麦秸对湖羊瘤胃发酵代谢及肠道组织形态的影响

陈 希 姜婉茹 叶平生 王换换 闫书平 谢娜娜 聂信天 张源淑

(南京农业大学 农业农村部动物生理生化重点开放实验室， 南京 210095)

粗饲料是指天然水分含量在60%以下，干物质中粗纤维含量在18%以上，并以风干形式饲喂的一种饲料[1]，如牧草、农作物秸秆、酒糟等。粗饲料是瘤胃微生物和宿主动物重要的营养来源，并对维持反刍动物肠道稳态，提高生产力有重要作用[2]。

湖羊是太湖平原的重要家畜之一，具有生长发育快、泌乳性能好、多胎和产肉性能理想等优良性状。湖羊等反刍动物作为复胃动物，其中瘤胃是最大的胃，饲喂不同的粗饲料，如苜蓿干草或玉米秸秆会改变瘤胃中营养物质的含量，从而使瘤胃发酵的类型发生变化[3]。纤维是反刍动物粗饲料中的主要成分，也是造成反刍动物与单胃动物营养差异的主要原因[4-5]。董春晓等[6]研究表明，日粮添加粗饲料不仅有利于反刍动物生产性能的提高，还能减少瘤胃食糜粘附，维持瘤胃健康。日粮的非纤维性碳水化合物/中性洗涤纤维(NFC/NDF)比值会影响反刍动物瘤胃的pH，随着NFC/NDF的增大，瘤胃pH降低，乙酸含量显著降低，但丙酸和丁酸含量则呈升高趋势[7]。用不同全混合日粮(TMR)的饲料组合饲喂泌乳奶牛，通过体外瘤胃发酵试验发现，不同组中泌乳奶牛瘤胃中乙酸、丙酸和丁酸生成动力学参数存在显著差异[8]。目前，国内外不同类型的饮食对反刍动物，尤其是湖羊瘤胃pH、挥发性脂肪酸(Volatile fatty acid, VFA)浓度、瘤胃纤维素酶含量影响的报道较少。而准确掌握不同类型的饲料条件下湖羊瘤胃pH、VFA含量、瘤胃纤维素酶含量的变化对监测湖羊身体状况、调整营养水平、提高机体免疫力、降低应激、减少代谢紊乱的发生具有重要的理论与现实意义。

苜蓿干草是一种优质的粗饲料源，具有高含量的粗蛋白质，低含量纤维，易于消化吸收等营养特性[9]，素有“牧草之王”的美誉[10]。但由于我国目前人均耕地面积的减少，地理环境、气候等因素造成草原退化等导致我国优质苜蓿产量低下，不足以满足养殖业的需求。作为粮食生产大国，我国农作物秸秆资源丰富，如水稻秸秆、小麦秸秆、玉米秸秆、高粱秸秆等[11]。小麦和大麦秸秆具有纤维丰富、产量大、分布广泛、成本低、易于获得，且能经常更新等优点，也是草食家畜重要的粗饲料来源。然而，农作物秸秆的合理利用率较低，甚至被农户就地焚烧，浪费资源且造成环境和空气污染[12]。前期研究发现,采用苜蓿干草与麦秸分别作为湖羊日粮粗饲料来源，以麦秸作为粗饲料饲喂，湖羊采食量显著低于苜蓿，但体增重和血液生化指标等无显著差异[13]。本研究拟从胃肠道，特别是瘤胃代谢的角度，通过观察分析胃肠道pH、内容物排空、组织学、瘤胃脂肪酸及代谢异常产物脂多糖(Lipopolysaccharide, LPS)释放和脏器指数等指标，探究麦秸饲喂对湖羊瘤胃发酵、代谢及胃肠道组织形态等的影响，以期丰富秸秆类粗饲料在反刍动物中的合理使用，平衡饲料利用结构，降低饲养成本。

1 材料与方法

1.1 主要仪器和试剂

RM2235石蜡切片机(德国徕卡公司)；BH-2型显微镜(日本奥林巴斯株式会社)；ZX-GF101-1-BS电热恒温鼓风干燥箱(上海跃进医疗器械有限公司)；6890 N气相色谱仪(Agilent 公司，美国)；MIKRO-22R型高速冷冻离心机(Andreas Hettich GmbH8 CO.KG，德国)；GHP-9080隔水式恒温培养箱(上海一恒科学仪器有限公司)；TECAN多功能酶标仪(TECAN，瑞士普朗)；LX-200迷你离心机(海门市其贝尔仪器)；FE20试验室pH计(梅特勒-托利多仪器上海有限公司)等。

AceQ q-PCR SYBR Green Master Mix试剂盒购于Vazyme Biotech公司；反转录试剂盒购于Promega公司；绵羊脂多糖(LPS)酶联免疫分析(ELISA)试剂盒购自于上海酶联有限公司； 4%多聚甲醛、梯度酒精、二甲苯、石蜡和苏木素-伊红染液均购自南京鼎国昌盛生物技术有限公司等。

1.2 动物分组与饲养管理

成年雄性健康湖羊12只, 体重(41.09±1.54) kg，5～6月龄，饲养于南京农业大学动物科学院动物房，每日定时饲喂2次(08:00和17:00)，单栏饲养，自由饮水和采食。预饲期饲喂苜蓿干草+精料。之后按照体重相近原则，将湖羊随机分为苜蓿干草组(精料+苜蓿干草)和麦秸组(精料+稻秸)，正式饲喂期28 d，日粮精粗比均为60∶40，其组成及营养水平见表1。

表1 日粮组成及营养水平(风干基础)Table 1 Feed composition and nutrition level (dry basis)

1.3 样品采集

1.3.1血液样品的采集

于正式饲喂期28 d后选取禁食16 h的湖羊进行颈静脉采血，3 000 r/min离心15 min获得血浆，-20 ℃ 保存。

1.3.2消化道内容物和组织样品的采集

屠宰前称取湖羊宰前活重(Live weight before slaughter，LWBS)，进行放血屠宰，按如下要求采集各种样品。

1)脏器称重及脏器指数计算

取肝脏、胰腺、脾脏、胸腺等组织脏器称重，按如下公式计算脏器指数。

脏器指数=脏器湿重/屠宰前体重×100%

2)消化道样品采集

取消化道内容物于5 mL EP管中，置于液氮中保存，-20 ℃保存。

取剪碎的各肠段组织于2 mL EP管中，置于液氮中保存，后放-80 ℃冰箱保存。部分组织4%多聚甲醛固定。

1.3.3消化道内容物 pH及重量的测定

试验结束屠宰时，对消化道内容物用手持式pH计测定其中pH并记录。

称取消化道器官鲜重；消化道内容物清除并清洗干净，分别称取瘤胃、网胃、瓣胃、皱胃以及小肠的重量。

消化道内容物重量/kg=消化道鲜重/kg-
消化道空重/kg
消化道内容物重量占宰前活重比例/%=
消化道内容物重量/g/宰前活重/g

1.4 湖羊血浆、瘤胃内容物中LPS含量的测定

1.4.1瘤胃内容物样品处理

取瘤胃内容物用4层纱布过滤，吸取过滤后的瘤胃液2 mL，10 000 r/min，4 ℃离心30 min，保留上清。

1.4.2LPS含量测定

血浆和瘤胃内容物中LPS含量测定采用ELISA方法。具体操作参照测定试剂盒说明书测定，在Synergy2多功能酶标分析仪上以空白孔调零，450 nm波长下依序测定各孔的吸光度(OD值)。

1.5 湖羊瘤胃中果胶酶、木聚糖酶、纤维素酶、液相羧甲基纤维素酶的活性测定

1.5.1酶液的制备

取固相食糜解冻后称取1 g食糜后加入7.5 mL浓度为0.1 mol/L的pH 6.8磷酸钠缓冲液(内含溶菌酶0.02 g/L)放入50 mL离心管中，然后加入0.625 mL四氯化碳，39 ℃恒温水浴振荡3 h，14 000 r/min 离心30 min，上清液即为酶液，-20 ℃ 冷冻待测。

1.5.2酶活力的测定

参照梁松等[14]的方法，用分光光度计于530 nm比色依序测定各管的吸光度(OD值)。

1.6 瘤胃内容物中挥发性脂肪的测定

根据Jin等[15]描述的方法测量瘤胃中各种挥发性脂肪酸的浓度。用日本岛津GC-7A气相色谱仪依内标法进行分析测定。以巴豆酸为内标物。

1.7 各组织器官组织学切片制作

取4%多聚甲醛固定的湖羊十二指肠、空肠、盲肠组织。常规HE染色法制作组织学切片。按固定、脱水、透明、浸蜡、包埋、切片、染色、封片等操作步骤制作组织学切片。中性树胶封片，显微镜下观察。

1.8 数据处理

数据均采用SPSS 19.0统计分析，采用独立样本T检验进行显著性检验，所有数值均以“平均值±标准差(Mean±SD)”表示，以P<0.05表示差异显著，P<0.01表示差异极显著。

2 结果与分析

2.1 饲喂麦秸对湖羊消化道内容物pH的影响

由表2可看出，与苜蓿干草组相比，麦秸组瘤胃内容物pH显著降低(P<0.05)，其他消化道内容物pH均无显著差异(P>0.05)。

表2 饲喂麦秸对湖羊消化道内容物pH的影响(n=6)Table 2 The effect of feeding wheat straw on the pH value of the digestive tract of Hu sheep (n=6)

2.2 饲喂麦秸对湖羊消化道内容物重量的影响

由表3看出，麦秸组湖羊胃内容物重及占宰前活重比例均高于苜蓿干草组，其中瘤胃内容物重及占宰前活重比例极显著高于麦秸组(P<0.01)，瓣胃内容物重量显著高于麦秸组(P<0.05)。肠道内容物重及占宰前活重比例两组之间无显著差异(P>0.05)。

表3 饲喂麦秸对湖羊消化道内容物重量的影响(n=6)Table 3 The effect of feeding wheat straw on the weight of contents of the digestive tract of Hu sheep (n=6)

2.3 饲喂麦秸对湖羊血浆、瘤胃内容物中LPS含量的影响

结果如表4所示，与苜蓿干草组相比，麦秸组湖羊血浆及瘤胃内容物中LPS的含量均无显著差异(P>0.05)。

表4 饲喂麦秸对湖羊血清及瘤胃液中LPS含量的影响(n=6)Table 4 Effect of feeding wheat straw on the content of LPS inplasma and rumen content of Hu sheep (n=6)

2.4 饲喂麦秸对湖羊瘤胃内容物中酶活力的影响

瘤胃内容物中各种酶活力测定结果见表5。由表5可知，与苜蓿干草组相比，麦秸组湖羊瘤胃内容物中酶活力均有所升高，其中木聚糖酶活力极显著升高(P<0.01)。

表5 饲喂麦秸对湖羊瘤胃内容物中酶活力的影响(n=6)Table 5 Effect of feeding wheat straw on enzyme activity in rumen content of Hu sheep (n=6)

2.5 饲喂麦秸对湖羊瘤胃内容物中挥发性脂肪酸含量的影响

结果见表6，与饲喂苜蓿干草相比，麦秸组湖羊瘤胃液中乙酸、丙酸及总挥发性脂肪酸的含量较高，而丁酸、异丁酸、戊酸及异戊酸含量降低，但均无显著差异(P>0.05)。

表6 饲喂麦秸对湖羊瘤胃内容物中挥发性脂肪酸的影响(n=6)Table 6 Effect of feeding wheat straw on volatile fatty acid content in rumen of Hu sheep (n=6)

2.6 脏器指数统计

各脏器统计结果见表7，与苜蓿干草组相比，麦秸组湖羊胸腺指数、肝脏指数及胰腺指数较低，但2组无显著差异(P>0.05)。

表7 饲喂麦秸对湖羊脏器指数的影响(n=6)Table 7 Effect of feeding wheat straw on the organ index of Hu sheep (n=6)

2.7 饲喂麦秸对湖羊十二指肠、空肠及盲肠组织形态的影响

2.7.1饲喂麦秸对湖羊十二指肠组织形态的影响

对湖羊十二指肠进行组织形态学观察，结果如图1所示，两组湖羊十二指肠组织切片在低倍镜下(图1(a)和(b))可以观察到清晰明显的粘膜层、粘膜下层、肌层。高倍镜下(图1(c)和(d))可见完整的十二指肠腺，未见其他异常。

(a)苜蓿干草组(100×)；(b)麦秸组(100×)；(c)苜蓿干草组(400×)；(d)麦秸组(400×)(a) Alfalfa group (100×); (b) Wheat straw group (100×); (c) Alfalfa group (400×); (d) Wheat straw group (400×)图1 饲喂麦秸对湖羊十二指肠组织形态的影响Fig.1 Effect of feeding wheat straw on duodenal tissue morphology of Hu sheep

2.7.2饲喂麦秸对湖羊空肠组织形态的影响

对湖羊空肠进行组织形态学观察，结果如图2所示，两组湖羊空肠组织切片在低倍镜下(图2(a)和(b))可以观察到清晰明显的粘膜层、粘膜下层、肌层。高倍镜下(图2(c)和(d))可见完整的肠腺，未见其他异常。

(a)苜蓿干草组(100×)；(b)麦秸组(100×)；(c)苜蓿干草组(400×)；(d)麦秸组(400×)(a) Alfalfa group (100 ×); (b) Wheat straw group (100×); (c) Alfalfa group (400×); (d) Wheat straw group (400×)图2 饲喂麦秸对湖羊空肠组织形态的影响Fig.2 Effect of feeding wheat straw on jejunum tissue morphology of Hu sheep

2.7.3饲喂麦秸对湖羊盲肠组织形态的影响

对湖羊盲肠进行组织形态学观察，如图3所示，两组湖羊盲肠组织切片在低倍镜下(图3(a)和(b))可以观察到清晰明显的粘膜层、粘膜下层、肌层。高倍镜下(图3(c)和(d))可见完整的肠腺，未见其他异常。

3 讨 论

3.1 饲喂麦秸对湖羊瘤胃pH及代谢异常产物LPS的影响

粗饲料在反刍动物日粮中起着至关重要的作用，能刺激反刍动物咀嚼和唾液分泌，饲料中的营养物质被反刍动物摄食后进入瘤胃中消化分解后生成VFA及其他有机酸，从而使得瘤胃液pH升高或降低，所以pH是反映饲料中可发酵成分在瘤胃内发酵程度和评价瘤胃内环境是否正常的敏感指标。一般情况下，变动范围为5.5～7.5[16]。纤维分解菌对于pH变化比较敏感，当pH降低时，粗饲料的消化率下降。杨艳玲[17]发现饲喂不同精粗比的麦秸型粗饲料时，当纤维化学含量达到要求，瘤胃pH大小与中性洗涤纤维含量不相关，影响瘤胃pH的关键因素是日粮中易发酵的碳水化合物和瘤胃内的发酵产物；Zhu等[18]发现体外发酵精粗比为45∶55的不同来源的粗饲料研究中，苜蓿组和玉米秸秆组的pH差异不显著。本研究结果中两组湖羊的瘤胃pH均在正常范围内，原因可能与试验中的瘤胃发酵产物的累积程度不足以影响瘤胃的缓冲能力有关。

目前已知瘤胃液中 pH 降低可能导致部分不耐酸的革兰氏阴性菌死亡和裂解，从而使瘤胃中游离LPS增加。Adesogan等[19]发现瘤胃内约 60%的 LPS 是由于革兰氏阴性菌的快速生长而产生的，在细菌快速生长期，自溶酶有利于细菌的生长和繁殖，但是过量的自溶酶能使细菌自体溶解，从而释放出大量LPS。故瘤胃内LPS的增加也可能是细菌的快速生长造成的。Nagaraja等[20]将母牛的瘤胃液分别与玉米和苜蓿干草进行体外培养，发现玉米培养液中 pH 比苜蓿干草培养液中 pH 的下降幅度大，相应的其内毒素含量也高。Gagnon等[21]给肉牛饲喂不同粗精比的日粮时，发现瘤胃内细菌内毒素LPS随着饲喂精料比例的增加而不断增加。本研究发现，与苜蓿干草组相比，麦秸组湖羊瘤胃和血液中LPS浓度差异不显著，表明苜蓿干草和麦秸对湖羊瘤胃没有产生不良影响。

3.2 饲喂麦秸对湖羊消化道内容物重量及肠道组织形态的影响

饲料中含有一定量中性洗涤纤维(NDF)对维持瘤胃功能具有重要作用，但是，中性洗涤纤维含量过高会影响消化道的排空速率，从而影响反刍动物的采食量[22]，本研究结果显示麦秸组湖羊瘤胃内容物重量显著升高，说明麦秸组湖羊胃排空速率变慢，这与麦秸中中性洗涤纤维含量高于苜蓿干草相符合，与前人研究结果一致。

小肠的正常组织结构是动物机体对营养物质消化和吸收的重要保证，小肠的收缩运动与食糜的消化效率小肠粘膜、肌层厚度有直接关系，一旦出现肠粘膜发生萎缩现象就会影响到小肠的吸收功能[23]。通过观察十二指肠、空肠和盲肠组织学切片，均未发现异常病理变化。脏器指数是试验动物的重要生物学指标之一, 其大小在一定程度上能够反映动物器官的功能强弱及受损情况。本研究结果显示饲喂麦秸湖羊各脏器指数无差异，即对各脏器及组织结构均无影响。因此，以麦秸作为粗饲料饲喂，对湖羊肠道形态和脏器功能无显著影响。

3.3 饲喂麦秸对湖羊瘤胃纤维素酶活性的影响

微生物对饲料消化的首要步骤是黏附在饲料颗粒上，而不同的饲料由于其物理结构和化学成分不同，影响瘤胃微生物对它的黏附[24]。反刍动物可以依靠瘤胃微生物分泌的纤维素酶来分解利用纤维物质[25]。其中，所有纤维素分解均能产生羧甲基纤维素酶，纤维素的降解首先通过此酶将大的不可溶多聚糖分解成可溶性的小单位，因此羧甲基纤维素酶是纤维素降解中的一个限速步骤。羧甲基纤维素酶主要是由纤维降解菌分泌的，从饲喂不同粗饲料中羧甲基纤维素酶酶活的角度来看，其变化趋势与NDF降解率的变化趋势一致。由此可以认为，纤维素利用菌数量及其分泌的纤维素酶酶活的变化是与粗饲料中NDF含量有关。本研究中，经过28 d试验期发现，麦秸组纤维素酶活性均高于苜蓿干草组，麦秸干草属于秸秆饲料，而苜蓿属于青干草，秸秆类饲料的纤维素酶活性大于青干草类，可能是秸秆类饲料的纤维含量较高，所以更好地刺激了瘤胃中降解纤维的微生物的生长定殖，这与霍鲜鲜等[26]研究结果一致。近几年通过分子生物学方法研究表明，当日粮中粗料比例增加时，3种主要的纤维降解细菌的浓度随之增加[27-28]，但对于瘤胃厌氧真菌来说，当日粮中粗料比例增加时，真菌数量随之增加，但采食茎杆含量很低的饲草时，不利于真菌的生长。因此，不同的饲料品种所含的纤维物质的数量和种类也影响微生物对其黏附。

3.4 饲喂麦秸对湖羊瘤胃挥发性脂肪酸含量的影响

反刍动物通过瘤胃降解饲料中的碳水化合物，生成大量的挥发性脂肪酸(VFA)，VFA是反刍动物能量需要的主要来源，乙酸是反刍动物瘤胃内重要的挥发性脂肪酸，其中会有很少的乙酸经瘤胃壁吸收转化成酮体，其余大部分乙酸吸收进入血液经三羧酸循环作用合成脂肪酸，丁酸在经瘤胃壁吸收的过程中，大部分转变为β-羟丁酸，β-羟丁酸是机体内多种体组织尤其是肌肉组织的重要能量来源[29]。丙酸通过糖异生生成葡萄糖，为葡萄糖的合成提供80%～90%的原料。生成的葡萄糖在动物体内直接被氧化酵解产能，为动物提供能量[30]。瘤胃pH、微生物及其活性、瘤胃吸收速率等因素对反刍动物瘤胃挥发性脂肪酸的浓度产生重要影响。Schoonmaker等[31]研究发现，不同来源的粗饲料经瘤胃发酵所产生的VFA浓度不同。Zhao等[32]研究发现，与饲喂玉米秸秆相比，饲喂苜蓿干草导致反刍动物瘤胃液中戊酸浓度水平显著升高，但对其他挥发性脂肪酸浓度无显著影响。这与本研究结果基本一致，本研究中，与饲喂苜蓿干草相比，饲喂麦秸对瘤胃中各种挥发性脂肪酸的浓度和乙酸/丙酸均没有显著影响，表明麦秸没有改变湖羊瘤胃发酵模式，仍是以乙酸发酵为主。在正常情况中低精料日粮水平的VFA的乙酸/丙酸偏高，高精料日粮水平的乙酸/丙酸偏低[33]。本研究中，饲喂麦秸对湖羊瘤胃乙酸/丙酸没有显著影响，表明麦秸没有影响瘤胃微生物群中有益菌菌群的繁殖和生长，即不改变微生物合成能力或对瘤胃中的碳水化合物的降解程度。

4 结 论

饲喂麦秸可提高湖羊瘤胃木聚糖酶活力，对瘤胃发酵代谢及肠道组织形态均无有害影响，所以在苜蓿干草不足的情况下，可将麦秸作为粗饲料饲喂反刍动物，本研究为麦秸在反刍动物上的合理利用提供了基础数据。