百合LhTPS基因启动子的克隆及序列分析

韩 婷 王 婷 李兴桃 杜 方

(山西农业大学 园艺学院，山西 太谷 030800)

萜烯合酶(Terpene synthase，TPS)作为萜烯途径中最后一步关键酶，对各种萜烯类成分的合成具有重要意义。萜烯类物质作为植物体内一种重要的次生代谢物，具有引诱昆虫授粉和抵御逆境胁迫的作用，也有许多萜烯类物质被用于工业、医药和食品行业。小分子的萜烯类化合物还是植物花香挥发物的重要成分，对于刺激消费，提升观赏植物的商业价值具有不可低估的重要性。

百合是具有高商业价值的观赏植物，市场上常见的品种多属于亚洲百合杂种系(Asiatic，A)、东方百合杂种系(Oriental，O)、喇叭百合杂种系(Trumpet，T)以及东方百合和喇叭百合的组间杂种系东喇百合(Orienpet，OT)。其中，亚洲百合常无香，其它种类百合常有香。提升亚洲百合的香味以增加其商业价值是百合育种的目标之一。萜烯类物质是有香百合的主要挥发性成分，已有学者从百合中克隆到与萜烯类化合物释放相关的

LhTPS

基因，其在浓香型百合中的表达量显著高于无香型，但基因表达差异形成的原因尚不可知。高等植物基因表达主要由启动子与转录因子之间相互作用进行调控，克隆百合

LhTPS

基因启动子是解析其基因调控因子及作用机制的前提。目前，已经在百合中克隆到只在雄配子细胞中表达的

LGC1

基因启动子、与花色形成相关的

CHS

、

ANS

基因启动子和逆境胁迫诱导型

GPAF

启动子等，但尚未获得

LhTPS

基因启动子序列。本研究利用反向PCR技术在不同百合品种中克隆

LhTPS

基因的启动子，并利用生物信息学方法比较品种间启动子序列的多态性和作用元件的差异，为日后进行

LhTPS

启动子活性和功能分析奠定基础，也为阐明百合萜类挥发物形成的调控机制奠定了理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

试验材料种植于山西农业大学园艺试验站露天苗圃(112° E，37° N)。选用品种包括亚洲百合‘Pearl Melanie’‘Red Life’，东方百合‘Entertainer’，东喇百合‘Friso’‘Urandi’‘Mister Sandman’以及喇叭百合‘Pink Perfection’‘Orange Planet’。采摘露天苗圃中8个百合品种健康植株的嫩叶，液氮速冻后储存于-80 ℃超低温冰箱用于DNA的提取。

1.2 DNA提取

采用CTAB法提取百合幼嫩叶片基因组DNA，用1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量，用NanoDrop 2000生物光度计检测DNA浓度和纯度，-20 ℃保存备用。

1.3 反向PCR法克隆‘Red Life’和‘Entertainer’LhTPS基因5′侧翼片段

基于已知‘Sorbonne’

LsoTPS

基因组DNA序列(

LsoTPS

-

gDNA

，MH618207)在

Bgl

Ⅱ酶切位点上游设计正向引物IPCR-1F(5′-CAAGTGATGGAGGACGCTAAAG-3′)，在

LsoTPS

基因 5′端设计反向引物IPCR-1R(5′-CTTGGACAACTGACAATGCGAG-3′)。用

Bgl

Ⅱ为内切酶对‘Red Life’和‘Entertainer’基因组DNA进行酶切、DNA环化并使用通用型DNA纯化回收试剂盒回收DNA。以‘Red Life’和‘Entertainer’基因组DNA为模板进行第一次反向PCR，反应体系20 μL，包括PCR Mix 10 μL，IPCR-1F和IPCR-1R 各0.5 μL，gDNA 2 μL，ddHO 7 μL。PCR反应程序为94 ℃预变性3 min，之后为35个循环的变性(94 ℃，30 s)、退火(56 ℃，30 s)和延伸(72 ℃，2 min)过程，最后在72 ℃ 延伸10 min。PCR产物经胶回收、连接、转化和筛选等一系列过程送生工生物工程(上海)股份有限公司测序。测序序列与‘Sorbonne’

LsoTPS

基因组DNA序列进行拼接，以IPCR-2F(5′-CGGAACACACTTGAAAGGAGAA-3′)和IPCR-2R(5′-TACTCCACCAGAATCAACCCTC-3′)为第2次步移的引物进行PCR，PCR的反应体系和反应程序同第1轮PCR。

1.4 LhTPS基因启动子的克隆

根据2次反向PCR得到的序列设计正向引物IPCR-LF(5′-CTAGACCGACTCATCATCATCTTCT-3′)和反向引物IPCR-LR(5′-GAAGTGGATGAGATGGGAAGTCG-3′)，用以克隆其它百合启动子全长序列。反应体系25 μL，包括基因组DNA 2 μL，dNTP Mixture 4 μL，10 x LA PCR Buffer II(Mgplus)2.5 μL，Takara LA

Taq

0.25 μL，IPCR-LF和IPCR-LR各 0.5 μL，ddHO 15.25 μL。PCR反应程序同上。PCR产物经胶回收、连接、转化和筛选等一系列过程送生工生物工程(上海)股份有限公司测序。

1.5 LhTPS基因启动子序列分析

利 用 SnapGene(Version 4.2.4)对测序结果进行拼接，获得每个品种完整的启动子序列。利用DNAMAN(Version 6.0)软件分析序列相似性、插入缺失位点和SNP,DnaSp(Version 5.10.01)分析基因多态性系数,MEGA X分析序列进化关系。运用在线软件PlantCARE(http:∥bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html)对启动子序列进行顺式作用元件预测。

2 结果与分析

2.1 LhTPS基因启动子的获得

分别以‘Red Life’和‘Entertainer’基因组DNA为模板，经过1次反向PCR扩增在‘Red Life’中得到1条长度约为1 000 bp的序列，但‘Entertainer’中无扩增条带 (图1(a))。将‘Red Life’测序后获得的序列与

LsoTPS

-

gDNA

进行比对，该序列位于

LsoTPS

-

gDNA

翻译起始位点上游703 bp。为了获得更完整的表达调控区域，以此序列为模板筛选内切酶和设计引物，继续以‘Red Life’基因组DNA为模板，使用2次步移的引物进行PCR扩增，获得1条长度约为1 000 bp的DNA序列(图1(b))。序列比对结果表明第2次扩增序列与第1次扩增序列有95 bp的重叠区域，位于第1次扩增序列上游693 bp，经2次序列拼接得到起始密码子上游1 396 bp非编码序列。根据2次反向PCR得到的序列设计引物IPCR-LF和 IPCR-LR。以IPCR-LF和 IPCR-LR为引物，以‘Pearl Melanie’‘Red Life’‘Entertainer’‘Friso’‘Urandi’‘Mister Sandman’‘Pink Perfection’‘Orange Planet’DNA为模板进行PCR(图1(c))，再经连接和转化等过程，获得其

LhTPS

启动子序列。

M，DNA标准DL2 000；1,‘Entertainer’;2,‘Red Life’;3,‘Pearl Melanie’;4,‘Friso’;5,‘Urandi’;6,‘Mister Sandman’;7,‘Pink Perfection’;8,‘Orange Planet’。(a)‘Entertainer’和‘Red Life’ LhTPS启动子第一次反向PCR结果;(b)‘Red Life’LhTPS启动子第二次反向PCR结果；(c)8个品种的LhTPS启动子扩增产物。 M， DL2 000 DNA Marker； 1, ‘Entertainer’； 2, ‘Red Life’； 3, ‘Pearl Melanie’； 4, ‘Friso’； 5, ‘Urandi’； 6, ‘Mister Sandman’； 7, ‘Pink Perfection’； 8, ‘Orange Planet’. (a) The first inverse-PCR products of LhTPS promoter of ‘Entertainer’ & ‘Red Life’； (b) The second inverse-PCR products of LhTPS promoter of ‘Red Life’； (c) PCR products of LhTPS promoter of 8 lily cultivars.图1 百合LhTPS基因启动子的扩增Fig.1 PCR products of LhTPS promoter of lilies

测序结果表明，8个启动子序列长度为1 376～1 414 bp；最长的为东喇百合系列的‘Friso’‘Urandi’的启动子序列，均为1 414 bp；最短的为亚洲百合‘Pearl Melanie’的启动子，仅有1 376 bp；喇叭百合‘Pink Perfection’‘Orange Planet’的启动子长短一致，均为1 411 bp(表1)。

表1 不同百合品种基因启动子的长度
Table 1 Length of gene promoters of lily cultivars

品种Cultivar启动子Promoter长度/bpSize品种Cultivar启动子Promoter长度/bpSizePearl MelanieLpmTPS-pro1 376FrisoLfTPS-pro1 414Red LifeLrlTPS-pro1 403UrandiLuTPS-pro1 414Pink PerfectionLppTPS-pro1 411Mister SandmanLmsTPS-pro1 412Orange PlanetLopTPS-pro1 411EntertainerLeTPS-pro1 397

2.2 LhTPS启动子序列的多态性和系统进化

DNAMAN比对发现，8个序列相似性为90.26%，存在核苷酸多态性位点404个，大于5 bp的插入缺失有6处(Indel 1～6)，插入和缺失主要发生在亚洲百合和东方百合

LpmTPS

-pro、

LrlTPS

-pro和

LeTPS

-pro序列上(图2)。就每一类群而言，2个亚洲百合间的启动子序列差异最大(表2)，单核苷酸多态性位点有76个，核酸多态性指数为0.053；2个喇叭百合启动子序列差异最小，单核苷酸多态性位点仅4个，核酸多态性指数最低，仅0.003；东喇百合单核苷酸多态性位点和核酸多态性指数介于亚洲百合和喇叭百合之间；东方百合因只有一个品种‘Entertainer’，无法计算核酸多态性，故没有在表2 中列出。

表2 基因启动子的核酸多态性
Table 2 Nucleotide diversity of promoters

类型Group品种Cultivar单核苷酸多态性位点/个SNP site核酸多态性指数Nucleotidediversity (π)单倍型数量Number ofhaplotype单倍型多样性Haplotypediversity (Hd)亚洲百合Pearl Melanie,Red Life760.05321喇叭百合Pink Perfection,Orange Planet 40.00321东喇百合Friso,Urandi,Mister Sandman650.03031

以8个百合品种

LhTPS

启动子核酸序列进行进化树分析，可将8个品种分为4组，喇叭百合‘Pink Perfection’和‘Orange Planet’的启动子

LppTPS

-pro和

LopTPS

-pro为T组，东喇百合‘Friso’和‘Urandi’的启动子

LfTPS

-pro和

LuTPS

-pro为OT组，亚洲百合‘Pearl Melanie’和‘Red Life’的启动子

LpmTPS

-pro和

LrlTPS

-pro为A组，东方百合‘Entertainer’的启动子

LeTPS

-pro自成一组，为O组(图3)。值得注意的是东喇百合‘Mister Sandman’与2个亚洲百合序列相似性更高，也被归为A组。

2.3 LhTPS基因启动子顺式作用元件

通过PlantCARE对启动子序列进行顺式作用元件分析，发现8个品种的

LhTPS

启动子都包括核心元件，如TATA-box和CAAT-box，主要负责基因转录起始的准确性及高效性；还包括应答元件，如ABRE、ARE、GATA-motif、I-box、G-box、W-box、MYC、TCT-motif和TC-rich repeats等，能被转录因子识别和结合，决定基因转录的特异性。应答元件又可分为生长发育、光响应、胁迫响应和激素响应四类元件。生长发育类别中，有7种顺式作用元件，涉及胚乳表达(AAGAA-motif和GCN4-motif)、芽表达(As-1 element)、昼夜节律(Circadian)、开花(MRE)、衰老(W-box)和玉米醇溶蛋白代谢(O2-site)，其中O2-site占比例最高，为49%(图4(a))。光响应类别中，有9种顺式作用元件，包括G-box、I-box、TCT-motif、GATA-motif、Box4、GT1-motif、TCCC-motif、Chs-CMA1a和ATCT-motif，其中G-box占比最大，为31%(图4(b))。胁迫响应类别有6种顺式作用元件，分别与厌氧诱导(ARE)、防御应激(TC-rich repeats、STRE)、脱水(DRE)和创伤(WRE3和WUN-motif)相关，其中STRE所占的比例最高，为42%(图4(c))。激素响应类别中的元件包括脱落酸(ABRE、ABRE3a、ABRE4)、生长素(TGA-element)、赤霉素(P-box、TATC-box)、茉莉酸甲酯(MeJA，CGTCA-motif、TGACG-motif、MYC和MYB)和水杨酸(TCA-element、TCA)应答元件，其中响应MeJA的顺式作用元件占比最大，为44%(图4(d))，这可能预示着百合

LhTPS

受MeJA诱导。2个亚洲百合在起始密码子上游400 bp之内的G-box、CGTCA-motif、MYC作用元件中的序列与其它百合启动子中的序列不一致，是潜在的研究位点。主要顺式作用元件标注于图2。

A：亚洲百合组；O：东方百合组；T：喇叭百合组；OT：东喇百合组。 A： Asiatic group; O： Oriental group; T： Trumpet group; OT： Orienpet group.图3 LhTPS启动子系统进化分析Fig.3 Phylogenetic tree of LhTPS promoters at the gene level

(a)、(b)、(c)和(d)分别表示生长发育、光响应、胁迫响应和激素响应相关顺式作用元件数量及占比。

3 讨 论

3.1 启动子克隆方法因基因而异

基于PCR扩增的染色体步移技术提供了克隆已知序列侧翼未知启动子的有效方法，常用的包括反向PCR法、外源接头介导PCR法和半随机引物PCR法等。百合基因组大(约36 Gb)，重复序列多，其全基因组数据至今尚未发布，克隆启动子有一定难度。在百合中，分别采用接头PCR法、反向PCR法、接头PCR和FPNI-PCR结合的方法克隆到

CHS

、

ANS

和

GPAT

基因启动子。本研究前期尝试过半随机引物PCR法，但止步于157 bp处。采用反向PCR法首先在‘Red Life’中获得成功，但在‘Entertainer’中止步于第一步PCR。将克隆到的

TPS

启动子序列比对南京农业大学滕年军团队兰州百合基因组数据库(数据尚未发表)，与基因ctg009323_np12121的相似性最高，为89.21%。在引物设计的位置存在多处变异位点(图5)，可见品种或种不同，基因可能不同，启动子克隆的方法需在实践的过程中进行调整。

蓝色阴影表示100%的相似性；点表示用于最佳对齐的间隙。 The blue shades represent 100% concordance; The dots indicate the gap for the optimal alignment.图5 不同材料TPS启动子序列比对Fig.5 The promoter of TPS from different accessions

3.2 启动子多样性可用于系统进化研究和香型分类

基因多样性是植物在长期适应生存环境和发展进化的过程中获得的，这种多样性可能存在于基因的编码区和非编码区，存在于核DNA和细胞器DNA。基于核糖体完整叶绿体基因组序列、ITS序列、细胞质基因组序列和其他来自核基因组的分子标记，对百合野生资源和品种所进行的分子系统学研究均基本认同百合野生资源分为Martagon、Sinomartagon、Archelirion、Pseudolirium、Lilium、Leucolirion 和Oxypetalum 7个组，由其衍生出的品种属于A、O、T、麝香百合(L)、LA、OT和LO等杂种系。本研究获得了8个百合品种的

LhTPS

启动子序列，利用这些序列所构建的系统发育树对所研究百合材料进行分类，其结果与传统分类结果基本一致，即亚洲百合启动子聚为一类，喇叭百合启动子聚为一类，东喇百合启动子聚为一类，而东方百合启动子单独为一类。

TPS

基因负责将底物转化为萜类物质。虽然本研究并未涉及香气成分检测，但在百合香型分类研究中，OT类‘Pink Perfection’‘Orange Planet’的香型均为Musky scent，A类‘Pearl Melanie’的香型为Faint scented。百合香型分类研究中虽未检测‘Red Life’的香气，但事实上研究人员难以察觉到‘Red Life’的味道，因此，可以认为‘Pearl Melanie’和‘Red Life’均为Faint scented香型。可见依

LhTPS

基因启动子序列的这两类百合的分类结果与百合的香型分类一致。有趣的是，‘Mister Sandman’虽为OT类百合，但只有部分实验人员从嗅觉感知到其轻微的香味(Faint scented)，这表明依据启动子序列将其归入亚洲百合组也与香型分类一致，也表明‘Mister Sandman’可能与2个亚洲百合有更近的亲缘关系，但这样的结果也可能是由于实验所用样本太少造成，需要后续克隆更多材料的

LhTPS

启动子以进行验证。

3.3 LhTPS启动子的多样性可能影响基因功能

顺式作用元件分析表明，8个启动子均含有负责基因转录起始的准确性及高效性、负责生长调控和应激响应的元件。在海岛棉、青蒿和铁皮石斛等物种中均发现

TPS

基因能受到植物激素、虫害或病害的诱导，认为

TPS

启动子属于诱导型启动子，百合

LhTPS

基因启动子也可能属于诱导型启动子。MeJA作为天然存在的植物生长调节剂，可能参与了挥发性成分等次生代谢物的产生，并在生物和非生物胁迫的防御机制中发挥作用。多个研究表明，启动子区存在的G-box可以与茉莉酸信号通路的CGTCA或MYC元件互作，从而诱导

TPS

基因的上调表达，进而增加单萜类挥发性化合物的产量。王红的研究表明LoMYC2对百合花香物质形成有积极的作用。8个百合启动子顺式作用元件的分析表明，激素响应类别中响应MeJA的作用元件占比最多，预示着百合

LhTPS

可能受MeJA诱导。近起始密码子端亚洲百合CGTCA-motif和MYC作用元件中的序列与其它百合启动子中的序列不一致，这也许与亚洲百合无香的表型相关。G-box、CGTCA-motif和MYC是否是后续研究的重点，尚需通过启动子瞬时表达及基因短截试验进行验证。

4 结 论

本研究首次克隆到8个百合品种的

TPS

启动子序列，发现品种间的启动子序列存在丰富的多态性，并可用于百合系统分类研究。虽然本研究分析了启动子顺式作用元件，并基于分析结果和前人的研究推测MeJA顺式作用元件可能是

TPS

基因受到转录调控的关键元件，但并没有进行实验验证，后续需构建瞬时表达载体，检测启动子对相关信号通路的响应情况，为理解萜烯合成的调控机制提供较为直接的实验证据。