3个石榴良种的ISSR分子鉴别

王庆军，罗 华，毕润霞，赵丽娜，郝兆祥

(枣庄市石榴研究中心/枣庄市峄城区果树中心，山东 枣庄 277300)

石榴(PunicagranatumL.，2n=16)为石榴科(Punicaceae)石榴属(PunicaL.)落叶灌木或小乔木，在我国南方则变为常绿灌木或小乔木，又称安石榴、若榴等，原产于伊朗、阿富汗等，在长期传播和栽培过程中因基因突变、天然杂交、人工选择等原因形成了许多变异资源，极大丰富了石榴遗传多样性[1-2]。石榴在我国已有2 000多年的栽培历史[3-4]，形成了新疆、陕西、四川、云南、安徽等著名的石榴产区，山东枣庄为我国古老的石榴产区之一，主要分布于峄城区等地[5-6]。近年来，枣庄市峄城区果树中心和山东省林业科学研究院合作选育出国内首个，也是目前唯一个国家级“秋艳”石榴良种(编号：鲁S-SV-PG-024-2015)和2个省级石榴良种“青丽”(编号：鲁S-SV-PG-023-2015)和“桔艳”(编号：鲁S-SV-PG-024-2015)。这些石榴良种推广于生产，已产生了巨大的经济、生态和社会效益。

分子标记是以个体间遗传物质内核酸序列变异为基础的新型遗传标记，是DNA分子水平遗传多态性的直接反映[7]。简单重复序列间扩增(inter simple sequence repeat，ISSR)是以DNA重复序列为核心，运用PCR技术和重复序列技术组合发展起来的一种微卫星基础上的扩增多态性分子标记，具有扩增片段长度多态性(amplified fragment length polymorphism，AFLP)、随机扩增多态性DNA标记(random amplified polymorphic DNA，RAPD)和简单重复序列标记 (Simple Sequence Repeats，SSR)的优点，具有使用方便、成本低、结果重现性较高、可靠性高等特点[8-9]。目前，对秋艳、青丽和桔艳等3个石榴良种分子标记方面的研究未见报道，而且当叶片、枝条等材料脱离石榴植株个体后，良种无性繁殖在形态上很难区别，常出现假冒良种，会对石榴产业造成不利影响，制约石榴良种化进程。因此，采用新型分子标记对3个石榴良种离体材料进行分子鉴别，对保护石榴良种资源，促进石榴产业发展具有重要的现实意义。为此，笔者等采用ISSR 分子标记技术，以石榴嫩叶为试材，提取石榴叶片基因组DNA作为模板，从24个石榴品种中探索秋艳、青丽和桔艳的分子鉴别技术体系，以期为石榴良种的推广栽植和分子标记辅助选择育种奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

24个山东石榴品种(表1)均来源于枣庄市石榴国家林木种质资源库。2017年5月采集每个品种健康枝条的嫩叶30 g，用液氮速冻后放于-80℃保存备用。

表1 供试24个山东石榴品种名称Table 1 Name of 24 tested P.granatum varieties in Shandong

1.2 试验方法

1.2.1 石榴基因组DNA的提取与检测 采用改良CTAB法[10]提取石榴嫩叶的基因组DNA。用0.8%(w/v)的琼脂糖凝胶电泳检测DNA的完整性，用德国IMPLEN P300核酸蛋白超微量紫外分光光度计检测基因组DNA的纯度和浓度，-20℃冰箱保存，把DNA用TE稀释至终浓度为50 ng/μL，放入4℃冰箱保存备用。

1.2.2 引物筛选及ISSR-PCR扩增 从ISSR随机引物中筛选出8条多态性好、谱带清晰、扩增稳定的引物(由上海桑尼生物科技有限公司合成，表2)对3个石榴良种进行ISSR-PCR扩增。PCR反应总体系25 μL：ddH2O 10.5 μL、2×Taq PCR Master Mix 12.5 μL、10 μmol/L引物1 μL、50 ng/μL模板DNA 1 μL。采用梯度PCR仪进行扩增，扩增条件：94℃预变性5 min；94℃变性45 s，退火30 s，72℃延伸2 min，35个循环；72℃再延伸10 min；最后4℃保存。PCR扩增产物采用尼康 D 3000拍照保存。

表2 ISSR-PCR扩增所用的引物及退火温度Table 2 Primers and annealing temperature for ISSR-PCR amplification

1.3 数据处理

电泳结果用Alphaview SA软件读取谱带分子量，谱带分子量用DL 2000 DNA Marker作为标准，由软件分析得到各条谱带的分子量大小。同一引物在相同迁移率位置谱带清晰可辨的记为“1”，模糊或缺失的记为“0”[11]。统计所有ISSR引物的扩增结果，建立“0，1”矩阵和3个山东石榴良种的特征图谱，用于分子鉴别分析。

2 结果与分析

2.1 秋艳特异性分子标记引物的确定

从引物UBC811对山东24个石榴品种扩增结果的“0，1”矩阵(表3)看出，在2 000 bp处，品种1、12、13、15、22、23无带，而其余品种有带，所以这6品种与其余品种能区分开；在1 700 bp处，品种1、12有带，品种13、15、22、23无带，所以能将前后品种区分开；在1 489 bp处，品种1无带，品种12有带，能将两者区分开。因此，在此24个石榴品种中，引物UBC811可以作为秋艳的特异性引物。

从引物UBC834对山东24个石榴品种扩增结果的“0，1”矩阵(表4)看出，在800 bp处，品种1、3、4、5、7、12、20、21、22有带，而其余品种无带，所以能将这9个品种与其余品种区分开；在1 384 bp处，品种1、3、5、7、22无带，品种4、12、20、21有带，所以能将前后品种区分开；在881 bp处，品种1、3、5、22有带，品种7无带，所以能将品种7与其余品种区分开；在856 bp处，品种1、5无带，品种3、22有带，所以能将前后品种区分开；在680 bp处，品种1有带，品种5无带，所以能将品种1、5区分开。因此，在24个品种中，引物UBC834可以作为秋艳的特异性引物。

8条引物对秋艳石榴良种扩增结果的条带特征图谱见表5。

表3 引物 UBC811对山东24个石榴品种扩增结果的“0，1”矩阵Table 3 “0，1” matrix of 24 tested P.granatum varieties amplified by primer UBC811 in Shandong

注：“0”代表此处无带，“1”代表此处有带，下同。
Note:“0”indicates there is no band; “1” indicates there is a band.The same below.

表4 引物UBC834对山东24个石榴品种扩增结果的“0，1”矩阵Table 4 “0，1” matrix of 24 tested P.granatum varieties amplified by primer UBC834 in Shandong

表5 8条引物对秋艳扩增结果的条带特征Table 5 Band profile of Qiuyan P.granatum variety amplified by 8 primers bp

2.2 桔艳、青丽特异性分子标记引物的确定

从引物UBC835对山东24个石榴品种扩增结果的“0，1”矩阵(表6)看出，在1 888 bp处有无条带，可将品种1、2(青丽)、4、17～24与其余品种区分开；在328 bp处可将品种2与品种1、4、17～24区分开。同理，结合476 bp、287 bp处有无条带，可将品种3(桔艳)与其他品种区分开。因此，在此24个石榴品种中，引物UBC835可作为青丽与桔艳的特异性引物。

从引物UBC840对山东24个石榴品种扩增结果的“0，1”矩阵(表7)看出，在705 bp处无条带、650 bp处有条带，可将品种1、2、3、5、7、8、9、14、15与其余品种区分开；在1 023 bp处有无条带，可将品种2、9与品种1、3、5、7、8、14、15区分开；在500 bp有无条带，可将品种2与品种9区分开。在262 bp处有无条带，可将品种3与其他品种区分开。因此，在此24个石榴品种中，引物UBC840可作为青丽与桔艳的特异性引物。

8条引物对青丽、桔艳良种扩增结果的条带特征图谱分别见表8和表9。

表6 引物 UBC835对山东24个石榴品种扩增结果的“0，1”矩阵Table 6 "0，1" matrix of 24 tested Punica granatum varieties amplified by primer UBC835 in Shandong

表8 8条引物对青丽扩增结果的条带特征Table 8 Band profile of Qingli P.granatum variety amplified by 8 primers bp

表9 8条引物对桔艳扩增结果的条带特征Table 9 Band profile of Juyan P.granatum variety amplified by 8 primers bp

3 结论与讨论

采用优化的ISSR-PCR反应体系，对秋艳、青丽和桔艳3个石榴良种进行ISSR-PCR分析，从ISSR随机引物中筛选多态性好、谱带清晰、扩增稳定的8条ISSR引物，利用这些引物对建立“0，1”矩阵，秋艳的2条特异性分子标记引物为UBC811与UBC834；青丽、桔艳的2条特异性分子标记引物为UBC835与UBC840，同时获得了3个石榴良种各自的特征图谱，初步建立了分子鉴别体系，为山东石榴良种的分子鉴定奠定了理论基础。

近年来，大多数研究者采用分子标记对石榴种质资源进行亲缘关系和遗传多样性分析[12-17]。ISSR分子标记快速易操作，设计引物随机，无需预知基因组序列，同时具有AFLP、SRAP、RAPD 等分子标记的优点，比AFLP、SRAP、RAPD 等标记更适用于不同良种之间的分子遗传学研究，有利于石榴遗传图谱构建、分子标记辅助选择育种及其他相关分子遗传学研究。目前，可应用于秋艳、桔艳和青丽的分子鉴别研究的ISSR引物较少，需加大引物开发力度，以实现这3个石榴良种的精准分子鉴定，从分子水平上提升山东石榴良种化进程。