浸泡免疫中的抗原呈递及其佐剂研究进展

巩华，胡军娜，任燕，赖迎迢，黄志斌

(1. 中国水产科学研究院珠江水产研究所，农业农村部渔药创制重点实验室；广东省免疫技术重点实验室，广东 广州 510380；2. 河南省漯河市源汇区水产技术推广站，河南 漯河 462000)

鱼用疫苗可安全高效地预防水生动物疫病，对环境友好，已成为全球水产疫病防控的主流技术和研究方向[1-3]。其中，浸泡免疫可对鱼群整体接种，操作简单、短时间内实现批量接种、对鱼体刺激小、对鱼种鱼苗接种效果更佳，具有良好推广价值，在欧美、东亚等国家和地区有较多浸泡免疫产品[3-10]。浸泡免疫过程中存在疫苗用量大、个体获得免疫力弱和成本高的问题。浸泡免疫成功与否很大程度上与选择的佐剂有关[3]。佐剂，是一种非特异性的免疫增强剂，与抗原一起使用，可以增强抗原的免疫原性、促进(或调节)机体对抗原的特异性免疫应答的水平(或类型)[3-4]。随着浸泡免疫机理研究的不断进步，鱼用浸泡免疫佐剂研究向着开发“高效稳定、廉价实用”的新型佐剂方向发展，具有重要理论意义和实践价值。

1 浸泡免疫中抗原呈递的研究进展

1.1 抗原呈递途径和部位

浸泡免疫过程中，抗原如何被抗原呈递细胞摄取、加工并呈递给T细胞是诱导免疫应答的关键[5]。大量研究表明，抗原摄取主要依赖于硬骨鱼的鳃、皮肤、侧线和胃肠道等部位黏膜组织的吞噬作用。可溶性牛血清白蛋白(Bovine serum albumin，BSA)和荧光乳汁微球不溶颗粒浸泡斑点叉尾鮰(IetalurusPunetaus)后，都被检测到由皮肤的上皮组织进入机体；而在虹鳟(Oncorhynchusmykiss)浸泡接种BSA后，皮肤和鳃组织都检测到颗粒物质的吸收[6]；在鲤(Cyprinuscarpio)高渗浸泡免疫后，皮肤和鳃的上皮组织会形成暂时性孔道，表明皮肤和鳃都是重要的抗原摄取部位[7]。Moore等[8]研究虹鳟浸泡在与1 μL荧光乳胶结合的BSA微球悬液中，检测微球在不同组织的分布，结果表明皮肤和鳃都参与摄取，皮肤起主要作用，微球至少在皮肤和鳃组织中保留了24 d，而少数微球被转移到脾脏和头、肾；通过定量分析表明，侧线和体表剩余皮肤之间的摄取率没有差异[9]。对大菱鲆(Scophthalmusmaximus)肠道相关淋巴组织(GALT)中的淋巴群体进行免疫球蛋白染色，结果显示，有许多淋巴细胞存在，但在上皮细胞中很少检测到免疫反应细胞，而经常在上皮细胞中观察到固有层，推测为GALT的一部分并参与黏膜免疫反应[10]，目前尚未有确切的途径在所有鱼类中取得一致性意见。

1.2 抗原呈递细胞

从细胞水平上看，确定专属的抗原呈递细胞(Antigen presenting cell，APC)是研究如何提高免疫效率的前提和基础。浸泡免疫后，鲤鳃部颗粒性抗原通过上皮细胞进入单核巨噬细胞，即抗原被上皮细胞摄取，转运到鳃部的吞噬细胞[9]。而在发生吞饮现象的细胞中可见大量吞饮小泡和线粒体分布[11]，这种特点与哺乳类、鸟类的膜性细胞(Membranous cell, M细胞)相似。M细胞主要分布于哺乳动物体内小肠回肠段Peyer区淋巴滤泡上皮中，能对外源性抗原、微粒、微生物及功能因子等外源性物质进行转运、呈递，激发肠道黏膜免疫反应，调节肠道免疫系统[12]。近年来，树突状细胞(Dendritic cells，DCs)或类DCs在鱼类多种组织中被发现，这些细胞与哺乳动物的DCs相似，可吞噬细菌、激活B细胞、刺激T细胞增殖，活化抗原特异性CD4+T细胞及混合淋巴细胞[13]。在虹鳟体内的类DCs可以吞噬脂多糖(Lipopolysaccharides，LPS)小颗粒，激活 Toll样受体在体内迁移，GALT或鳃免疫相关组织中有巨噬细胞能够吸收这些颗粒，并将其运入血液循环中[14]。虹鳟造血组织中还有表面可表达MHCII分子的DCs，与B细胞和巨噬细胞相比，这种单独的树突细胞具有更强的促进淋巴细胞增殖和分化的能力[15]。当然，有些抗原可产生相对独特的免疫反应，如迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)弱毒活疫苗可以黏附和定植在粘膜表面，不需要摄取和呈递，即可高度刺激相关T细胞(CD4+、CD8+)和B细胞，直接诱导粘膜表面的免疫反应，产生免疫保护[16]。

1.3 抗原呈递影响因素

可影响浸泡免疫中抗原摄取呈递的因素很多，如疫苗(抗原)剂量、浸泡时间、渗透压、鱼体规格、抗原状态(颗粒状或可溶性)和水温等[1,3,11,17-20]，每一种因素的影响力需在一定条件范围内发挥作用，超过范围会发生另外的变化。以浸泡时间为例，浸泡时间显然与浸泡液浓度相关，浸泡接种常在浓缩液中短时间进行，也可在稀释液中长时间浸泡。与长时间浸泡在低浓度细菌疫苗液中相比，牙鲆(Paralichthysolivaceus)在高浓度浸泡短时间免疫保护效果更好，可能有更多抗原能够快速进入机体[17]。而在鱼体摄取BSA-PLGA颗粒后检测这些乳胶微球结果显示，低浓度长时间浸泡有助于提高浸泡效果[8]，BSA在高渗条件下摄取数量随着浸泡时间的延长而提高[18]，Nuno等[19]在研究中发现原液100 s或10 min浸泡后抗原的摄取显著少于1∶100疫苗稀释液中浸泡2 h(P<0.05)。但并非所有的时间延长都会增加效果，Tatner等[20]证明采用1∶10稀释的疫苗浸泡5 s和10 s时，抗原的摄取差异不显著(P>0.05)。牙鲆在106和107CFU/mL疫苗液中长时间浸泡确实比短时间浸泡效果好，但在高浓度疫苗液(108和109CFU/mL)中浸泡时间进一步增加，抗原摄取反而会下降，这些结果表明，疫苗浓度和浸泡时间的适当组合将更好地激活粘膜上皮细胞吞噬作用，可能有佐剂促进抗原进入并诱导更强免疫反应的活性，但如果浸泡处理超出实验鱼的耐受范围，会导致对疫苗接种反应能力的丧失[17]。

2 浸泡免疫佐剂研究现状

2.1 佐剂及其分类

添加佐剂是提高免疫效率常用的办法。佐剂可形成缓慢释放的抗原储存库；在接种部位诱导局部炎症反应和免疫细胞迁移；促进APC对抗原的摄取；诱导其他固有免疫细胞分泌相关细胞因子和趋化因子；活化炎性体促进分泌IL-1β等促炎细胞因子；可调节抗原提呈途径及其他尚未发现的佐剂作用机制[21]。目前添加佐剂的目的可分为两大类：一是增强有效抗原诱导的免疫应答水平，降低抗原剂量或减少免疫次数；二是调节或改变疫苗特异性免疫应答的类型，调节免疫应答的功能类型，促进免疫记忆，提升免疫应答速度，改变免疫应答的广谱性、特异性和亲和力等[22]。疫苗佐剂分类目前尚未有公认标准，根据来源可以分为矿物盐佐剂、矿物油佐剂、植物来源佐剂、动物来源佐剂、微生物来源佐剂、细胞来源佐剂、核酸来源佐剂和人工合成有机佐剂等；根据作用机制可以分为疫苗投递载体佐剂、免疫刺激佐剂以及复合佐剂；根据性状可以为分为可溶性佐剂、水包油佐剂(O/W)、油包水佐剂(W/O)、水包油包水佐剂(O/W/O)和颗粒佐剂等，其中按来源分类相对简单清晰，在医学和兽医学应用较多[3-4,18,21]。能用于鱼类浸泡免疫中的佐剂大多在实验室研究阶段，少量实现商品化，如IMS1312、Montanide系列佐剂[18]等。

2.2 渔用浸泡佐剂研发现状

2.2.1 矿物盐佐剂

矿物盐佐剂应用最早、最广泛，20世纪20年代就开始研究并应用于兽医生物制品生产中[3]，主要包括铝和钙化合物，如氢氧化铝、磷酸铝和磷酸钙等。这类佐剂对大分子蛋白质、多糖等吸附能力很强，延缓抗原释放，加强与巨噬细胞及其他APC接触，如铝盐晶体与DCs膜上的鞘磷脂、胆固醇等脂类物质的直接相互作用，诱导DCs的ITAM受体的聚集、并活化下游的SyK及P13K信号通路，强化诱导CD4+T细胞活化和体液免疫应答，提高抗体数倍乃至成百倍的增长[23]。该类佐剂性质稳定，便于运输和储存。铝佐剂还可减轻全身反应，尤其对提纯的制品，如类毒素、细菌疫苗等已经成为不可缺少的组成部分[18]。氢氧化铝的吸附能力强，是唯一一种被美国食品药品监督管理局(FDA)批准用于人用疫苗的佐剂，纳米磷酸钙具有可减少注射局部的炎症反应、诱导Th1细胞反应优势，已经得到了美国专利委员会的授权[24]。很多注射类的疫苗都使用铝胶作佐剂，而在浸泡中仅有少量应用[25]。用含0.5%氢氧化铝胶的大菱鲆虹彩病毒(TRBIV)灭活疫苗2次浸泡免疫大菱鲆，实验室相对保护率(Relative percentage survival，RPS)为83.3%，养殖场的RPS可达90.5%，类似于虹鳟、鲶(Silurusssp.)、真鲷(Pagrosomusmajor)、大西洋鲑(Salmosalar)和石斑鱼(Epinephelussp.)的疫苗效果[26]。铝盐佐剂也存在一些问题：铝盐难以诱导细胞免疫应答；有副作用和安全性问题，如有肾毒性和皮下反应、可导致局部炎症反应和脑部疾病等；不能诱导细胞反应及其对多糖抗原作用有限；特别不适合应用于冻干工艺中，也不能冷冻储存[4,18,27]。

2.2.2 矿物油佐剂

此类佐剂在医学和兽医学临床中常用的主要有弗氏佐剂、佐剂-65(矿物油+植物油)、白油Span佐剂、MF-59、SAF、Montanide系列配方等，其中弗氏佐剂最常用，有弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂，用于注射免疫。在牙鲆注射免疫实验中，弗氏不完全佐剂、氢氧化铝、磷酸铝可分别提高迟缓爱德华氏菌灭活疫苗的RPS 为47%、19%和35%，比单用矿物盐佐剂效果好[25]。弗氏佐剂效力高，但其高毒性、潜在的不良反应和高成本，不适合用于水产疫苗[4]。法国赛比克(Seppic)公司开发应用于鱼用疫苗的Montanide系列佐剂，以矿物油、非矿物油及其混合物为基础，加入表面活性剂(如甘露糖、角鲨烯等)形成乳化液，其类型涵盖W/O、O/W、W/O/W等形式;美国默克公司(Merck)的杀鲑气单胞菌疫苗和鲑传染性贫血病病毒疫苗中分别应用Montanide ISA711、Montanide ISA763A佐剂[18]。这些商品化的疫苗佐剂用量大，在实际操作中，763A与抗原的用量一般为1∶1～2∶1，否则无法包裹抗原出现分层[28]。

IMS1312是一种商品化的O/W型复合佐剂，首先应用于畜禽临床，能诱导体液免疫反应，刺激产生大量的特异性IgG1[29]。这种佐剂应用于浸泡嗜水气单胞菌(Aeromonashydrophila)疫苗中能大幅度提高银鲫(Carassiusauratusgibelio)抗体效价(1∶64和1∶32)和RPS(67.0%和56.0%)，增强免疫应答效果，利于抗原悬浮，促进鱼鳃、体表及肠道对抗原的吸收及其在体内的扩散[30]。鳜(Sinipercachuatsi)浸泡嗜水气单胞菌灭活疫苗后，添加佐剂IMS1312实验组的RPS(77.8%)远远高于无佐剂实验组(44.4%)，且实验鱼皮肤黏液中抗体滴度最高可达210，而血清抗体滴度14 d时峰值为214.3，显著高于无佐剂疫苗组(P<0.05)[31]。但该佐剂成本高，目前其价格远远高于所用疫苗。

2.2.3 植物来源佐剂

植物中多种有机物，能有效刺激免疫系统，提高抗原识别能力。皂角苷，是从皂树中分离的一类多环式化合物配基的配糖体表面活性剂的总称，能在细胞膜上形成“孔洞”，诱导产生相关细胞因子(如Th1 型免疫因子)，引起局部炎症反应，使抗原穿过细胞膜进行抗原呈递。其中QS-21皂角苷应用最广泛，可提高牙鲆鳗弧菌(Vibrioanguillarum)灭活口服疫苗、罗非鱼(Oreochromisspp.)点状气单胞菌(A.punctata)灭活疫苗浸泡免疫效果，RPS可达72.0% 和78.5%，无佐剂组的RPS分别为27.0%和54.1%[32]。皂角苷在鳗弧菌灭活疫苗浸泡免疫大菱鲆实验中，RPS显著提高(P<0.05)[33]。此外，皂角苷能提高对虾非特异性免疫力、刺激鱼类生长，但会使脊椎动物的红细胞溶血，导致细胞膜破裂逐渐溶解[34]。

山莨菪碱是从山莨菪[Anisodustanguticus(Maxim.)Pascher]中提取的一种生物碱，通过提高细胞膜蛋白转运能力，使疫苗更容易进入鱼体内，提高鱼体免疫功能。在浸泡嗜水气单胞菌疫苗中加入终浓度为5 mmoL/L的山莨菪碱免疫鲫，鱼类对药物不存在应激反应，可提高疫苗的RPS[35]。山莨菪碱能促进受免疫草鱼血清中凝集抗体效价较迅速地上升，能显著提高受免疫草鱼血液中吞噬细胞的吞噬活性(P<0.01)，促使草鱼出血病疫苗浸泡免疫RPS达85.0%，远高于对照组30.0%～50.0%[36]，在鳜的嗜水气单胞菌灭活疫苗浸泡免疫中也显示了较好的作用，可以达到60.0%[31]。在嗜水气单胞菌灭活疫苗浸泡免疫银鲫中的RPS达80.0%，无佐剂实验组RPS为56.0%[37]。

中草药中含有植物多糖、生物碱、皂甙、蒽类、挥发油和有机酸等，可明显刺激动物的免疫功能，促进抗体生成、增强免疫细胞活力、促进细胞集落的发育、保护细胞免受生物氧化过程伤害[38]，鳜浸泡接种添加甘草素的嗜水气单胞菌灭活疫苗后，头肾中白细胞的吞噬活性和经活菌攻毒后的RPS显著高于未添加的免疫组(P<0.05)，但凝集抗体效价和补体活性则没有明显差别(P>0.05)[39]，可能与浸泡免疫的机制有关，浸泡过程中黏膜免疫发生机制与系统免疫不同[5,40]。由于鱼类缺乏分化诱导性与效应性粘膜位点，这可能与鱼类细胞膜相关淋巴组织存在更多独立的作用机制有关[16]，结果需要进一步研究证实。

2.2.4 动物来源佐剂

壳聚糖是仅次于纤维素的天然聚合物，其商品化产品主要来源于甲壳动物的几丁质，被证明具有良好的生物粘附性，含有的羟基和氨基可参与氢键的官能团，且聚合物链在一定程度上是柔性链[41]。壳聚糖悬浮液或微粒具有免疫刺激活性[42]，其质子化伯胺基团在酸性条件下，可与带负电荷的生物分子(如蛋白质抗原)相互作用[43]，增加巨噬细胞和多形核细胞的积累和活化，增强抗体反应，提高迟发型超敏反应和细胞毒性反应[44]，具有良好免疫调节特性，且无毒，有良好的生物降解能力和粘膜粘附特性等，被广泛用作免疫佐剂。虹鳟浸泡接种壳聚糖DNA疫苗时[41]，壳聚糖浓度为5.0～10.0 μg/mL时无死亡，而短期暴露于壳聚糖后致死的报道，可能由于聚合物上质子化的氨基与粘膜层的唾液酸及其他阴离子之间相互作用导致的，即使已有研究证明酸化壳聚糖低浓度对虹鳟是有毒的[42]。因此该佐剂的应用，应注意安全条件，目前很多做成纳米颗粒广泛应用[44]。

蜂胶是指蜜蜂将采集的树胶，混入其上颚腺分泌物和蜂蜡等形成的具有芳香气味的胶状固体物质，含有黄酮类、有机酸、萜烯类、芳香醛、酯类、醇类及多种氨基酸、维生素、酶、矿物质等，有效成分主要是黄酮类化合物。蜂胶能调节体液免疫力，具有抗病毒、抗菌、抗氧化、抗肿瘤等特点，然而仅有少数国家将其作为疫苗佐剂研究，主要是中国，其次是巴西、古巴、保加利亚、俄罗斯、埃及以及瑞典[4]。其水提取物被用作嗜水气单胞菌灭活疫苗佐剂，注射后增加了异育银鲫的白细胞活性，提高了相对存活率[45]；其醇提取物作为大菱鲆鳗弧菌等五联灭活疫苗佐剂，其效果和黄芪多糖、弗氏佐剂相当[46]。目前尚未有蜂胶作为浸泡佐剂应用于生产方面的报道，但其能被黏膜吸收，促进巨噬细胞的流动和扩散[4]，具有作为浸泡佐剂的潜力。

2.2.5 微生物来源佐剂

细菌来源佐剂主要来自细菌表面的LPS、霍乱毒素、β-葡聚糖、大肠杆菌不耐热肠毒素、鞭毛蛋白和菌蜕等[2]，能提高非特异性免疫和黏膜免疫，目前关于LPS的研究较多。LPS是革兰氏阴性菌细胞壁的组分之一，能导致实验鱼产生特异性抗体，提高鱼体内巨噬细胞的分裂、游走和吞噬能力[47]。用溶藻弧菌(V.alginolyticus)LPS注射免疫石斑鱼后，既可刺激鱼体产生良好的体液免疫应答，又可显著提高实验鱼血清中相关免疫酶活性，提高鱼体的RPS(P<0.05)[48]。LPS和β-葡聚糖作为疫苗免疫刺激剂使用可显著增强牙鲆的免疫应答水平，提升迟钝爱德华氏菌甘油醛-3-磷酸脱氢酶蛋白亚单位疫苗的免疫效果[49]，在耶尔森氏菌LPS注射和浸泡免疫45天后的攻毒实验表明，处理组的RPS显著高于对照组(P<0.05)[50]，当然浸泡处理的LPS保护效果比注射疫苗组低。LPS 是已知最活跃的病原体相关分子模式之一，但天然LPS往往会增加疫苗的反应性，具有一定的内毒素活性，可以通过对LPS结构进行化学修饰来降低其毒性，同时触发针对特定病原体所需的适当免疫反应，是其在佐剂应用中的关键，如单磷脂A是通过对脂质A进行修饰，降低其内毒素活性并保留其佐剂效应[51]。

细菌菌蜕(Bacterial ghosts，BGs)是革兰阴性菌的细菌空壳，细菌表面保存完好的结构含有天然的免疫刺激剂(如LPS、鞭毛蛋白等)，体内外试验研究表明，BGs具有免疫佐剂效应，能够诱导多种细胞产生前炎症细胞因子，后者可招募T细胞和B细胞聚集淋巴结，在小鼠进行口服免疫时，引起更大的CD4+和CD8+T淋巴细胞反应，进而激活一系列体液免疫、细胞免疫及黏膜免疫应答[52]。采用腹腔注射、口服、浸泡接种菌蜕疫苗后欧洲鳗鲡(Anguillaanguilla)的RPS分别为75.0%、52.5%、37.5%，分别高于无佐剂实验组的55.0%、40.0%、32.5%，且BGs疫苗组死亡时间明显推后，表明BGs疫苗的免疫保护效果优于福尔马林灭活疫苗，免疫后欧洲鳗鲡血清抗体效价均明显升高，而血清抗体效价无显著性差异[53]，BGs单独作为抗原其优势不大，但作为DNA疫苗佐剂，能显著提高机体的免疫应答[52]。

2.2.6 人工合成有机佐剂

细胞因子佐剂和核酸来源佐剂等很少应用于浸泡免疫中，可能存在在环境中稳定性差、细胞微环境中易降解等问题[54]，而有些人工合成有机佐剂性状稳定，在实验中被证明具有浸泡佐剂效果。左旋咪唑(Levamisole，LMS)是一种具有增强细胞免疫作用的合成药物，可使受抑制的吞噬细胞、淋巴细胞、颗粒细胞等恢复正常，提高对细菌、病毒等的保护[55]。Baba等[56]采用10.0 μg/mL的LMS与痘疮灭活疫苗浸泡鲤24 h，实验组感染率从35.0%下降到28.0%，表明该药物可用作病毒疫苗佐剂。当然LMS更多应用于单殖吸虫的防控，在125.0 mg/L泼洒LMS来控制和治疗鱼类养殖中的单殖吸虫感染，有很好的安全性和提高免疫效果[57]。

人工合成的不可溶聚合物纳米微颗粒作为疫苗佐剂，已成为近年来的关注热点，由于其良好的安全性、生物相容性和生物降解性而广泛应用于生物医学领域。在鱼类口服免疫时常用的有效佐剂为免疫刺激复合物(Immune stimulating complex，ISCOM)。ISCOM是由嵌入佐剂皂甙、胆固醇、卵磷脂与抗原在溶液中按1∶1∶1∶1的比例，相互作用形成脂质小泡，能诱导宿主同时产生体液免疫、细胞免疫和非特异性免疫。ISCOM安全性好，性质稳定，能通过粘膜接种而用于浸泡免疫[58]。创伤弧菌(V.vulnificus)ISCOM疫苗通过注射、浸泡和灌胃接种途径接种欧洲鳗鲡均健活、无毒副作用[59]。嗜水气单胞菌β-hemA-ISCOMs疫苗浸泡免疫欧洲鳗鲡，其RPS、淋巴免疫细胞转化率和血清抗体效价均显著高于其他试验组(P<0.05)[60]。该佐剂适用于膜来源抗原，对基因重组蛋白抗原等很难实现可重复的、有效的抗原装载，其中高剂量的皂甙会加重ISCOM的副反应，再次免疫接种抗体水平增强不明显，且很难大批量生产[58]，这些问题制约了该项技术商品化应用。目前该佐剂已被纳入许多商业化的陆生动物疫苗中，挪威法玛克(Pharmaq)水产医药公司正在研究如何将该佐剂引入商业化的鱼类疫苗产品中[44]。

3 研究展望

3.1 浸泡免疫基础理论研究待深入

浸泡免疫研究在抗原的摄取、加工、呈递和反应等方面不断取得新进展，但鱼体内经典的黏膜免疫反应单元目前尚未发现。DCs是已知的功能最强的APC，是激活高等动物初始T淋巴细胞发生反应的唯一细胞，在先天性免疫、适应性免疫以及维持自身免疫耐受方面具有重要作用，而在硬骨鱼类中，对于DCs的分子标记还不确定，而且分布数量少[13]。关于鱼类的黏膜免疫球蛋白IgZ和IgT的功能还不清晰[14]，目前在虹鳟中发现了嗅觉器官内的骨髓和淋巴细胞的扩散网络，CD8+T细胞、IgT+B细胞聚集在嗅层的粘膜顶端，MHCII+细胞位于更靠近鼻腔内腔的神经上皮区域，免疫细胞的分布表明硬骨鱼嗅觉器官有独特的局部免疫环境，不干扰感觉功能；且参与后天和先天免疫的基因在鼻腔组织中均有表达，表明鼻腔内腔是重要的免疫器官[61]，但尚未有关于细胞迁移和归巢等经典的黏膜免疫反应活动的报道。因此对于浸泡过程中鱼类如何识别抗原和非抗原，同时如何抵御病原侵袭，特别是在抗原的呈递方面，体液免疫和粘膜表面局部免疫如何紧密联系，如何诱导全身免疫反应，并形成免疫记忆，如何快速、有效、稳定的刺激机体产生长效免疫保护等方面，需要继续深入研究。

3.2 新佐剂材料的筛选和构建

纳米微球佐剂具有副作用少、缓释、长效、保护疫苗抗原不被水解，增强疫苗有效成分呈递的效果，已开展的纳米铝、纳米钙的佐剂研究效果明显[24]。1995年首次开展了大西洋鲑PLGA纳米微球口服研究，PLGA在七带石斑鱼(E.septemfasciatus)神经坏死病毒(NNV)活疫苗的免疫保护研究中发现，其效果明显(93.7%/9.8%)，且保护作用能够持续10个月[62]；对虹鳟、牙鲆、石斑鱼、草鱼(Ctenopharyngodonidellus)和鲫等开展了PLGA、聚-DL-乳酸-聚乙二醇共聚物(DL-polylactide-co-polyethylene glycol，PELA)纳米微球研究，均有较好的口服免疫增效作用[2]。野田村病毒灭活疫苗制成PLGA纳米粒后，浸泡接种免疫斜带石斑鱼苗，RPS可以从39.0%～43.0%提高到85.0%，有效降低神经坏死造成的死亡率[63]。目前该项技术限于成本和技术成熟度问题，尚未实际应用，但为病毒灭活疫苗的研究开发提供了新的思路。这些载体疫苗佐剂可以和免疫增强类佐剂复合使用，能最大程度增强疫苗的免疫应答，减少抗原的降解，诱发不同类型的免疫反应，上调对机体的全面保护，在医学上已成为佐剂发展的一大趋势[21]。

3.3 新投递方式的辅助

一些投递方式和佐剂联合使用可提高免疫保护。鲤浸泡在4.5%的氯化钠高渗环境中，体表约5.0%的上皮细胞变圆脱落留下细胞大小的孔，到淡水去离子后20 min，这些小孔大部分被封闭，皮肤整体形态与对照组相同；在此过程中鳃丝上皮细胞很少脱落，但片层内部明显受到干扰，上皮明显隆起，形成半细胞大的孔隙。这些孔隙可以增加APC与抗原接触，加快摄取速度，提高浸泡免疫效果[7]。高渗环境(1.5%的氯化钠)与葡聚糖佐剂在嗜水气单胞菌灭活疫苗对鳜的免疫保护实验中效果相当(RPS均为66.7%)，高于单用疫苗结果(44.4%)[31]，提高盐度可明显提升疫苗的免疫保护。在浸泡过程中还可通过高压枪或超声波等方式提高疫苗的递送效率。Navot等[64]发现低频超声波能提高浸泡BSA后金鱼(C.auratus)APC的促进吸收作用、皮肤抗原转运能力和抗体的产生，因此所需要抗原量仅为无超声浸泡的1/5。Zhou等[65]用脉冲式超声波处理青石斑鱼(E.awoara)可以显著提高溶藻弧菌灭活疫苗浸泡免疫效果(P<0.05)，浸泡2 min，连续施加35 kHz的超声波2 min，再次浸泡2 min，4周和8周后攻毒RPS与注射免疫效果相当。这些辅助手段需大型设备或额外操作，劳动强度大，鱼体应激大，需进一步简化操作，细化参数和安全问题。

使用佐剂提高免疫效率，是解决浸泡免疫效率不高的直接办法。目前对浸泡佐剂和操作技术的筛选，缺乏切实的针对性，不能有效应用于实际生产，制约了产业发展。随着新材料新技术的应用，越来越多的佐剂及使用技术将引入浸泡免疫研究中，将会改变水产疫苗的构建、生产和使用方式，促进鱼病防治技术进步，特别是重大疫病的防控。