恩诺沙星在俄罗斯鲟体内残留消除规律研究

詹士立,何欣,陈效燕,柳爱春*,张发忠,李诗言

(1.杭州千岛湖鲟龙科技股份有限公司,浙江 杭州 311700;2.杭州市农业科学研究院,浙江 杭州 310024;3.浙江省水产技术推广总站,浙江 杭州 310023)

俄罗斯鲟(Acipensergueldenstaedtii),属硬骨鱼纲、鲟形目、鲟科、鲟属。鲟因其营养价值与经济价值高,抗病力较强,卵做成的鱼子酱有“黑色黄金”的美誉[1],经济效益显著,近年来在中国淡水养殖品种中占据重要地位,养殖规模也不断扩大。目前,中国已是世界上最大的鲟养殖与鱼子酱生产国[2]。尽管鲟养殖经济效益显著,但养殖周期较长[3],期间一旦暴发疾病,易造成较大的经济损失,需选择使用抗生素和化学药物来应对鱼类发病[4]。

恩诺沙星(Enrofloxacin) 属于喹诺酮类抗菌药物,是动物专用的抗生素。目前在水产养殖过程中也广泛使用,主要用于细菌性传染病的前期预防和治疗,对鲟气单胞菌[5]、烂鳃病[6]、肠炎病有很好的治疗作用,但长期使用后,会引发药物残留问题,大量研究表明,在许多动物体内,恩诺沙星主要以原药形式通过肾脏排出体外[7],少量恩诺沙星会发生脱乙基反应,代谢生成环丙沙星(Ciproflocacin)[8]后排出体外,不同的种属代谢程度有明显差异。药物残留影响产品的质量安全,尤其目前出口水产品质量安全要求更高,欧洲、美国对进口水产品要求不得检出恩诺沙星等药物残留[9]。因此为确保水产品质量安全,极有必要对俄罗斯鲟体内恩诺沙星及其代谢产物环丙沙星的药动学与消除规律进行研究。

本研究采用口服连续给药的方式,研究一年以内俄罗斯鲟血浆、肌肉和肝脏中恩诺沙星的代谢动力学和消除规律,为恩诺沙星在俄罗斯鲟养殖中的使用和长期代谢消除情况提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验药物与主要试剂

恩诺沙星粉(水产用)(浓度≥98%),山东惠民德赛克生物科技有限公司;恩诺沙星标准品(浓度≥99%),上海安谱实验科技股份有限公司;环丙沙星标准品(浓度≥99%),上海安谱实验科技股份有限公司;恩诺沙星D5内标物,环丙沙星D8内标物,浓度为100 μg/mL,均购自于上海源叶生物科技有限公司;超纯水：采用MILL-Q超纯水仪制备,用水符合《分析实验室用水规格和试验方法》(GB/T 6682—2008)一级水的标准;甲醇(色谱纯),Fisher Chemical 公司;乙腈(色谱纯),Fisher Chemical 公司;甲酸(色谱纯),ROE Scientific 公司。

1.2 主要仪器

AB4500qtrap高效液相色谱仪串联质谱仪(AB SCIEX 公司);HeiVAP型旋转蒸发器(Heidolph公司);Multi Reax型涡旋混合器(Heidolph公司);TTL-DCⅡ型多功能氮吹仪(同泰联科技发展有限公司);ULTRA-TURRAX型均质机(IKA公司);50 mL塑料离心管(Biofil公司)。

1.3 试验鱼的选择

试验用材料鱼为健康俄罗斯鲟,153尾,均为雄性。体重为(4 000±500)g,驯养于杭州千岛湖鲟龙科技股份有限公司基地的鱼池内(鱼池直径15.0 m,水深1.5 m)。体态正常,鳍条完整,体表无明显外伤、无炎症,鳍、鳃镜检无寄生虫,解剖观察肝、脾、肾、肠等组织正常。经随机抽取检测,俄罗斯鲟体内未检出恩诺沙星和环丙沙星。试验前于公司基地的鱼池内(鱼池直径15.0 m,水深1.5 m,第一个月平均水温22.5 ℃,全年平均水温18.5 ℃,RSD=18.07%)暂养一周后开始试验。养殖水质符合渔业水质标准。试验过程中每天测定2次水温。

1.4 给药方式与剂量

给药方式：拌饵投喂,将恩诺沙星粉用水溶解后,加入饲料拌匀后晾干。投饲给药后材料鱼半小时之内吃完,每天按材料鱼体重的0.4%投饲给药。给药剂量：投饲给药一天一次,连续投喂5 d,每天投喂20.0 mg/kg的恩诺沙星(以鱼体单位质量计)。

1.5 样品采集与保存

采样时间点分别为给药后1 h、2 h、4 h、8 h、12 h、1 d、2 d、4 d、7 d、10 d、14 d、21 d、28 d、42 d、60 d、120 d、180 d、270 d和365 d每个时间点随机采集3尾俄罗斯鲟,尾椎取血液至少20.0 mL保存于肝素钠处理后的塑料离心管中,分离血浆。去鳞,沿脊背取肌肉和皮,每一尾俄罗斯鲟取样量不少于1 000 g,置于研磨机中研磨均匀,四分法缩分,分装于洁净容器,密封并标识;取肝脏样品置于研磨机中研磨均匀。样品置于-20 ℃冰箱保存,待测。

1.6 组织中恩诺沙星浓度测定方法

1.6.1 前处理方法

前处理方法参照《动物源产品中喹诺酮类残留量的测定 液相色谱-串联质谱法》(GB/T 20366—2006),并作适当修改。具体方法如下：准确称取5.00 g的样品于50 mL聚四氟乙烯离心管中,加入50 μL 1 000 ng/mL的氘代恩诺沙星内标工作液,涡旋30 s,加入20 mL 2%甲酸-乙腈溶液,均质提取1 min,4 000 r/min离心5 min 后取上清液于50 mL聚四氟乙烯离心管中,残渣加入20 mL甲酸-乙腈溶液重复提取一次,合并提取液[10]。

将上清液转移到125 mL分液漏斗中,加入25 mL乙腈饱和正己烷,振摇2 min,弃去上层溶液,将下层溶液转至100 mL棕色鸡心瓶中,于40 ℃水浴中旋转蒸发至近干,用氮气流吹干。准确加入1.0 mL甲酸乙腈溶液溶解残渣,涡旋混匀后,用一次性注射式滤器过滤至样品瓶中,供液相色谱-串联质谱仪测定。

1.6.2 质谱条件

流速：0.2 mL/min;色谱柱：AQ C182.1 mm×150 mm(3.0 μm);柱温：35.0 ℃,进样量10.0 μL;流动相：A为质量浓度0.15 g/100g的甲酸水溶液;B甲醇。洗脱梯度如下：0～1.0 min,75%A;1.0～8.0 min,75%A～72%A;8.0～9.1 min,72%A;9.1～9.2 min,72%A～65%A;9.2～9.8 min,65%A;9.8～10.0 min,65%A～62%A;10.0～10.2 min,62%A;10.2～10.3 min,62%A～60%A;10.3～11.0 min,60%A;11.0～13.0 min,60%A～75%A;13.0～18.0 min,75%A;各测定目标物的检测参数如表1所示。

表1 恩诺沙星、环丙沙星及内标物的串联质谱参数Tab.1 MS/MS parameters of Enrofloxacin,Ciprofloxacin and internal standards

离子源：电喷雾离子化(ESI)负离子模式;电喷雾电压：-4 500 V;气帘气压力：30 psi;离子源温度：550 ℃;雾化气压力：55 psi;辅助气压力：55 psi;碰撞气：Medium。

1.7 数据处理

采用3p97药动学软件处理数据,选取最适合的房室模型,计算药动学参数。

2 结果和分析

2.1 方法学验证

2.1.1 恩诺沙星和环丙沙星的色谱图

按照1.6.2质谱条件,以恩诺沙星D5和环丙沙星D8作为内标物,恩诺沙星保留时间为15.00 min左右,环丙沙星保留时间为14.72 min左右,恩诺沙星浓度为20.20 ng/mL和环丙沙星浓度为9.5 ng/mL的样品色谱图如图1和图2所示。

图1 恩诺沙星浓度为20.20 ng/mL的色谱图Fig.1 Chromatogram of enrofloxacin in sample at the concentration of 20.20 ng/mL

图2 环丙沙星浓度为9.50 ng/mL的样品色谱图Fig.2 Chromatogram of ciprofloxacin in sample at the concentration of 9.50 ng/mL

2.1.2 标准工作曲线与定量限

移取恩诺沙星和环丙沙星标准溶液并稀释成质量浓度分别为5.00、10.00、20.00、50.00、100.00、200.00和500.00 ng/mL的恩诺沙星和环丙沙星混合标准溶液,同样加入恩诺沙星和环丙沙星内标配置标准曲线。按仪器工作条件进行测定。恩诺沙星和环丙沙星浓度为5.00～500.00 ng/mL范围内,浓度与峰面积的线性关系良好,定量限(LOQ,S/N>10)为5.00 ng/mL。恩诺沙星和环丙沙星的标准工作曲线如图3及图4所示。

图3 恩诺沙星标准工作曲线Fig.3 Calibration curve of enrofloxacin

图4 环丙沙星标准工作曲线Fig.4 Calibration curve of ciprofloxacin

2.1.3 加标回收率

对空白血浆、肌肉和肝脏中加入恩诺沙星和环丙沙星标准品。俄罗斯鲟各组织中恩诺沙星平均回收率在95.00%～100.60%,环丙沙星的平均回收率在94.00%～97.70%,相对标准偏差(RSD)均小于10.00%,符合检测要求。

2.2 恩诺沙星在组织中药代动力学特征

2.2.1 药时曲线

经过测定,每个时间点俄罗斯鲟血浆中恩诺沙星和环丙沙星的质量浓度如表2所示。

表2 给药后不同时间俄罗斯鲟血浆中恩诺沙星和环丙沙星的质量浓度Tab.2 Concentration of enrofloxacin and ciprofloxacin in plasma of Russian sturgeon at different times after drug administration n=3

经过测定,每个时间点俄罗斯鲟肝脏中恩诺沙星和环丙沙星的浓度如表3所示。

表3 给药后不同时间俄罗斯鲟肝脏中恩诺沙星和环丙沙星的质量浓度Tab.3 Concentration of enrofloxacin and ciprofloxacin in liver of Russian sturgeon at different times after drug administration n=3

经过测定,每个时间点俄罗斯鲟肌肉中恩诺沙星和环丙沙星的浓度如表4所示。

恩诺沙星在俄罗斯鲟体内不同组织中的药时曲线如图5和图6所示。

2.2.2 药动学参数及药动学方程

通过C-t散点图判别法,给药后血药浓度(C)对时间(t)在半对数坐标纸上的散点图呈线性分布,恩诺沙星在俄罗斯鲟体内可估为一室模型。经过3p97药动学数据处理软件的分析,投喂恩诺沙星后俄罗斯鲟体内的血浆、肝脏和肌肉中的恩诺沙星呈一室开放模型,药动学参数如表5所示。

表5 恩诺沙星在俄罗斯鲟各组织中的药动学参数Tab.5 Pharmacokinetic parameters of enrofloxacin in different tissues of Russian sturgeon n=3

2.3 恩诺沙星在俄罗斯鲟体内的吸收与代谢残留分析

本实验中采用连续给药的方式,连续5 d给予每尾俄罗斯鲟恩诺沙星20 mg/kg b.w的剂量后持续一年检测俄罗斯鲟血浆、肌肉和肝脏中恩诺沙星及环丙沙星含量的变化。恩诺沙星在各组织的含量整体随时间的变化而递减,在7 d内的变化剧烈,故单独考察7 d内恩诺沙星和环丙沙星在俄罗斯鲟体内不同组织中的药时曲线变化,如图7与图8所示。

图7a 7 d内恩诺沙星在俄罗斯鲟血浆中的药时曲线Fig.7a Drug-time curve of enrofloxacin in plasma of Russian sturgeon during 7 days

图7b 7 d内恩诺沙星在俄罗斯鲟肝脏中的药时曲线Fig.7b Drug-time curve of enrofloxacin in liver of Russian sturgeon during 7 days

图7c 7 d内恩诺沙星在俄罗斯鲟肌肉中的药时曲线Fig.7c Drug-time curve of enrofloxacin in muscle of Russian sturgeon during 7 days

图8a 7 d内环丙沙星在俄罗斯鲟血浆中的药时曲线Fig.8a Drug-time curve of ciprofloxacin in plasma of Russian sturgeon during 7 days

图8b 7 d内环丙沙星在俄罗斯鲟肝脏中的药时曲线Fig.8b Drug-time curve of ciprofloxacin in liver of Russian sturgeon during 7 days

图8c 7 d内环丙沙星在俄罗斯鲟肌肉中的药时曲线Fig.8c Drug-time curve of ciprofloxacin in muscle of Russian sturgeon during 7 days

俄罗斯鲟血浆中恩诺沙星的质量浓度浓度从1 h的1 165.00 μg/kg上升到4 h的峰值2 087.00 μg/kg,随后开始下降,至270 d检出含量低于定量限5.00 μg/kg。肝脏中恩诺沙星质量浓度从1 h的4 339.00 μg/kg开始上升,2 h达到峰值9 896.70 μg/kg,随后开始下降,至365 d仍然可以检出134.72 μg/kg的质量浓度。俄罗斯鲟肌肉中恩诺沙星质量浓度从1 h开始迅速上升,8 h的峰值2 708.70 μg/kg,随后开始缓慢下降至1 d时,仍可以检出1 611.00μg/kg的质量浓度,4 d后开始迅速下降,至90 d检出含量低于定量限(5.00 μg/kg)。

药物代谢速率和种属、温度、给药方式等因素相关[11-12]。赵凤等[13]用高效液相色谱法分析20 ℃条件下恩诺沙星10 mg/kg体重口灌给药后西伯利亚鲟(Acipenserbaer)血液、肌肉和肝脏组织中恩诺沙星及代谢产物环丙沙星的浓度,药物浓度时间数据采用药代动力学软件3p97进行分析,结果表明：消除半衰期分别为32.046 h、354.987 h和252.194 h。郭娇娇等[14]研究了在单次口灌给药途径下,恩诺沙星在杂交鲟(施氏鲟Acipenserschrenckii♂×达氏鳇Husodauricus♀)体内的药代动力学。20 ℃下对杂交鲟单次口灌给药恩诺沙星10 mg/kg体重,恩诺沙星在杂交鲟体内消除较慢,在血液、肌肉和肝脏中的消除半衰期分别为290.139 h、114.900 h和901.835 h。刘慧慧等[15]研究恩诺沙星及其代谢产物环丙沙星在俄罗斯鲟中的代谢及消除规律,制定恩诺沙星在俄罗斯鲟体内的休药期。在水温12～15 ℃条件下,以60 mg/(kg·b.w)剂量对体重为(750±50) g的健康俄罗斯鲟灌服恩诺沙星,消除半衰期以皮肤最大t1/2为394.431 h、血浆最小为129.6 h。研究结果与本研究有显著性差异。本研究在22.5 ℃的条件下连续给药5 d剂量为20 mg/kg的恩诺沙星,血浆、肌肉和肝脏中的消除半衰期分别是53.265 4 h、49.017 9 h和203.517 4 h。表明不同鲟种之间的恩诺沙星消除速率有一定差别,而温度提高时,恩诺沙星在俄罗斯鲟体内的代谢速率会显著上升。本研究采用的个体大小为4 000 g左右的雄性俄罗斯鲟作为试验对象,与刘慧慧等的研究结果比较后表明：同一种属在不同生长期时对相同药物的代谢水平不同,在实际用药时需针对不同生长期的鱼类谨慎用药。

2.4 药效及休药期研究

恩诺沙星药物属于浓度依赖型抗菌药物[16],对水产养殖中常见的细菌性疾病的治疗效果与药动学(Pharmacokinetics,PK)和药效学(Pharmacodynamics,PD)-参数有关,如峰浓度(Cmax)/最小抑菌浓度(Minimum inhibitory concentration,MIC)。一般认为Cmax/MIC>8时,药物即可起到良好的治疗效果[17],当Cmax/MIC=10时可发挥最大治疗效果。本实验表明,在22.5 ℃,当用20 mg/kg的剂量连续5 d混饲给药后,恩诺沙星在俄罗斯鲟血液肝脏和肌肉中的Cmax分别为2.087 0 μg/g、9.896 7 μg/g和2.708 7 μg/g,所以20 mg/kg b.w的恩诺沙星的剂量可满足治疗效果。

“休药期”(Withdrawal Time,WDT)是指动物停止给药到动物性食品(包括可食性组织、蛋、奶等)中药物残留浓度下降至最高残留限量以下所需的时间[18]。中国水产养殖的品种众多,使用的渔药种类及各种药物的制剂类型[19]也较多,极有必要结合水产养殖的制剂水平和用药方式开展休药期研究。根据《食品安全国家标准 食品中兽药最大残留限量》(GB 31650—2019)的规定,恩诺沙星和环丙沙星在鱼肌肉和鱼皮中的含量不得高于100 μg/kg[20]。

以此标准为依据下,恩诺沙星在养殖鱼类中的残留消解规律已有不少研究,但大多以小型鱼类为研究对象,如吉富罗非鱼(JifuTilapia)[21],大黄鱼(Larimichthyscrocea)[22]、鲫(Carassiusauratus)[23],等,结果表明恩诺沙星的休药期大多在600度日以下。目前以大型鱼类成年鱼为对象的研究极少,本研究中在42 d后俄罗斯鲟肌肉中的恩诺沙星和环丙沙星的总含量小于100 μg/kg,平均水温为22.5 ℃,休药期至少为945度日,远高于小型鱼类,因此在使用恩诺沙星治疗俄罗斯鲟成年鱼的疾病时,要严格执行休药期规定,避免产生水产品质量安全隐患。

3 结论

为了解恩诺沙星在俄罗斯鲟体内的代谢消除规律,采用高效液相色谱串联质谱技术测定了连续5 d口服20 μg/(kg·b.w)剂量的恩诺沙星后俄罗斯鲟体内各组织中恩诺沙星的质量浓度变化趋势,并通过3p97药动学软件进行数据处理。研究结果表明：俄罗斯鲟鱼血浆和肌肉中的恩诺沙星在365 d后低于检出限,而在肝脏中仍然有较高浓度的含量;在治疗病害时,20 mg/(kg·b.w)的恩诺沙星的剂量可满足治疗效果;以肌肉和鱼皮计,恩诺沙星在俄罗斯鲟养殖过程中的休药期至少为945度日。