3种微生物菌剂处理三七种子对其生长及种苗品质的影响

罗 成 郭力维 李佳洲 杨 宽 王慧玲 张 帅 粟 珊 朱有勇 何霞红,2*

(1.云南农业大学 云南生物资源保护与利用国家重点实验室，昆明 650201； 2.西南林业大学 园林园艺学院，昆明 650224)

三七[

Panax

notoginseng

(Burk.) F. H. Chen]又名田七、金不换，为五加科人参属植物，是我国特有的传统名贵中药材，享有“参中之王”“南国神草”等美誉，其根、茎和叶皆可入药，具有活血化瘀和消肿定痛等多种功效。三七栽培模式包括种苗培育和大田生长2个时期，种苗培育期为种子播种至种苗移栽所经历时期，大田生长期为种苗移栽至三七采收所经历时期。大田生长期中三七的生长和发育直接受种苗质量的影响，且2个时期的三七都存在营养生长和生殖生长2个生长高峰期，一年生三七5—7月为营养生长高峰期，10月为生殖生长高峰期；两年生三七4—6月为营养生长高峰期，10—12月为生殖生长高峰期；三年生三七6月为营养生长高峰期，10—12月为生殖生长高峰期。近年来，随着三七需求暴涨，三七药材难以满足市场需求，不得不进行大规模的人工栽培。当前，大面积的人工栽培主要套用农田大水大肥的种植模式，大量化肥农药的施用使得三七生产面临严峻的高产低质、病害加重、农残和重金属超标一系列问题。此外，由于三七生长喜温暖阴湿，极易发生多种病害，并且随着栽种时间的延长田间病害逐年增加，其中三七根腐病是危害三七产量和品质的重要病害之一，亦是导致三七连作障碍的主要因素之一。目前生产上主要采用化学农药防控，该方法不仅导致土壤理化性质恶化，土壤养分平衡被破坏，土壤中有害微生物大量繁殖，而且还造成生态环境污染等问题。微生物菌剂因其具有对环境、生态、人类健康友好及促进农业可持续发展等优势，因而在三七生产中有潜在的应用价值。

微生物菌剂是一种活体有机生物质，通过微生物代谢活动不仅能为植物提供所需养分促进植物生长发育，而且还能改善土壤结构，提高作物产量和品质。目前，微生物菌剂在粮食和果蔬类作物上已有大量研究报道，但在三七上的研究主要集中在一年生以上三七，而关于微生物菌剂处理三七种子后对三七生长及种苗品质的研究鲜有报道。因此，本研究拟以三七种子为研究材料，对一年生三七进行研究，利用哈茨木霉菌剂、植物益生菌液1号菌剂和宁盾菌剂3种不同微生物菌剂直接处理三七种子，分析微生物菌剂处理三七种子后对其出苗、存苗、根腐病发生情况、农艺性状以及种苗皂苷含量的影响，探明微生物菌剂处理三七种子对其生长发育及种苗品质的影响，为微生物菌剂在三七产业上的推广应用提供理论基础及科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料与设计

试验于2019—2020年在云南省寻甸县云南农业大学现代农业教育科研基地内进行。供试三七种子购买于云南省文山市三七国际交易中心，种植株行距为5 cm×5 cm。试验共设置7个处理，各微生物菌剂具体处理方式及来源见表1，小区面积1.5 m×4 m=6 m，6次重复。

1.2 试剂及仪器

1

.

2

.

1

供试试剂

纯度≥98%的皂苷标品(人参皂苷Rg、人参皂苷Rb、人参皂苷Re、人参皂苷Rd和三七皂苷R)购于贵州迪大生物科技有限公司，色谱纯的甲醇和乙腈购于德国默克公司，超纯水由德国默克公司MIlli-Q超纯水系统生产。

1

.

2

.

2

供试仪器

叶绿素仪为柯尼卡美能达控股株式会社公司生产的SPAD-502型，磨粉机为中国温岭市林大机械有限公司生产的DF-20型，分析天平为德国赛多利斯集团生产的BSA124S-CW型，55 kHz超声波清洗机为上海声源超声波仪器有限责任公司生产的SY3100DH型，冷冻高速离心机为日本日立公司生产的CR22GⅢ型，超高效液相色谱仪为美国安捷伦科技有限公司生产的1290 Infinity Ⅱ型。

1.3 测定项目和方法

1)出苗及存苗调查：每小区划取1 m×1 m的样方统计出苗和存苗，4月进行出苗调查，11月进行存苗调查。计算公式如下：

出/存苗=(调查株数/播种数)×100%

(1)

表1 种子处理及用法用量
Table 1 Seed treatment and usage and dosage

处理Treatment供试菌剂Test fungicide用量Dosage处理方法Processing method来源SourceT1哈茨木霉8 g/100 g种子拌种T2哈茨木霉16 g/100 g种子拌种山东省农业科学院T3植物益生菌液1号100倍稀释液浸种T4植物益生菌液1号200倍稀释液浸种T5宁盾包衣剂200 g/1 000 g种子包衣南京农业大学 T6宁盾水剂100倍稀释液浸种对照CK咯菌腈1 mL/1 000 g种子包衣实验室提供

表2 三七根腐病分级标准
Table 2 Classification criteria for root rot of

等级Grade分级标准Grading standard0健康,无症状;1腐烂仅发生在块根表面、且0<腐烂面积占比≤10%,或腐烂已扩展至内部且5%<腐烂面积占比≤10%;2腐烂已扩展至内部、且10%<腐烂面积占比≤40%,支须根无腐烂;3腐烂已扩展至内部、且40%<腐烂面积占比≤50%,支须根腐烂;4腐烂已扩展至内部、且50%<腐烂面积占比≤70%,支须根腐烂脱落;5腐烂已扩展至内部、且腐烂面积占比>70%直至整个块根完全腐烂,支须根腐烂。

2)根腐病发病调查：采用五点取样法，于6、8和10月对三七植株根腐病发病情况进行调查。每点调查20株，每小区共调查100株，参考根腐病发病分级标准调查统计(表2)。

发病率=发病株数/调查总株数×100%

(2)

病情指数=[ ∑(各级病株数×各级代表值)

/

(最高级代表值×调查总株数)]×100

(3)

3)叶绿素含量：利用叶绿素仪于6、8和10月测定三七叶绿素含量。每个小区中随机选择30株三七植株，每株选择中间叶片进行测定，每片叶子重复测定3次。

4)株高：于6和8月，利用直尺在每个小区中随机选择25株三七植株进行株高测定，11月采收时随机选取20株测定株高。

5)生物量测定：在收获期采用五点取样法采样，各处理每点取10株三七植株(共50株)带回实验室，洗净泥土，晾干水分后称取三七鲜重。采用烘干法将三七放入60 ℃烘箱烘干至恒重，取出冷却至室温，称取三七干重。

6)皂苷含量测定：每处理有6个小区作为重复，随机选择其中3个小区的三七植株进行皂苷测定。将三七主根烘干后磨碎，过100目筛，精确称取0.2 g，加75%的甲醇15 mL，超声提取30 min，离心10 min(12 000 r/min)，取上清液1 mL放入棕色进样瓶中，使用超高效液相色谱仪测量三七中R、Rg、Rb、Re和Rd这5种皂苷的含量。

1.4 数据处理及分析

利用Microsoft Excel 2013进行数据统计，用IBM SPSS 19进行单因素方差分析和多重比较。

2 结果与分析

2.1 微生物菌剂处理三七种子对出苗和存苗的影响

三七齐苗(4月)后调查不同微生物菌剂处理三七种子对三七出苗的影响(图1)。结果表明，除T1处理外，各微生物菌剂处理三七种子出苗差异不显著，但均显著低于CK。出苗依次为：CK(84.00%)>T4(78.33%)>T3(77.92%)>T6(76.21%)>T5(76.08%)>T2(73.92%)>T1(68.08%)。同一种微生物菌剂不同用量处理三七种子对出苗影响不同，其中低浓度植物益生菌液1号菌剂和高浓度哈茨木霉菌剂有利于三七种子出苗。

随着生育期的延长(11月)，除了T1处理(56.33%)的三七存苗显著低于CK(64.45%)外，其他处理均高于CK，但未达到显著水平(图1)。T4、T3、T5、T2、T6和CK存苗分别较T1提高了26.56%、25.60%、22.40%、19.09%、18.28%和14.42%。

综上所述，不同微生物菌剂处理三七种子有利于三七后期存苗，其中低浓度植物益生菌液1号菌剂和高浓度哈茨木霉菌剂效果较好，以T4处理效果最优。

T1，哈茨木霉8 g/100 g种子；T2，哈茨木霉16 g/100 g种子；T3，植物益生菌液1号100倍稀释液；T4，植物益生菌液1号200倍稀释液；T5，宁盾包衣剂；T6，宁盾水剂100倍稀释液；CK，咯菌腈。相同颜色柱子上的不同字母表示不同处理间差异显著(P<0.05)。下同。 T1, Trichoderma harzianum 8 g/100 g seeds; T2, Trichoderma harzianum 16 g/100 g seeds; T3, 100 times diluent of plant probiotics No. 1; T4, 200 times diluent of plant probiotics No. 1； T5, Ningdun coating agent; T6, 100 times diluent of Ningdun water agen； CK, Fludioxonil. The different letters on the same color column indicate that the difference reach a significant level (P<0.05) among different treatments. The same below.图1 微生物菌剂对三七出苗和存苗的影响Fig.1 Effect of microbial agents on the germination and survival of Panax notoginseng

2.2 微生物菌剂处理三七种子对根腐病发病的影响

三七根腐病是影响三七生长的主要因素之一。通过调查各微生物菌剂处理不同时间段根腐病发生情况发现(表3)，该病害8月份危害最为严重，各微生物菌剂处理发病率均低于CK，且T1处理与CK有显著差异；T1、T2、T3、T4、T5和T6处理分别较CK降低了87.64%、56.18%、37.45%、31.46%、25.09%和18.73%。10月，各微生物菌剂处理发病率与CK均无显著差异。其中，T1和T2处理后的发病率较CK降低了80.24%和59.88%。进一步分析发现，不同微生物菌剂处理对三七根腐病病情指数变化趋势与发病率类似，其中，哈茨木霉菌剂处理下整个生育期平均病情指数最低。以上结果表明，哈茨木霉菌剂在防治三七根腐病发生和减轻发病效果上优于其他2种菌剂，且低浓度处理(哈茨木霉8 g/100 g种子)最优，使得整个生育期发病率控制在1%以内。

表3 微生物菌剂对三七根腐病发生的影响
Table 3 Effect of microbial agents on the occurrence of root rot

处理Treatment发病率/%Disease rate病情指数Disease index发病率/%Disease rate 病情指数Disease index发病率/%Disease rate 病情指数Disease index6月8月10月T10.50±0.34 b0.23±0.17 b0.33±0.21 b0.33±0.21 b0.33±0.21 a0.33±0.21 aT20.83±0.54 b0.57±0.36 b1.17±0.48 ab1.03±0.50 a0.67±0.33 a0.63±0.33 aT32.67±0.84 a2.40±0.71 a1.67±0.61 ab1.63±0.59 a2.17±0.79 a2.03±0.79 aT40.83±0.54 b0.47±0.36 b1.83±1.08 ab1.43±0.98 a1.50±0.56 a 1.50±0.56 aT51.50±0.71 ab1.17±0.62 ab2.00±0.77 ab1.83±0.73 a1.67±0.61 a 1.67±0.61 aT60.67±0.33 b0.53±0.27 b2.17±0.60 ab1.80±0.67 a1.83±1.05 a1.70±1.05 aCK0.67±0.33 b0.57±0.33 b2.67±0.76 a2.53±0.76 a1.67±0.49 a1.53±0.49 a

注：同列不同小写字母表示处理间差异显著(<0.05)。下同。

Note: Different letters in the same column indicate the differences reach a significant level (<0.05) among different treatments. The same below.

2.3 微生物菌剂处理三七种子对农艺性状的影响

微生物菌剂处理三七种子有助于三七植株生长(表4)。与CK相比，8月三七株高除T1处理与CK无显著差异外，其他处理均显著高于CK；株高排序依次为：T6(11.32 cm)>T4(11.10 cm)>T3(10.97 cm)>T5(10.85 cm)>T2(10.76 cm)>T1(10.29 cm)>CK(9.72 cm)。进一步分析微生物菌剂处理间的差异发现，除T4、T6与T1有显著差异外，其他微生物菌剂处理间均无显著差异。11月时，所有微生物菌剂处理株高均高于CK，其中，T6和T4处理与CK有显著差异，分别较CK增加了12.25%和10.33%，而T5、T3、T2和T1处理则分别比CK增加了7.25%、7.08%、6.67%和4.92%。以上结果表明，供试所用的3种微生物菌剂处理三七种子后均有利于促进三七植株生长，其中以T6和T4处理效果最优。

检测生育期叶绿素含量变化发现，随着生育期延长，3种微生物菌剂处理对叶绿素含量影响总体呈现递增趋势，但各处理间均无显著差异(

P

>0.05)(表5)。

表4 微生物菌剂对三七株高的影响

Table 4 Effects of microbial agents on the plant height of cm

处理Treatment株高 Plant height6月8月11月T18.34±0.29 a10.29±0.25 bc12.59±0.36 abT28.40±0.26 a10.76±0.15 ab12.80±0.25 abT38.98±0.17 a10.97±0.23 ab12.85±0.35 abT48.50±0.15 a11.10±0.19 a13.24±0.30 aT58.99±0.19 a10.85±0.28 ab12.87±0.14 abT68.98±0.19 a11.32±0.35 a13.47±0.25 aCK8.62±0.19 a9.72±0.17 c12.00±0.23 b

表5 微生物菌剂对三七叶绿素含量(SPAD值)的影响
Table 5 Effects of microbial agents on the chlorophyll content (value of SPAD) of

处理Treatment叶绿素含量 Chlorophyll content6月8月10月T138.8±2.40 a50.3±1.88 a51.0±0.62 aT238.6±1.43 a51.1±0.92 a51.3±0.31 aT339.0±0.98 a52.1±1.15 a52.6±0.90 aT439.0±1.37 a50.9±1.10 a51.5±0.94 aT538.3±1.14 a51.2±1.28 a50.9±1.48 aT638.7±1.90 a51.6±1.81 a51.0±0.92 aCK38.8±1.54 a53.0±1.25 a52.1±1.09 a

2.4 微生物菌剂处理三七种子对生物量的影响

微生物菌剂对三七生物量的影响见表6，3种微生物菌剂处理对三七地上部鲜重、地上部干重、地下部鲜重和地下部干重均无显著影响(

P

>0.05)。其中地上部鲜重以T6处理最重(0.66 g/株)，地下部鲜重以CK最高(0.98 g/株)。以上结果表明，微生物菌剂处理三七种子不能增加地下部生物量积累，但能促进地上部的生长。

表6 微生物菌剂对三七生物量的影响
Table 6 Effects of microbial agents on the biomass of

处理Treatment地上部鲜重/(g/株)Overground freshweight地上部干重/(g/株)Overground dryweight 地下部鲜重/(g/株)Undergroundfresh weight地下部干重/(g/株)Underground dryweightT10.60±0.03 a0.10±0.02 a0.82±0.06 a0.17±0.02 aT20.62±0.02 a0.10±0.01 a0.85±0.04 a0.18±0.01 aT30.64±0.03 a0.10±0.01 a0.87±0.06 a0.18±0.01 aT40.63±0.04 a0.10±0.02 a0.88±0.10 a0.18±0.02 aT50.63±0.04 a0.10±0.01 a0.86±0.07 a0.17±0.02 aT60.66±0.03 a0.10±0.01 a0.89±0.07 a0.18±0.02 aCK0.58±0.02 a0.09±0.01 a0.98±0.04 a0.20±0.01 a

2.5 微生物菌剂处理三七种子对皂苷含量的影响

进一步分析3种微生物菌剂处理对三七皂苷积累的影响(表7)，结果发现，与CK处理相比，3种微生物菌剂处理除了对人参皂苷Re影响不显著外，均能在不同程度上影响三七皂苷R、人参皂苷Rg、Rb、Rd及总皂苷含量的积累。其中T4和T6处理能显著促进皂苷R、Rg、Rb和Rd积累，较CK分别增加30.90%和21.97%、32.13%和21.16%、45.65%和47.35%、27.87%和30.14%；T1、T2和T3处理后皂苷含量与CK均无显著差异，而T5处理仅人参皂苷Rb与CK有显著差异，比CK增加了26.94%，其他类型皂苷含量与CK无显著差异。此外，3种微生物菌剂处理对药典规定的总皂苷含量趋势同皂苷单体一致，总皂苷含量较CK增加比率从高到低依次为T4(36.96%)>T6(30.97%)>T5(16.79%)>T1(14.22%)>T3(12.43%)>T2(9.76%)。

同种微生物菌剂不同浓度处理对三七皂苷积累影响不同，低浓度微生物菌剂处理更有益于三七皂苷的积累。其中T1和T2处理间所有皂苷含量均无显著差异，但低浓度T1处理更有益于R、Re、Rb、Rd及总皂苷含量的积累，较高浓度T2分别增加了15.24%、18.62%、7.08%、6.76%和4.12%；而T3和T4处理间除Re和Rb含量差异不显著外，低浓度T4处理能显著增加R、Rg、Rd及总皂苷含量的积累，较高浓度T3分别增加了21.36%、25.33%、30.05%和21.80%。

同种微生物菌剂不同剂型对三七皂苷含量积累影响也不同。T6处理更有益于R、Rg、Rb、Rd及总皂苷含量的积累，较T5增加了21.35%、6.41%、16.05%、19.16%和12.14%。

综上所述，3种微生物菌剂处理三七种子均有利于三七皂苷含量的积累，且效果与微生物菌剂种类、浓度和剂型有关，其中以T4处理效果最优。

表7 微生物菌剂对三七皂苷含量的影响
Table 7 Effect of microbial agents on the saponins content of

处理Treatment皂苷质量分数/(mg/g) Saponins mass fractionR1Rg1ReRb1RdR1+Rg1+Rb1T11.89±0.10 cd7.20±0.71 bc1.72±0.23 a6.05±0.35 abc2.21±0.20 ab15.15±0.94 bcT21.64±0.64 d7.27±0.21 bc1.45±0.11 a5.65±0.38 bc2.07±0.08 ab14.55±0.63 cT32.06±0.10 bc6.79±0.20 bc1.54±0.10 a6.06±0.52 abc1.93±0.07 b14.91±0.80 cT42.50±0.21 a8.51±0.42 a1.50±0.22 a7.15±0.13 a2.51±0.11 a18.16±0.75 aT51.92±0.10 cd7.33±0.33 abc1.57±0.21 a6.23±0.40 ab2.14±0.25 ab15.49±0.81 bcT62.33±0.14 ab7.80±0.09 ab1.53±0.03 a7.23±0.10 a2.55±0.13 a17.37±0.16 abCK1.91±0.09 cd6.44±0.33 c1.38±0.11 a4.91±0.47 c1.96±0.11 b13.26±0.78 c

3 讨 论

目前关于微生物菌剂在三七上的研究报道主要是以一年生以上三七为研究材料，而关于微生物菌剂直接处理三七种子后对其生长及种苗品质研究鲜有报道。较多研究表明微生物菌剂处理种子后对出苗有一定促进作用，如仙丰168微生物菌剂、地衣芽孢杆菌及多粘类芽孢杆菌分别对番茄和伊犁绢蒿种子等有明显促进作用。本研究发现，微生物菌剂直接处理三七种子有利于三七后期的存苗，但对三七出苗效果不佳，这与范瑛阁等处理黄瓜研究结果一致。出苗效果不佳一方面可能与作物种类及菌剂使用浓度有关，马赛等研究表明高浓度哈茨木霉菌剂(1.50×10CFU/mL、3.00×10CFU/mL)处理对大白菜种子出苗有抑制作用；另一方面可能与微生物菌剂-目标作物间的定殖能力有关，良好的定殖能力是微生物菌剂发挥功能的前提，其不仅受自身生理特性、与土著微生物的相互作用及宿主植物基因型等生物因素的刺激，而且还受光照、降水、温度和土壤类型等非生物因素的调控。

微生物菌剂具有促生和防病的作用，通过自身的固氮、溶磷和解钾等能力或生命活动产生的代谢物质来促进植株生长和改善作物生长状况。刘双等研究表明微生物菌剂的使用能提高玉米产量并改善农艺性状。本研究发现，3种微生物菌剂处理三七种子后均能促进三七地上部生物量及株高的生长，但对地下部生物量无显著影响。研究还发现3种微生物菌剂对三七根腐病的防治效果能与对照组化学药剂处理相当，其中哈茨木霉菌剂对三七根腐病防治效果优于其他2种菌剂且效果最为稳定，这与前人研究报道一致。可能是微生物菌剂中的生防菌通过拮抗、竞争和诱导系统抗性等方式直接或间接地作用于病原菌，从而起到控制植物病害的作用。此外，近年来随着微生物组学的快速发展，微生物菌剂中的生防菌还可通过调控土壤微生态环境来控制植物病害。Han等研究发现，与对照相比，解淀粉芽孢杆菌B1408施用后土壤中的产黄杆菌属(

Rhodanobacter

)、链霉菌属(

Streptomyces

)及根瘤菌属(

Rhizobium

)等有益菌群丰度增加，而镰刀菌相对丰度降低，从而促进黄瓜生长，降低枯萎病发生率；Yu等研究也表明，施用哈茨木霉T4能显著改变土壤微生物群落结构，进而间接抑制根肿病病原菌在土壤中的繁殖，从而有效防治根肿病的发生。本研究中哈茨木霉菌剂对三七根腐病的防治作用可能得益于哈茨木霉通过拮抗和竞争等方式直接抑制根腐病病原菌生长，同时还通过调节土壤微生态环境来抑制土壤中病原菌的增殖，从而达到稳定的防效。

微生物菌剂因具有改善药用植物品质的作用被日渐重视。皂苷是三七的主要药用活性物质，也是衡量三七品质的重要指标，已有研究表明微生物菌剂的施用能提高一年生以上三七皂苷含量，而关于微生物菌剂处理三七种子后对种苗皂苷积累的影响目前尚无相关报道。本研究发现，3种微生物菌剂处理三七种子均能促进三七总皂苷含量的积累，且同种微生物菌剂用量不同效果也不同，这与前人研究结果一致。本研究中以植物益生菌液1号200倍稀释液和宁盾水剂100倍稀释液处理效果最好，2种处理除人参皂苷Re与对照处理无显著差异外，其他4种皂苷(三七皂苷R、人参皂苷Rb、Rg和Rd)含量均显著高于对照，且2种微生物菌剂对不同皂苷含量积累促进效果也不同，植物益生菌液1号200倍稀释液有利于三七皂苷R和人参皂苷Rg含量积累，而宁盾水剂100倍稀释液有利于人参皂苷Rb和人参皂苷Rd含量积累。综上所述，本研究中微生物菌剂处理三七种子后可以促进三七植株生长同时还有利于三七药用活性物质皂苷的积累，使其品质得到提升，但微生物菌剂使用浓度、次数和时间有待进一步探究。

4 结 论

本研究利用3种微生物菌剂处理三七种子，评估了3种微生物菌剂对三七生长、根腐病的防治效果以及对三七种苗品质的影响。结果表明，微生物菌剂处理三七种子有利于三七皂苷含量的积累、存苗及地上部的生长，其中皂苷含量以植物益生菌液1号200倍稀释液处理效果最为显著，而哈茨木霉菌剂处理对三七根腐病有较好的防治效果。因此在三七齐苗后可将植物益生菌液1号200倍稀释液与哈茨木霉菌剂进行交替或复配使用，但具体使用时间及用量还需进一步探究。