机器视觉技术对氯化三苯基四氮唑染色法鉴定玉米种子生活力的改进

潘 同 吴伟锋 侯浩楠 许亚男 涂柯玲 顾日良 王建华 孙 群

(中国农业大学 农学院/农业农村部农作物种子全程技术研究北京创新中心/ 北京市作物遗传改良重点实验室，北京 100193)

玉米是我国第一大作物，是重要的粮食、饲料和工业生产原料。玉米在我国农业发展中占有重要的地位，具有较强的耐旱性、耐寒性、耐贫瘠性以及极好的环境适应性，种子的出苗率是玉米产业发展的基础，直接影响田间表现及最终产量。

ISTA(国际种子检验协会)将四唑染色法列为种子生活力检测的标准方法，应用广泛。其主要原理是通过氯化三苯基四氮唑(TTC)与活细胞的还原反应产生红色的三苯基甲，指示种子是否有生活力。为了保证结果的准确性，在种子胚部染色程度和染色部位等方面的鉴别，对操作者的经验具有较高要求。且人眼识别易受主观影响，重复性不足。计算机图像识别技术能够模拟人的视觉功能，又具有信息自动提取、运算速度快和重复性好等特点，在种子活力检测、种子识别、种子精选和质量检测等种业领域的应用越来越广泛。叶凤林等提取黄芩种子的颜色和体积等物理指标并探究与种子活力之间的相关性，通过单指标筛选，识别准确率达78.5%。Tu等通过机器视觉技术提取单粒辣椒种子的形态和颜色指标，建模分析种子生活力，预测准确率最高达79.0%。Kurtulmu等利用颜色、形状和纹理等信息建立ANN(人工神经网络)模型，最终建立的辣椒种子生活力预测模型准确率达84.9%。赵新子等和章华仙利用计算机图像分析系统分别对TTC染色后的玉米和水稻种子胚部进行图像采集，以染色部分占胚部总面积超过2/3代表有生活力，将判定结果与标准发芽试验及人工判断结果进行分析，得到一系列回归方程表明三者之间存在显著的相关性，生活力判断准确率可以达到93.7%，发芽率预测

R

均达到0.9，但该方法需要人为设定颜色阈值从而确定染色面积。

章华仙和董翠翠等探究过基于TTC染色玉米种子图像处理获得的染色面积比例与种子生活力的关系，但是种子染色胚部颜色指标与种子生活力的关系尚未见报道，因此，本研究以‘三北6号’玉米种子为材料，将TTC染色法与计算机图像识别与处理技术结合，建立基于玉米染色胚部颜色特征的玉米种子生活力预测模型，旨在通过引入机器“视觉”技术，降低对操作人员经验的依赖，从而提高种子生活力检测结果的准确性和可重复性，以期为作物种子检测的自动化和标准化提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

玉米品种为‘三北6号’，收获年份为2015年，产地为甘肃省张掖市，实验室条件(25 ℃，RH 30%)下存放。验证所用的6个不同品种的玉米种子，分别编号V、V、V、V、V、V，实验室条件(25 ℃，RH 30%)下存放。

1.2 试验方法

1

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2

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1

标准发芽试验

取‘三北6号’和验证所用的6份玉米种子各300粒进行标准发芽试验。发芽盒底部放置一块薄海绵，并加入足量蒸馏水，以不超过海绵块顶部为准，海绵块上放置发芽纸，以确保不同发芽盒以及整个发芽期间水势一致。置种，然后将发芽盒置于25 ℃ 发芽室中进行光照培养，发芽第7 d记录发芽率。

1

.

2

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2

TTC染色测定

将种子放入装有蒸馏水的锥形瓶中，在室温下(25 ℃)浸泡24 h，使种子充分吸胀。随机选取吸胀种子300粒，将玉米种子沿胚中线纵向切开，任取其中半粒。参照标准TTC染色的方法，将处理好的玉米种子置于0.1% TTC溶液中，在30 ℃、黑暗条件下染色2 h。染色结束后，将染色的玉米种子用蒸馏水冲洗3遍，以便后期观察染色情况和进行图像采集。

1

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2

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3

机器视觉及图像分割TTC染色后的玉米种子切面朝下，置于Microtek MiCardWizard扫描仪(上海中晶科技有限公司)的玻璃板上，以600 dpi的分辨率对其进行扫描，得到TIF格式文件。将扫描得到的TTC染色后胚部图像利用Image J(NIH)软件处理，去除图像背景，保留种子胚部，再使用种子表型自动化分析系统(PhenoSeed，中国农业大学种子科学与技术研究中心与南京智农云芯大数据科技有限公司共同研发)，提取每一粒种子胚部的颜色特征。颜色特征包括

R

(红色值，Red)、

G

(绿色值，Green)、

B

(蓝色值，Blue)、

H

(色相，Hue)、

S

(饱和度，Saturation)、

V

(明度，Value)、

L

(亮度，Luminosity)、

a

(从红色至绿色的范围)、

b

(从黄色至蓝色的范围)、Gray(灰度)及标准差(std)，共20个指标。

1

.

2

.

4

生活力鉴定

邀请3名专业人员对玉米种子胚部的染色情况进行观察鉴定。鉴定标准：胚芽或者切面的染色面积超过胚部面积2/3的，确定为有生活力的种子，反之染色面积少于胚部面积1/3的或者胚芽未染色的则为无生活力种子，见图1。

图1 通过染色程度鉴别不同活力的玉米种子Fig.1 Seed viability determination of maize seeds by staining degree

1

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2

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5

胚部染色面积及胚部总面积计算

利用Image J软件将扫描图像转为8-bit灰度图像(图2)，调整背景和胚部的颜色对比度，用阈值算法将阈值调整为1～255，框选出胚部，然后测得胚部面积。同理，继续将其阈值调整，框选出染色部分，测得其面积。染色比例为种子纵切面的胚部染色面积占胚部总面积的比例。

1

.

2

.

6

数据分析及建模

利用WPS Office 2019和IBM SPSS Statistics 20等软件进行方差分析、相关性分析及模型建立。获取胚部染色图片后，导入PhenoSeed软件，提取出颜色特征指标，将这些指标分别作为多层感知器神经网络(MLP)、支持向量机(SVM)、随机森林(RF)的输入，以有生活力(1)和无生活力(0)作为输出结果，建立基于TTC染色的玉米种子生活力鉴定模型，见图3。建模时，训练集与检验集的比例均为3∶1。

图2 Image J计算玉米种子胚部四唑染色面积Fig.2 Calculating tetrazole staining area of maize seed embryo by Image J

MLP，多层感知器；SVM，支持向量机；RF，随机森林；x1～4，特征1～4； h1～5，隐藏单元1～5； O1，结果1。 MLP, multilayer perceptron neuralnetworks; SVM, support vector machine; RF, random forest; x1～4, feature 1～4; h1～5, hidden unit 1～5; O1, output 1.图3 数据分析与建模Fig.3 Data analysis and modeling

1

.

2

.

7

生活力鉴定模型的验证

2018年从不同公司收集的6份不同品种的玉米种子，每份种子各取300粒，重复1.2.2和1.2.3的步骤。依次将提取出的各个品种的颜色指标代入1.2.6所建的种子生活力鉴定模型，获得该品种生活力的预测结果，并与1.2.1中进行的标准发芽试验获得的该品种实际发芽率进行比对，从而验证基于胚部TTC染色提取的颜色指标建立的生活力预测模型在实际玉米种子生活力检测中应用的可能性。

2 结果与分析

2.1 ‘三北6号’玉米种子染色切面胚部颜色特征与种子生活力指标的相关性分析

由表1可知，玉米胚部的

R

、R-std、

G

、G-std、

B

、B-std、

L

、L-std、

b

、b-std、

H

、S-std、

V

、V-std、Gray、Gray-std与种子生活力呈极显著负相关，其中

B

相关系数最低，为-0.6左右。

a

、

b

、

S

特征指标与生活力呈极显著正相关，其中

S

的相关系数最高，为0.6。因此，可以利用染色胚部颜色特征预测玉米种子生活力，实现基于TTC染色图像的玉米种子生活力标准化测定。

表1 PhenoSeed软件提取种子染色胚部的颜色特征的相关性分析
Table 1 Correlation analysis of color features of dyed embryo extracted by Phenoseed software

颜色特征Color feature值Value相关系数Correlation coefficient变异系数/%Coefficient of variationR198.99±5.53-0.29**2.78R-std20.63±3.12-0.31**15.12G119.33±16.99-0.59**14.24G-std34.26±6.60-0.44**19.26B100.19±16.23-0.62**16.20B-std35.85±6.72-0.49**18.74L58.79±4.67-0.57**7.94L-std9.96±2.06-0.51**20.68a29.83±5.700.61**19.11a-std11.82±1.84-0.0815.57b25.02±3.450.57**13.79b-std8.64±1.10-0.18**12.73H10.03±2.84-0.33**28.32H-std22.02±8.03-0.0236.47S128.12±18.010.62**14.06S-std40.75±6.20-0.25**15.21V199.01±5.53-0.30**2.78V-std20.58±3.10-0.31**15.06Gray140.97±12.94-0.58**9.18Gray-std28.01±5.52-0.48**19.71

注：，红色值；R-std，红色值的标准差；，绿色值；G-std，绿色值的标准差；，蓝色值；B-std，蓝色值的标准差；，亮度；L-std，亮度的标准差；，红色到绿色的范围；a-std，红色到绿色的范围的标准差；，蓝色到黄色的范围；b-std，蓝色到黄色的范围的标准差；，色调；H-std，色调的标准差；，饱和度；S-std，饱和度的标准差；，明度；V-std，明度的标准差；Gray，灰度；Gray-std，灰度的标准差；**表示在0.01水平上差异极显著。

Note: , red; R-std, standard deviation of red value; , green; G-std, standard deviation of green value; , blue; B-std, standard deviation of blue value; , luminosity; L-std, standard deviation of luminosity value；, red to green range; a-std, standard deviation of red to green range; , blue to yellow range; b-std, standard deviation of blue to yellow range; , hue; H-std, standard deviation of hue; , saturation; S-std, standard deviation of saturation; , value; V-std, standard deviation of value; Gray, gray; Gray-std, standard deviation of gray; ** indicates significance at <0.01.

2.2 基于TTC染色切面胚部颜色特征的单粒玉米种子生活力检测模型

基于Phenoseed软件提取出来的单粒玉米种子TTC染色后胚部颜色特征数据，分别采用标准正态转换(SNV)、多元散射校正(MSC)、一阶导数(1-Der)、二阶导数(2-Der)进行数据预处理，然后按照训练集∶检验集=3∶1，分别建立MLP神经网络(隐藏层数为2)、RF(n-estimators=500)和SVM(c=445.72，g=0.014，RBF核函数)3种模型，见图4。基于胚部颜色特征的种子生活力检测模型中MLP神经网络模型优于SVM和RF模型，其中2-Der-MLP 神经网络模型最好，其检验集的准确率为87.80%。故可以利用基于TTC染色切面胚部颜色指标的MLP神经网络模型对种子生活力进行判断。

RAW，原始数据；SNV，标准正态转换；MSC，多元散射校正；1-Der，一阶导数；2-Der，二阶导数；数字表示模型准确率。 RAW, raw; SNV, standard normal variation; MSC, multiplicative scatter correction; 1-Der, 1-derivative; 2-Der, 2-derivative; Numbers denote the accuracy of digital representation model.图4 基于不同预处理建立的单粒玉米 种子生活力模型准确率Fig.4 Accuracy of single maize seed viability model based on different pretreatment

2.3 基于胚部染色面积的单粒玉米种子生活力快速检测

在实际染色面积计算中，需要确定染色比例与颜色阈值，两者设定不同阈值都会影响最终结果的准确率。根据专业判断种子生活力的情况和胚部颜色阈值，确定判断种子生活力的染色比例。由表2可知，对玉米种子TTC染色图像进行颜色转换和二值化处理，按照阈值150计算出胚部染色面积和胚部总面积，得到染色面积占胚部总面积的比例。结合传统TTC法测定种子生活力的判断依据，以胚部染色比例>2/3的种子为有生活力种子，胚部染色比例≤2/3的种子为无生活力种子，与人工鉴定结果对比，准确率可达85.4%。与2.2所建模型的准确率基本相同，但直接使用颜色特征建立模型可以省去阈值筛选的过程，数据处理和分析过程更为简便易行。

表2 基于不同分类依据的玉米种子生活力预测准确率
Table 2 Accuracy of prediction for maize seed vitality based on different classification methods

活种子分类项目Classification project of live seeds颜色阈值Threshold valueof colour染色比例Stainingratio准确率/%Accuracy<140>0.5382.5<150>0.6685.4<160>0.7584.5<170>0.8385.4<180>0.9086.4

2.4 2种单粒玉米种子生活力检测方法的验证

选取6份验证所需的玉米种子，分别对基于TTC染色胚部提取的颜色指标建立的最优MLP生活力检测模型、基于胚部染色比例的单粒玉米种子生活力快速检测方法进行验证。由图5可知，将TTC染色后胚部的颜色指标代入MLP生活力检测模型所得到的生活力(实际以发芽率表示生活力)的预测值、根据胚部染色比例得出的生活力预测值和每个品种本身的真实发芽率情况并无显著差异(

P

<0.05)。故使用基于MLP神经网络和染色胚部获得的颜色指标建立的生活力检测模型或者基于胚部染色比例的单粒玉米种子生活力快速检测方法均可对种子批的发芽率进行预测。但从操作的角度考虑，使用基于TTC染色后胚部颜色指标建立生活力检测模型的方法更为简单，因为无需选择颜色阈值或计算染色比例。该方法更能满足实际应用中对种子质量快速检测的需求。

V1～6，样品1～6。V1～6, sample 1～6.图5 预测的发芽率与真实发芽率的关系Fig.5 The relationship between the germination rate predicted and the real germination percentage

3 讨 论

本试验选用原始发芽率为56%的‘三北6号’玉米种子，浸种24 h后进行TTC染色，利用PhenoSeed软件提取染色后种子胚部切面的颜色指标，结果发现

R

、R-std、

G

、G-std、

B

、B-std、

L

、L-std、

b

、b-std、

H

、S-std、

V

、V-std、

Gray

、Gray-std与种子生活力均呈极显著负相关，其中

B

与种子生活力相关系数最低，为-0.6左右。种子生活力与

a

、

b

、

S

特征均呈极显著正相关，其中与

S

的相关系数最高，为0.6。

R

与生活力负相关，相关系数仅为-0.29，这种平时根据红色程度进行判定的结果不符，原因有待于进一步探究。

基于TTC染色法的胚部切面颜色指标建立的MLP神经网络模型，对玉米种子生活力的预测准确率可达85%以上。赵新子等提出采用图像处理技术自动提取胚部染色比例的方法来进行生活力的判定，结合本研究选取的材料，调整阈值为150，生活力预测准确率达85.4%。基于染色胚部颜色指标建模和基于胚部染色比例2种方法均可以有效检测种子生活力，减轻对操作人员经验和主观的依赖。但基于胚部染色比例的方法需要人为预先筛选判定和调整染色比例的阈值，不如直接使用颜色指标建立模型的方法简便。

进一步利用6个不同品种的玉米种子对上述2种方法进行验证。基于染色胚部的颜色指标建立的MLP神经网络模型对6个玉米品种的发芽率进行预测，结果表明与实际发芽率无显著差异，说明使用机器视觉技术获取TTC染色后种子胚部的颜色指标结合MLP神经网络模型对不同品种玉米种子的生活力预测是可行的。但在实际应用的过程中，模型的准确率有待进一步的提高，未来可结合不同TTC染液浓度、染色时间、反应温度进行更为全面的探究，以期进一步提高生活力预测的准确率。因此，在实际生产上，将基于TTC染色后胚部颜色指标的玉米种子生活力检测方法应用于种子生活力的检测仍需更深入的优化。

4 结 论

本研究以‘三北6号’玉米种子为试验材料，将吸胀24 h的玉米种子纵切，露出胚部切面，置于0.1% 氯化三苯基四氮唑(TTC)溶液，30 ℃黑暗条件下染色2 h，使用PhenoSeed软件进行图像分析，提取单粒玉米种子TTC染色后胚部的颜色指标(

R

、

G

、

B

、

H

、

S

、

V

、

L

、

a

、

b

、Gray及标准差)，结合人工观察鉴定，结果表明，基于‘三北6号’玉米种子TTC染色后胚部的颜色特征建立的MLP生活力检测模型，准确率均达到85.0% 以上。该方法在简便性方面具有很大优势，同时可最大程度地避免人为鉴定的误差。