时间:2024-05-24
梁娟,于盟盟,潘玉兰,马腾*,安萍,王芳
(1.日照市海洋与渔业研究院,山东 日照 276826;2.乳山市海洋与渔业监督监察大队,山东 威海 264500)
喹乙醇(Olaquindox, OLA)是一种非抗生素类抗菌促生长剂,具有良好的广谱抗菌效果[1],同时还能促进蛋白质同化,极大地提高动物机体对饲料的转化率和利用率,缩短动物的生长周期[2],被广泛应用于水产养殖的促进生长、抗菌治疗和水生动物疾病的预防[3]。20世纪90年代开始,国内外学者研究发现,OLA及其主要代谢产物3-甲基-喹噁啉-2-羧酸(3-methyl-quinoxaline-2-carboxylic acid, MQCA)具有明显的蓄积毒性、免疫毒性、遗传毒性和致畸性,不但对水生动物的健康造成威胁,而且通过食物链进入人体后会造成人体慢性中毒、产生耐药性,对人类健康造成致畸、致癌、致突变等潜在危害[4-5]。早在1998年,OLA就已经被欧盟禁止作为饲料添加剂[6];原农业部第2638号公告也明确规定停止在食品动物中使用OLA;原农业部标准NY 5070—2002《无公害食品 水产品中渔药残留限量》[8]中规定OLA在水产品中不得检出。但该类药物价格低廉,抗菌促生长效果好,违规添加现象仍时有发生,严重危害人体健康。
OLA稳定性差,在动物体内代谢快,代谢产物多,其中绝大多数代谢产物稳定性差,不具备检测条件,而MQCA代谢过程长、残留量比较稳定,是国际食品法典委员会认定的OLA残留标示物[4,9],也被国内渔业质量安全监管部门作为OLA残留的监控对象。
近几年来,关于MQCA的检测方法报道很多,经查阅文献[1,4-5,7,9-11]和现行有效标准[12-15],液相色谱法和液相色谱—质谱串联法等大型精密仪器分析法为主流检测模式,检测集中在畜禽肉[5,10-11,13,16]、蛋类[9]、水产品[1-3,8,15,17-18]、牛、猪的肝脏、肌肉等动物组织[13]以及奶类[12]等食品相关领域,针对水产苗种中MQCA残留的检测方法未见相关报道。水产苗种作为一类特殊品种,其繁育周期短、季节性强,适合国内渔业质量安全监管部门监督抽查和执法的期限非常短,特别是虾、蟹等甲壳类苗种,适合销售的时间只有短短3~4 d。大型精密仪器分析方法灵敏度高、准确性好,常作为药物残留检测的确证方法。然而,水产苗种样品用大型精密仪器进行检测,受限于前处理技术复杂、检测过程耗时长、检测结果滞后等原因,国内渔业质量安全监管部门应对阳性样品执法销毁时,该苗种已流向养殖环节。此种情况,不但贻误最佳执法时机,而且从养殖源头造成水产品质量安全隐患。因此,建立一种准确、快速、简便的检测方法具有重要意义。酶联免疫法灵敏度高、特异性强,且操作简单、快捷,还能避免产生大量有机废液,具有对人体伤害和环境污染危险性小等优点,是目前MQCA残留定性、定量筛选的主要方法[2,18-19],特别适用于多品种、大批量水产苗种中MQCA残留的快速批量筛查。
本试验以中国对虾(Penaeuschinensis)、三疣梭子蟹(Portunustrituberculatus)、刺参(Stichopusjaponicus)、牙鲆(Paralichthysolivaceus)等常见苗种作为研究对象,在MQCA酶联免疫反应试剂盒的基础上,通过采取HCl溶液替代H2SO4溶液、纯水饱和正己烷脱脂除杂等措施对方法进行优化,以有效减少前处理过程中MQCA的损失,降低基质效应的影响,提高方法灵敏度和准确度,做出方法学论证,以实现对不同基质水产苗种中MQCA的高效、快速检测,旨在治理水产苗种繁育过程中使用违禁药物,为严厉打击违法行为提供及时的技术支撑,提高执法工作的时效性,确保渔业质量安全。
MK3型微孔板酶标仪,赛默飞世尔科技(中国)有限公司;微量移液器、多道微量移液器,赛默飞世尔科技有限公司;PL202-L型电子精密天平,梅特勒托利多仪器上海有限公司;SHZ型水浴恒温振荡器,龙口市先科仪器公司;涡旋混合器,美国Talboys公司;DC-24型水浴氮吹仪,上海安谱实验科技股份有限公司;10D经济型纯水仪,上海摩勒科学仪器有限公司;DNP-9002BS-III型电热恒温培养箱,上海新苗医疗器械制造有限公司;TG16-WS2台式高速离心机,湖南湘仪实验仪器开发有限公司;96孔MQCA检测试剂盒,大连柏尔食品安全技术有限公司;去离子水;乙酸乙酯(AR)、正己烷(AR),上海国药集团化学试剂有限公司;HCl(AR)、H2SO4(AR),天津科密欧试剂有限公司。
本研究以中国对虾、三疣梭子蟹、刺参、牙鲆等常见苗种为目标基体,分别用聚乙烯桶培育4种不同基质苗种的阳性样本和阴性样本作为试验对象。
1.3.1 试剂配制
将1.1中浓HCl与H2O按照1∶2(V/V)配制浓度为4 mol/L HCl溶液,浓H2SO4与H2O按照 1∶8(V/V)配制浓度为2 mol/L H2SO4溶液;将试剂盒自带浓缩复溶液用等体积的纯水稀释,配制样本复溶液;将试剂盒自带20倍浓缩洗涤液与纯水按照1∶19(V/V)稀释为1倍工作洗液。
1.3.2 样品制备与提取
挑出样品中饵料等杂质,用去离子水清洗、沥干,搅碎成糜状,充分混合均匀;准确称取样品(1.00±0.05) g置于25 mL聚丙烯离心管中,加入8.0 mL乙酸乙酯和1.0 mL H2O,振荡5 min;加入1.4 mL 4 mol/L HCl溶液,涡旋振荡30 s,(22.5±2.5)℃ 4 000 r/min离心5 min;移取4 mL上清液,置于10 mL聚丙烯离心管中,(55±0.5) ℃水浴氮气吹干;加入1.00 mL纯水饱和正己烷溶解干燥物,旋涡振荡30 s;加入1.00 mL样本复溶液,旋涡振荡30 s;(22.5±2.5) ℃ 2 000 r/min离心5 min;弃去上层,下层溶液供酶标仪检测。
1.3.3 试验方法
分别移取标准溶液和样本溶液各50 μL置于对应的板孔中,再按以上顺序依次加入50 μL酶标记物和50 μL抗体,轻敲微孔板边缘混匀1 min,用盖板膜盖板后,(22.5±2.5)℃避光孵育30 min;揭开盖板膜,将孔内液体甩干,每孔及时加入洗涤液250 μL,轻敲微孔板边缘混匀1 min,将孔内液体甩干,重复洗板步骤4次,每次间隔15~30 s,最后一次洗板后,应使板尽量甩干并在吸水纸上倒扣、排干(排干后若有气泡,先用洗耳球吹破,再拍干);依次加入50 μL底物缓冲液和50 μL TMB底物,轻敲微孔板边缘混匀1 min,用盖板膜盖板后,(22.5±2.5)℃避光孵育15 min;将板孔加入50 μL的终止液终止显色反应,轻敲微孔板边缘混匀1 min,稳定1 min后,450 nm上机测定(上机前30~40 min打开酶标仪,使仪器状态稳定)。
ELISA试剂盒操作规范规定乙酸乙酯为提取剂。经查文献,样品中MQCA常用提取剂有甲醇[1]、乙腈[10]和乙酸乙酯[15]等有机试剂。本试验考察了3种有机试剂的提取效果:将添加浓度为10.0 μg/kg的加标样品,分别用甲醇、乙腈、乙酸乙酯进行提取。结果表明:用甲醇提取,提取液较为浑浊、干扰成分较多,不利于正己烷净化;乙腈有利于沉淀蛋白,有一定的净化作用,提取液澄清[10],但回收率仅为46.3%~59.2%,可能是乙腈与水互溶,有机相与水相不能分层,提取液中含有较多水分,氮吹时间延长,导致样品中MQCA损失较多,影响回收率。用乙酸乙酯作为提取剂,4种不同基质样品回收率得到明显提高,为66.7%~73.4%。故本方法采用乙酸乙酯作为提取剂。
MQCA为有机强酸,极性较强,在动物体内通过共价键与蛋白质以结合状态存在,需将MQCA水解为游离态之后再对其进行提取。经查阅文献得知,有酸水解[11]、碱水解[5-6]和酶水解[17]等多种方法可供选择。酶水解过程温和但耗时长,需要16~18 h[6,10],碱水解通常反应较为剧烈[5-6],会造成MQCA降解。以这2种方式进行水解,后续还要加酸调节pH至酸性,样品净化处理过程烦琐,不能满足简单、快捷的需求。程春霞等[11]研究发现,采用酸水解的方式可有效沉淀蛋白质,减少杂质干扰,保证较高的提取效率[9,11]。因此,本研究选用酸水解方法。
ELISA试剂盒操作规范规定酸解液为1 mL浓度为2 mol/L H2SO4溶液,考虑到水产苗种样品是整只搅碎混匀[20],其中蟹壳、虾壳和鱼骨中的CaCO3成分极易与H2SO4溶液反应生成CaSO4,CaSO4微溶于水,会包在样品颗粒表面,阻碍MQCA的充分提取,用HCl溶液进行酸解可有效避免这一现象。为验证这种可能性,本试验通过H+等摩尔浓度换算,将2 mol/L H2SO4溶液优化为4 mol/L HCl溶液,将 4种不同基质阴性样品各称取6份,均添加10.0 μg/kg加标水平,分别设置H2SO4溶液和HCl溶液2种酸解条件,每种条件3组平行(表1)。结果表明,酸解液由H2SO4溶液优化为HCl溶液后,除刺参苗种的平均检出水平差异不大外,其他3种苗种的平均检出水平明显提高。由此可见酸解试剂优化的必要性。
表1 不同酸解条件下MQCA的检出水平Tab.1 Detection level of MQCA under different acidolysis conditions
水产品中含有丰富的维生素、糖类、色素、蛋白质、脂肪等物质,基质复杂[2,6,19],且育苗水体中含有微生物制剂,水质粘性大,苗种体表清洗不彻底,导致样品化学成分复杂,乳化现象比较严重,基质效应增加。为有效解决这一问题,本研究用纯水饱和正己烷对样品进行净化,在去除脂溶性杂质的同时将水溶性杂质一并去除,达到良好的净化效果,以提高方法灵敏度和准确性。用MQCA阴性样品添加10.0 μg/kg加标水平,分别用正己烷试剂和纯水饱和正己烷去脂,每种去脂方式设3组平行,分别计算平均检出水平。结果如表2显示,用饱和正己烷去脂的样品检出浓度较高,基质效应明显降低,方法准确度和灵敏度得到提高。
表2 不同去脂条件MQCA检出水平比对Tab.2 Comparison of MQCA detection levels under different degreasing conditions
在HCl溶液固定浓度为4 mol/L的试验条件下,本试验考察了不同HCl溶液添加量对样品中MQCA回收率的影响。称取4种不同基质阴性样品,均添加10.0 μg/kg加标水平,每种基质样品3组平行,HCl溶液添加量为1.0 mL条件下,做加标回收试验。试验结果显示,刺参苗种的回收率为74.3%,其准确度满足食品中禁用药物的质量控制要求[21],中国对虾苗种和牙鲆苗种的回收率处于合格范围最低限值(60%)附近,三疣梭子蟹苗种回收率最低,只达到40.3%,考虑蟹壳、虾壳和鱼骨中的CaCO3成分与HCl溶液发生反应,影响了酸解效果。后续又将4种不同基质阴性样品分别称取5组,每组3个平行,均添加10.0 μg/kg加标水平。分别添加HCl溶液1.10、1.20、1.30、1.40和1.50 mL。如图1所示,在1.10~1.40 mL范围内,刺参苗种回收率依然无明显变化,其他3种苗种的平均回收率随着HCl溶液的增加而提高,1.40 mL时达到最大值;HCl溶液添加量为1.50 mL时,回收率与1.40 mL相比无明显差异。最终确定该方法HCl溶液的添加量为1.40 mL。
图1 HCl溶液不同添加量对MQCA回收率的影响Fig.1 Effect of different addition amount of HCl solution on MQCA recovery
用本研究所建立的方法对样品进行前处理,采用试剂盒提供的MQCA标准溶液制作标准曲线,并使用试剂盒专业分析软件进行定量分析,在0.400~32.400 μg/kg范围内,MQCA呈良好的线性关系,标准曲线方程y=-18.193ln(x)+37.074,相关系数R2=0.996。考虑到渔业监管部门规定水产品中OLA残留限量为50.000 μg/kg,本研究将标准曲线的最高点质量浓度配制为60.0 μg/kg。结果表明,该方法MQCA在0.400 ~ 60.000 μg/kg范围内依然呈良好的线性关系。在4种不同基质阴性样品中添加MQCA标准溶液,在曲线最低浓度做加标回收试验,其回收率和精密度均能满足质量控制要求[21]。该方法样本稀释倍数为2倍,根据结果,确定此方法MQCA检出限为0.400 μg/kg,中国现行标准对水产品中OLA和MQCA的检出限分别为50.000 μg/kg[22]和4.000 μg/kg[15,17],表明该方法的灵敏度较高,优于现行有效标准,能满足检测要求。
考虑到本方法只是筛选方法,阳性样品还需用原农业部1077号公告-5-2008[15]规定的HPLC法进行确证,以4种不同基质MQCA阴性样品作为空白基质,分别进行4.00、8.00和40.00 μg/kg的加标回收试验,每个加标水平设6组平行。按1.3对样品进行提取和测定,各基质样品的加标回收率均在71.4%~95.7%之间,精密度范围为3.9%~7.9%(表3),3个不同加标水平均能满足回收率在60.0%~120.0%、精密度≤15.0%[21]的质量控制要求。
表3 MQCA加标回收率和精密度试验结果Tab.3 Results of adding standard recoveryand precision tests of MQCA n=6
考虑到OLA及其MQCA在动物体内吸收、代谢、转化过程均需要一定的时间,试验开始前,分别培育4种不同基质苗种阳性样本作为试验对象,每种基质样品均称取2组,每组3个平行,分别用上述方法和HPLC法[15]进行测定。由试验结果(表4)得知,2种方法结果均为阳性,且相对偏差范围为5.7~14.9,满足实验室质量控制规范要求[15]。与HPLC法相比,ELISA法前处理操作步骤简单,上机时间明显缩短,能够较好地满足提高渔业质量安全监管部门执法时效性的需要。
表4 ELISA法和HPLC法测定MQCA结果比对Tab.4 Comparison of ELISA and HPLC results of MQCA
本研究在MQCA酶联免疫反应试剂盒的基础上,对前处理过程进行优化改进,通过采取HCl溶液替代H2SO4溶液、纯水饱和正己烷脱脂除杂等措施优化样品前处理技术,建立了一种测定不同基质水产苗种中MQCA残留的检测方法,以期为水产品质量安全监管部门的快速执法提供技术支撑。通过试验验证和实际样品检测结果得知,中国对虾苗种、三疣梭子蟹苗种、刺参苗种、牙鲆苗种4种不同基质样品在0.400~60.000 μg/kg加标水平范围内呈现良好的线性关系,相关系数R2=0.996,4.00、8.00和40.00 μg/kg 3个不同加标水平回收率为71.4%~95.7%,精密度为3.9%~7.9%,方法的准确度与精密度均满足药物残留分析的要求[21]。该方法具有前处理过程简单快速、结果可靠、适用性强、重现性好、灵敏度高等优点,适用于多品种、大批量水产苗种中MQCA残留的快速批量筛查,有效解决了检测结果滞后、执法时效性差等问题。运用灵敏度高、特异性强的酶联免疫法对大批量样品进行定性、定量盲筛,后续结合大型精密仪器对阳性样品进行确证,能够较好的满足渔业质量安全监管部门的需要,是目前水产苗种质量安全监督抽查中值得推广的方法。
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