶的水浸出物含量为40.49%，其中夏季英红九号的水浸出物含量最高、均值为42.36%，春季的水浸出物含量最低、均值为36.95%，英红九号红茶的水浸出物含量在不同季节中总体表现为夏季＞秋季＞春季（表2）。水浸出物的主要成分是茶多酚、氨基酸、咖啡碱、可溶性糖、水溶色素、水溶性果胶、可溶性蛋白、维生素和无机盐等［19-21］。

对英红九号春、夏、秋三季红茶的水浸出物含量进行差异性分析，结果（表3）显示英红九号红茶不同季节间水浸出物含量差异显著。对英红九号春茶、云南滇红春茶、凌云白毫春茶等3个红茶品种进行差异性分析，结果（表4）显示，不同品种红茶间水浸出物含量无显著性差异。

2.2 生化成分指纹图谱的构建与分析

通过对不同品种、不同季节红茶中茶多酚、氨基酸、咖啡碱、可溶性糖及水浸出物5种生化成分进行分析，结果显示不同品种的生化成分含量存在差异，不同季节间的英红九号的生化成分含量也存在差异。因此，本研究以这5种生化成分含量为变量，运用SAS 9.4软件中的系统聚类分析（离差平方和法）对29个茶样进行聚类，结果见图 1。

结果显示，在不同的聚类标准（半偏R2）下，聚类结果不同，当半偏R2为0时，每个样品为单独的一类；随着半偏R2标准逐渐放大，29个区域单位被依次聚类。当半偏R2为0.25时，29个区域被聚为9类，其中夏季英红九号红茶1号和2号为一类，春季英红九号19、20和22号为一类，秋季英红九号9、10和12号为一类，秋季英红九号4、5、13和15号为一类。聚类结果（图1）表明，英九的春、夏、秋三季红茶各生化成分含量存在差异。同时，当半偏R2为0.25时，凌云白毫红茶28号和29号聚为一类，云南滇红23、24、25和26号为一类，这说明在茶叶生化成分含量上，英红九号红茶、凌云白毫及云南滇红有明显区别。

图1 29个茶叶样品的系统聚类谱系

由此可见，茶叶中各生化成分含量可作为不同季节、不同品种红茶聚类的依据。以各生化成分含量为变量的聚类分析能对不同季节的英红九号红茶进行归类，也能准确地区分英红九号红茶与其他品种。

3 结论与讨论

本试验采用国家茶叶标准中的方法测定了不同季节英红九号红茶和其他品种红茶的茶多酚、氨基酸、咖啡碱、可溶性糖、水浸出物5种生化成分的含量。差异性分析发现，不同季节英红九号红茶的茶多酚、咖啡碱、水浸出物含量差异显著；不同品种红茶的茶多酚、氨基酸、可溶性糖含量差异显著。以茶多酚、氨基酸、咖啡碱、可溶性糖和水浸出物含量为因子，用聚类分析的方法建立数字化英红九号红茶生化成分指纹图谱，在区分英红九号与其他品种红茶、不同季节英红九号红茶进行归类方面具有可行性。

茶树作为一种多年生植物，其芽叶中所含的内质成分与成茶品质有着密切的关系。本试验中，春、夏、秋三季的英红九号红茶的茶多酚、游离氨基酸和水浸出物含量随着季节的不同而产生差异，总体表现均为夏季含量最高，春季含量最低；可溶性糖含量总体表现为春季最高，夏季最低；英红九号3个季节中的茶多酚、咖啡碱及水浸出物含量存在明显差异。不同季节英红九号红茶生化成分产生差异的原因在于茶树因生长所处的季节不同，温湿度、降水量、日照时间及强度等的差异会对其新梢所含生化成分产生一定的影响。不同品种间，英红九号红茶、云南滇红及凌云白毫春茶的茶多酚、氨基酸及可溶性糖的含量存在显著差异，说明不同品种间春茶的生化成分组成存在一定的差异，这与相关文献报道的结果一致［22］。

在系统聚类分析中，当半偏R2为0.25时，能够区分春、夏、秋三季英红九号红茶以及其他品种红茶，茶样中的茶多酚、氨基酸、咖啡碱、可溶性糖及水浸出物5种生化成分可作为作为不同季节英红九号红茶、不同品种红茶聚类的依据。本实验室曾采用HPLC法对英红九号、云南滇红及凌云白毫品种加工制造的红茶产品进行分析测定，以各色谱峰的峰面积为引子，采用聚类分析方法构建了鉴定不同品种及不同季节英红九号红茶的HPLC指纹图谱分析方法［4］。本试验分析结果中，与前期通过高效液相色谱法得出的系统聚类谱系图存在差异，分析原因是由于聚类依据的不同而产生的差异。本试验是以茶多酚、氨基酸、咖啡碱、可溶性糖及水浸出物5种生化成分含量作为聚类依据，HPLC指纹图谱中是以儿茶素类化合物（C、EC、CG、GC、EGC等）的色谱峰面积作为聚类依据。此外也有研究表明，采用不同的聚类方法，对于相同的数据可能有不同的划分结果，划分结果也会随选择距离的不同而存在差异［23］。本试验采用的聚类标准（半偏R2）与HPLC指纹图谱采用的聚类标准（欧氏距离）不同，这也有可能是造成聚类谱系图差异的原因之一。但总体而言，通过不同数据的聚类分析，都可以得出不同季节的英红九号红茶在内质成分的含量上存在一定的差异，可应用于英红九号红茶指纹图谱研究。