MSTN敲除对肌肉增强因子2(MEF2C)和miR-222表达调控的影响

肖 伟，蔡刚志，华再东，任红艳，朱 喆，肖红卫，郑新民，顾玉芳，毕延震，杨玉莹*

(1.长江大学 动物科学学院，湖北 荆州 434025；2.湖北省农业科学院 畜牧兽医研究所，动物胚胎工程及分子育种湖北省重点实验室，湖北 武汉 430064；3.高原山地动物遗传育种与繁殖省部共建教育部重点实验室，贵州 贵阳 550025；4.贵州省动物遗传育种与繁殖重点实验室，贵州 贵阳550025；5.贵州大学 动物科学学院，贵州 贵阳550025)

肌肉抑制素(Myostatin，MSTN) 基因全长6.7 kb，编码区由2 个内含子和3 个外显子组成。MSTN 又称为TGF-8 基因(growth differentiation 8 ) ，是TGF-β(growth differentiation factor beta) 蛋白家族中的一员[1]，是调节肌肉细胞生长发育的负调控因子。肌肉抑制素敲除后，动物体内对胰岛素的敏感性增强，糖的摄取效率更高[2]，肌肉组织异常发达，呈现“双肌”性状[3]。研究表明，敲除Smad3基因后会导致MSTN高表达，从而造成肌肉萎缩症发生[4]。因此，MSTN在脂肪沉积过程中有着至关重要的作用，但其在脂肪沉积的分子通路中的机理还未明了。

转录因子MEF2C(Myocyte enhancer factor 2C)对脂肪组织基因表达也有调控作用，在C-ski 敲除小鼠的白色脂肪组织中，MEF2C 的表达上调3.64 倍，导致小鼠出现脂肪减少的表型[5]。MEF2C 受RBM4(RNA binding motif protein 4)的可变剪接调控，同时RMB4 启动子可被MEF2C 结合，二者共同形成前馈环路，调控棕色脂肪组织的形成[6]，类似的结果也被多个研究证实[7]。另有研究观察MSTN 与MEF2C 的调控关系，比如在山羊胚胎成纤维细胞中，采用慢病毒介导的RNA 干扰沉默MSTN 表达后，发现MEF2C表达上调[8]；而在骨骼肌细胞里，MSTN 敲除后引起MEF2C 下调[9]。由此可见，在不同的细胞环境中，MSTN 与MEF2C 的调控关系可能有所不同。

微小非编码RNA-222(miR-222 )在进化上极为保守，被认为是一个抑脂因子。miR-222 与人的体重身高指数(BMI)呈负相关，说明其与脂肪沉积的关系密切[10]。小鼠的3T3-L1 前脂肪细胞及人的骨髓间充质干细胞向脂肪细胞分化时，miR-222的表达下调；相反，高表达miR-222 则可抑制两者向脂肪细胞生成[11-12]。猪脂肪组织miRNA 表达谱的研究也揭示miR-222 在脂肪里的表达丰度较高，可能参与脂肪沉积，但具体机制不明确[13]。为了进一步探索MSTN通过MEF2C调控miR-222的分子通路，笔者等采用生物信息学、Western印迹和qPCR等方法，对MSTN通过MEF2C调控miR-222的分子通路进行研究，以期为后续研究脂肪沉积提供有力依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

野生型PK15 细胞，由湖北省农业科学院畜牧研究所/动物胚胎工程及分子育种湖北省重点实验室研究保存提供；PK3108细胞系PK15细胞上成功敲除MSTN后所得[14]。单核苷酸链及试验所用引物由武汉天一辉远公司合成。胎牛血清和DMEM 高糖培养基，购自Gibco 公司。BCA 蛋白定量试剂盒和SDSPAGE凝胶配置试剂盒，购于碧云天生物技术有限公司；TRIzol、逆转录试剂盒和4 × SDS loading buffer(Invitrogen)、2 × SYBR Green Mix 和RNase free water(TaKaRa,中国大连)，购自宝生物工程(大连)有限公司；MEF2C 抗体，购于美国Abcam公司。PCR 仪购买于LifeTechnology(美国) 公司。

1.2 试验方法

1.2.1 生物信息学预测MEF2C靶向miR-222启动子区域结合位点 采用Promo、JASPAR在线预测MEF2C在miR222启动子区域的结合位点。

1.2.2 Western blot印迹和qPCR

1) Western印迹检测野生型PK15(MSTN+/+)和PK3108(MSTN+/-)细胞系中MEF2C的表达量变化。收集PK15细胞、PK3108细胞，提取细胞的总蛋白。BCA法测定蛋白浓度，取20 μL样品，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，电泳时浓缩胶恒压80V、30 min，分离胶恒压120V、70 min。转膜、封闭、一抗4℃过夜，二抗室温孵育2 h，DAB化学显色并分析结果。

2) MSTN敲除后qPCR检测PK15(MSTN+/+)、PK3108(MSTN+/-)细胞系中miR-222的表达量变化。总RNA提取：弃去培养液，DPBS清洗3遍后收集细胞至1.5 mL离心管中，加800 μL Trizol裂解细胞并反复吹打至无明显沉淀，静置5 min，加入160 μL氯仿(Trizol体积的1/5)，上下颠倒数次混匀，静置10 min，12 000 g、4℃离心10 min。吸取上清200 μL至新的EP管中并加入等体积异丙醇，静置10 min，12 000 g、4℃离心10 min。弃去上清，加入800 μL 75%乙醇清洗沉淀，轻轻颠倒数次，8 000 g、4℃离心5 min。弃去上清，打开盖子待乙醇挥发后加入30 μL DEPC水溶解并测浓度。

RT-qPCR检测miR-222表达量变化：设计茎环引物(表1)对其进行逆转录反应(SYBR Green Assay)：Temlpate RNA，1 μg，Gene-specific primer(茎环引物)，1 μL；5×Reaction Buffer，4 μL，RiboLock RNase Inhibitor(20U/μL)，1 μL；10 mM dNTP Mix，2 μL，RevertAid M-MuLV RT(200U/μL)，1 μL，加ddH2O补足至 20 μL；逆转录反应条件：42℃，60 min；70℃，5 min。qPCR检测miR-222表达体系：cDNA，1 μL，SYBR Green，10 μL，上、下游引物(表1)，1 μL；加ddH2O 补足至20 μL；反应体系条件：95℃、30 s预变性；95℃、10 s变性，60℃、30 s退火，共40个循环。以U6作为内参基因，通过2-ΔΔCt评价miRNA的表达水平。

表1 RT-qPCR引物序列Table 1 RT-qPCR primer sequence

1.3 数据统计

采用Excel对数据进行统计，并用spss18.0进行差异显著性分析。

2 结果与分析

2.1 生物信息学结合位点预测结果

通过在线分析软件分析，结果(图1A)表明，在ssc-miR-222启动子区域存在MEF2C的多个结合位点，初步判断MEF2C对miR-222可能存在调控作用。图1B为MEF2C在miR-222启动子区域结合位点示意图。

2.2 Western印迹检测 MEF2C表达量变化

Western印迹检测结果(图2)表明，当PK15(MSTN+/+)敲除MSTN后，所获得的PK3108(MSTN+/-)细胞中的MEF2C表达量高于PK15(MSTN+/+)细胞中的表达量，即PK15(MSTN+/+)敲除MSTN后MEF2C表达量呈增高趋势。说明MSTN敲除后引起MEF2C表达量上升。

图1 MEF2C在miR-222启动子区域的结合位点预测Fig.1 Prediction of binding sites of MEF2C in miR-222 promoter region

图2 MEF2C 在 PK15(MSTN+/+)和 PK3108(MSTN+/-)细胞系中的表达量Fig.2 Expression of MEF2C in cell lines of PK15(MSTN+/+)and PK3108(MSTN+/-)

2.3 MSTN 敲除后 RT-qPCR检测中miR-222的表达量变化

从图3看出，当PK15(MSTN+/+)敲除MSTN后，所获得的PK3108(MSTN+/-)细胞中的miR-222的表达量高于PK15(MSTN+/+)细胞中的表达量，PK3108(MSTN+/-)细胞中的miR-222表达量比PK15(MSTN+/+)高3.48倍(P<0.01)，即PK15(MSTN+/+)敲除MSTN后MEF2C表达量增高，而MEF2C高表达促进miR-222表达量上调，上调幅度达3.48倍。

图3 PK15(MSTN+/+)和 PK3108(MSTN+/-)细胞系中 miR-222的表达量Fig.3 Expression of miR-222 in cell lines of PK15(MSTN+/+)and PK3108(MSTN+/-)

3 结论与讨论

本研究通过生物信息学的方法预测到在 miR-222 启动子区域存在有多个 MEF2C 结合位点，Western 印迹结果显示，MSTN敲除后MEF2C表达量升高。在转录水平上，MSTN敲除后miR-222 的表达量也呈上升趋势，当PK15(MSTN+/+)敲除MSTN后，所获得的PK3108(MSTN+/-)细胞中miR-222表达量较PK15(MSTN+/+)高。即PK15(MSTN+/+)敲除MSTN后其MEF2C表达量增高，而MEF2C高表达促进miR-222表达量上调，上调幅度达3.48倍。因此推测，动物体内的脂肪沉积可能与 MEF2C 和miR-222有关。这与LU J等[8]采用慢病毒介导的 RNA 干扰沉默MSTN表达后MEF2C 表达上调的研究结果一致。另有国外学者在探索硬脂酰辅酶A去饱和酶5(SCD5)在黑色素瘤中的表达机制时发现，SCD5和miR-222之间存在负反馈回路[15]，而SCD5的表达量与脂肪沉积又有直接关系，表明研究脂肪沉积的分子通路与SCD5关系密切。

综合上以研究表明，MSTN、MEF2C、miR-222与脂肪沉积有着密不可分的关系，其影响机制表现为：MSTN 敲除后引起 MEF2C 表达量上升，进而促进 miR-222 表达量上调。虽然，目前对MSTN影响脂肪沉积的机制有一定研究，但关于影响动物脂肪沉积的分子通路还未明确。因此，笔者等将在此研究基础上继续相关研究，以期发掘出一条影响动物脂肪沉积的分子通路，为动物选择性育种提供参考。