7例难度较大水生动物染色体体外快速制备方法的建立

张林,何力,张浪,周剑光,甘金华

(农业农村部淡水鱼类种质监督检验测试中心,中国水产科学研究院长江水产研究所,湖北 武汉 430023)

染色体是生物细胞核中载有遗传信息(基因)的物质,是两性生物进化、遗传变异的物质基础,参与生物体的各种代谢活动,对物种繁衍起到重要的作用[1-2]。每种生物染色体具有特定的数目、形态、结构及核型。通过物种间染色体的差别可以对生物进行分类并探讨其亲缘关系,同时也可以为生物的演化提供线索[3]。染色体的观察、分析、数目及核型研究,对了解水生生物分类鉴定、亲缘关系、进化地位、遗传变异规律、雌(雄)核发育、多倍体诱导、杂交育种、种质资源保护等众多遗传学和分子生物学内容的研究具有重要意义[4-5]。因此,在成本低、简单易行、快速的基础上制备出背景清晰、染色体分散良好且形态好的染色体标本很重要,可保障染色体的显带处理、性别鉴定及荧光原位杂交(FISH)分析实验。

水生动物种类丰富,染色体小、数目多。目前,水生动物染色体的研究在取材方面大多选择分裂增殖能力强的头肾(或全肾)。然而,结合多年的实验经验发现,并非所有的水生动物头肾(或全肾)有(或较多)的分裂相。活体注射短期培养法和体细胞体外培养法是制备水生动物染色体常用的两种方法。前者相对较简单快速,往往受科研工作者的青睐。本研究运用活体注射短期培养法,总结了7例难度较大的水生动物染色体制备方法与技巧,供水生动物染色体快速制备参考。

1 材料与方法

1.1 材料

植物血球凝集素(PHA)、秋水仙素(Colchicine)、Giemsa染液均购自Solarbio@LIFE SCIENCES公司;0.075mol/L氯化钾溶液、甲醇、冰醋酸均购自国药集团;芸豆购自武汉市沃尔玛超市光谷分店;实验水生动物采自长江水产研究所种质资源库梁子湖实验基地。

1.2 染色体标本制作

染色体标本制备参考国内外文献报道的体内注射法[6-9],针对不同的品种方法如下：

(1)注射PHA(植物血球凝集素)和秋水仙素。自实验水生动物胸鳍基部、胸腔、腹腔或后腿肌肉注射PHA溶液(0.85%NaCl配制),剂量5～15 μg/g (鱼体质量);24 h后注射秋水仙素溶液(0.85%NaCl配制),剂量2～6 μg/g (鱼体质量)。

(2)注射秋水仙素溶液2～6 h后,放血。取出头、肾、脾脏、腿骨、性腺和脊椎等组织(针对水生动物不同,取不同的组织)用生理盐水反复洗涤。

(3)制备细胞悬液。将所取组织块置于装有少许生理盐水的小烧杯中,用小剪刀剪碎(1 mm3)或研磨组织,加入生理盐水,用100目尼龙纱绢过滤。

(4)离心洗涤细胞。将滤液移入离心管1 000 r/min离心8 min。

(5)低渗处理。0.075 0或0.037 5 mol/L KCl溶液低渗处理45～60 min。

(6)固定。在低渗液内加少许固定液(甲醇∶冰醋酸=3∶1,V∶V,以下同),用吸管吹打混匀进行预固定2～3 min,随后1 000 r/min离心8 min (以下时间同)。再重复固定2次,每次固定20 min。

(7)滴片。将细胞悬浮液滴于预冷载玻片上,随后将载玻片在酒精灯上过火2～3次,自然干燥后用15%姬姆萨染色30 min,蒸馏水将反面冲洗干净,自然干燥后镜检。

在以上通用制备方法的基础上,总结7类水生动物染色体制备方法(表1)。

表1 7类水生动物染色体快速制备方法与技巧Tab.1 Methods and techniques for the chromosome rapid preparation of 7 kinds of aquatic animals

2 结果与分析

2.1 染色体中期分裂相

每条(只)实验水生动物累计统计至少100个中期分裂相,确定染色体数目。对于具有非众数染色体的分裂相,可能是低渗或滴片过程中丢失了少量染色体。本研究中,发现乌龟(Mauremysreevesii)染色体个数为48～53,52的占65%,这与黄喉拟水龟(Mauremysmutica)[10]一致,因此确定乌龟2n=52。2008—2022年,研究发现不同批次、不同地理种群中华鳖(Trionyssinensis)的染色体个数为60～68,66的占67.5%以上,确定2n=66,这与付建平[11]、《中华鳖》(GB 21044—2007)[12]一致。另外研究发现个别三倍体鳖(Plodiscussinensis)3n=198。克氏原鳌虾(Procambarusclarkii)2014年发现拍摄的84张中期分裂相中,为2n=176的占51%,并且拍摄的20张减数分裂相中,n=88的有9张,占45%,当时误以为其众数2n=176,后来通过反复试验,通过不同地方、不同批次的送检样,确定克氏原鳌虾2n=188,文献报道其数目有2n=192[13-14]和2n=188[15]两种众数,本研究与Murofushi等[15]的研究结果吻合。罗氏沼虾(Macrorachiumrosenbergii)2n=118[16]。对于雌雄个体差异显著的鱼类,我们试图找到性染色体,发现刀鲚(CoiliaMacrognathosBleeker)2n(♀)=47,2n(♂)=48,与庄平[17]报道一致。本团队近期研究的大量雌雄金钱鱼(Scatophagusargus)染色体中期分裂相与其相似。牡蛎(Ostreodae)的染色体2n=20,同时发现遗传改良的三倍体牡蛎染色体个数在27～32。3n=30的比例占最多,结合流氏细胞仪测量DNA含量,最终确定普通牡蛎2n=20,而通过染色体加倍分子遗传改良选育的三倍体牡蛎3n=30。确定紫怡贝(Mytilusedulis)2n=48,褐菖鲉(Sebastiscusmarmoratus)2n=48,大泷六线鱼(Hexagrammosotakii)2n=48,青藏冷水性鱼类黑斑原鮡(Glyptosternummaculatum)的染色体2n=48,与武云飞等[18]报道一致。拉萨裂腹鱼(Racomawaltoni)的2n=92,与武云飞等[18]报道不一致,可能与采集样本差异有关。下图为7类水生动物染色体中期分裂相(图1～12)。

图1 乌龟染色体中期分裂相(×1 000)Fig.1 The metaphase chromosomes of Mauremys reevesii(×1 000)

图2 鳖染色体中期分裂相(×1 000)Fig.2 The metaphase chromosomes of Trionyx sinensis(×1 000)

图3 克氏原鳌虾染色体中期分裂相(×1 000)Fig.3 The metaphase chromosomes of Procambarus clarkii(×1 000)

图4 罗氏沼虾染色体中期分裂相(×1 000)Fig.4 The metaphase chromosomes of Macrobraclvium rosenbergii(×1 000)

图5 雌性刀鲚染色体中期分裂相(×1 000)Fig.5 The metaphase chromosomes of female Coilia macrognathos Bellker(×1 000)

图6 雄性刀鲚染色体中期分裂相(×1 000)Fig.6 The metaphase chromosomes of male Coilia macrognathos Bleeker(×1 000)

图7 紫贻贝的染色体中期分裂相(×1 000)Fig.7 The metaphase chromosomes of Mytilus edulis(×1 000)

图8 牡蛎的染色体中期分裂相(×600)Fig.8 The metaphase chromosomes of Ostreidae(×600)

图9 褐菖鲉的染色体中期分裂相(×1 000)Fig.9 The metaphase chromosomes of Sebastiscus marmoratus(×1 000)

图10 大泷六线鱼的染色体中期分裂相(×1 000)Fig.10 The metaphase chromosomes of Hexagrammos otakii(×1 000)

图11 黑斑原鮡的染色体中期分裂相(×1 000)Fig.11 The metaphase chromosomes of Glyptosternum maculatum(×1 000)

图12 拉萨裂腹鱼染色体中期分裂相(×1 000)Fig.12 The metaphase chromosomes of Racoma waltoni(×1 000)

3 讨论

水生动物染色体活体制备方法早有报道,一般活体胸腔或腹腔注射芸豆液(一颗2 g芸豆充分研磨后用10 mL生理盐水浸泡过夜,按0.2～0.5 mL/500 g鱼体质量注射)或PHA(5～10 μg/g鱼体质量),间隔24 h后(少部分物种需间隔48 h),腔体注射秋水仙素(1.5～2.5 μg/g鱼体质量),取样部位为肾脏[19-20]。但此常规方法,并不适宜所有的水生动物,如大鲵(Andriasdavidianus)、螃蟹(Brachyura)等。

2008—2020年期间,对于来自全国不同地方不同批次的大鲵,本团队用以上常规活体制备染色体,发现取肾脏、骨髓无法获得染色体中期分裂相。当在上述的基础上,我们采用PHA两针注射法,首先PHA10 μg/g腹腔注射24 h,再PHA 5 μg/g腹腔注射24 h后,秋水仙素2.5 μg/g注射3 h,取肾脏、脾脏及骨髓可以获得少量分裂相,同时取其他大鲵样本,上述方法注射后,再用0.005%秋水仙素,浸泡以上组织,可以获得稍多点清晰且分散度较好的中期分裂相。

螃蟹也是注射法结合0.005%秋水仙素活体浸泡12 h,取性腺(精巢和卵巢)方可得到染色体减数分裂相及中期分裂相。

染色体制备的另一种方法是细胞培养法,首先建立细胞系,然后分别用适当浓度的PHA刺激及秋水仙素抑制,促使细胞停留在分裂中期[21-22]。此法适合大多数水生动物,也并非所有的水生动物,因为有的品种建立了不同组织来源的细胞系,并传了20多代,秋水仙素用不同的浓度及时间处理,最后得不到染色体中期分裂相,而用活体法在3～5 d内便得到较清晰、分散度较好的中期分裂相,并统计获得雌雄个体的染色体众数。此法费时、费力、成本高,仪器设备要求较高,有的水生动物根本无法建立有效的细胞系。因此,本研究采用PHA或芸豆液注射活体鱼、虾、蟹类等代表性水生动物,用秋水仙素处理后进行染色体制备的方法表明：无论是体外培养法还是体内活体注射法,只有在PHA的刺激和秋水仙素抑制下才能使细胞进入有丝分裂期。当活体生物体内注射适量浓度的PHA,经24～72 h,大多数淋巴细胞正处于第二增殖周期内,此时注射适量秋水仙素,可使许多分裂细胞停止在分裂中期[20-21]。当PHA注射剂量不足时,就不能刺激淋巴细胞转化为原淋巴细胞,使细胞重新进入增殖周期进行有丝分裂。但是,当采用体外培养法时,PHA浓度过大会造成红细胞凝集。体内短期活体培养法即使注射大剂量的PHA也不存在这种现象。对于龟、鳖等生命力顽强的动物用芸豆液,或两者结合比只注射PHA刺激效果好,且芸豆液便宜易得,而且从芸豆中能提取植物血球凝集素。此外,腔体比肌肉注射效果好,对于贝壳类等无法注射的水生动物,采用低剂量PHA浸泡24～48 h[23],获得尽可能多的淋巴细胞。然后采用0.04%～0.05%秋水仙素浸泡12～24 h。当采用体外细胞培养法时,不适合用芸豆液,而只能使用PHA。

秋水仙素是一种细胞纺锤体抑制剂。PHA注射间隔24～72 h后,用秋水仙素处理,作用时间为2.5～3 h,剂量为1.5～3 μg/g鱼体质量。对于刀鲚和银鲳(Pampusargenteus)这种应激反应特别强烈的水生动物,实际操作中PHA和秋水仙素同时注射。秋水仙素溶液的浓度与处理时间存在时效关系。秋水仙素的浓度过高或处理的时间过长,虽然标本中的分裂细胞较多,但染色体过于浓缩、形态特征模糊,难以进行核型分析与后期的细胞遗传学实验[24]。相反,如果秋水仙素的浓度过低或处理的时间过短,则标本中的分裂细胞就少。对于冷水性水生动物,秋水仙素作用的时间稍长,需3～4 h。对于螃蟹、虾、大鲵、黄缘闭壳龟(Cuoraflavomarginata)等水生动物秋水仙素作用时间需要更长,一般肌肉或腹腔注射4～6 h,或采用低剂量的秋水仙素浸泡12～24 h。

使用0.075 0或0.037 5 mol/L氯化钾溶液作为低渗液孵育细胞,使红细胞及分裂细胞的细胞核膨胀、细胞膜破裂,染色体分散良好而便于观察计数。低渗时间40～60 min为宜,当低渗处理时间过长时,细胞膜往往过早破裂,导致分裂细胞丢失,或染色体丢失;当低渗处理时间不足时,细胞膨胀不够,则染色体分散不佳,难以进行染色体计数分析。经过低渗处理的细胞因已膨胀,易破裂,造成染色体丢失,所以低渗后应特别注意不要用力冲吸。

低渗孵育后,1 000 r/min离心6 min,去掉细胞膜碎片。离心时的速度如太慢,会使许多细胞丢失;速度如过快,细胞团块不易打碎。固定液应现用现配,甲醇和冰醋酸按3∶1的体积比配制。如果固定液不新鲜或甲醇、冰醋酸的质量不好时,染色体模糊,并有丝状胞质成分相连。加固定液时,最好沿管壁轻轻的边加边摇晃。

滴片时玻片必须干净、且冰冻过。其次距离恰当、滴加量适当、合适的烤片时间和温度也是获得高质量染色体的必然要求。高质量的染色体是后期显带、染色体遗传操作实验的保障。

染色体标本运用活体注射法,多采用生物细胞分裂能力较强时期或组织获取染色体中期分裂相,一般是头、肾、鳃等代谢旺盛组织,细胞分裂指数高,并且取材及后续的处理简单,易得到较多的中期分裂相[25]。如果在肾中找不到有效分裂相或分裂相不多时,取脾脏、腿骨、骨髓、性腺等,其机制可能与水生动物特有的生理条件有关。

在处理细节上,本研究中发现,乌龟(草龟、黄缘闭壳龟)需用相对大的PHA剂量20 μg/g(体重)腹腔或肌肉注射36～48 h,而其他水生动物,如：淡水鱼或海水鱼只需5～10 μg/g(体重)腹腔或胸腔注射20～24 h,而后再秋水仙素处理,并且作用时间较长1.5 h左右。并且组织具有偏好性,前者取脾脏,后者取肾脏。脾脏是乌龟的免疫器官,同时也是细胞分裂最旺盛的组织。此外,像有壳的贝类,如牡蛎、螃蟹,本研究采用10 μg/L 的PHA充氧浸泡12～72 h,一般浸泡24 h,如果觉得水生动物生命力旺盛,用芸豆液浸泡最好,简单经济效果好。再用0.005%的秋水仙素浸泡过夜。对于虾类,小虾用浸泡法,而大于30 g以上的虾用肌肉注射法,效果更好。有壳的水生物,首先优先取代谢旺盛、分裂指数较高的组织如肾脏、性腺、腮、肝胰脏。虾一般取性腺(精巢或卵巢),可观察到较多的减数分裂相,这将有助于确定染色体中期分裂相众数。

有的水生动物雌雄染色体个数及核型有区别,比如刀鲚2n(♀)=47,2n(♂)=48[17],核型公式：2n(♀)=47t(SAT),2n(♂)=48t(SAT),性染色体可能发生融合。所以在制备染色体时,雌雄个体一般各5～10尾(只),甚至更多的个体,每个个体拍摄较多的中期分裂相,以便观察带有随体和次溢痕的染色体和异型染色体,分析雌雄个体差异及有无性染色体。此外不同实验室条件下的实验处理、实验材料的区域性,分裂相及核型分析结果会略微有差异,但往往差异不显著。

4 结论

本研究运用经典的活体短期注射法,在处理环节上根据每类物种生理生长特异性和组织偏好性,介绍了快速获得7例难度较大的水生动物染色体中期分裂相的方法与技巧,为广大科研工作者进行性别倍鉴定、基因定位、FISH分析等实验需要制备染色体中期分裂相时,根据这7种水生动物的处理细节,快速的获得染色体,为后期的实验打好基础。