不同抗冻保护剂对鸡精液冷冻效果及基因表达的影响

李博宇 郭 勇 倪和民 盛熙晖 陈 余 王 梁 王相国 肖龙菲 邢 凯* 齐晓龙

(1.北京农学院 动物科学技术学院，北京 102206； 2.北京市畜牧总站，北京 100107)

冷冻精子通常用于人工授精(AI)、体外受精(IVF)和卵胞浆内单精子注射(ICSI)。在农业、水产养殖、濒危物种保护等方面具有广阔的应用前景[1]。在近几十年中，冷冻精液已经进行了广泛应用，抗冻保护剂是影响精液冷冻保存效果的重要条件之一，主要包括提供精子存活所需要能源物质，维持适宜渗透压和pH的精液稀释液以及防止或减少冷冻过程中精子冰晶形成的抗冻剂。DMA和DMSO是目前公认的效果最好的2种抗冻剂。现在大多数抗冻保护剂研究主要集中于稀释液配方的优化或者抗冻剂的选择上，李洁等[2]通过在抗冻保护剂中添加不同抗氧化剂，发现一定浓度的褪黑素对鸡精液保存具有显著作用，同样添加不同浓度的红景天多糖、枸杞多糖等能显著提高鸡精子的冻后活率[3]。然而不同抗冻保护剂对鸡精液抗冻效果及抗冻机制的相关研究较少。而且由于家禽精子独特的生理学特征及个体差异性，到目前为止，尚未发现一种特别有效的鸡精液抗冻保护剂[4]。

基因表达谱芯片已被应用到动物精子基因表达水平检测。Singh等[5]采用表达谱芯片鉴定出了几千个鸡精液中高表达的基因。而针对冷冻前后的精液，Chen等[6]比较了荷斯坦牛鲜精和冻融精的基因表达水平，并鉴定出15个差异表达的基因(Differentially expressed genes，DEG)。这些研究表明表达谱芯片是鉴定精子基因表达的一种研究方法。

因此本研究以海兰褐种公鸡为研究对象，通过分析不同抗冻保护剂处理组的精子活性，旨在筛选冷冻效果更好的抗冻保护剂。并通过采用Affymetrix公司全基因表达谱芯片对两组鸡精液进行全基因组基因表达检测，并筛选出两组间的差异表达基因，为阐明不同抗冻保护剂的抗冻机制提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1样品采集

试验用的海兰褐种公鸡饲养在北京农学院动物房至6月龄。饲养条件为自然光周期，自然温度，自由饮食和饮水。采用腹部按摩法对18只健康的种公鸡进行精液采集。采集得到的每只种公鸡的精液平均分成两组，分别添加两种稀释保护液，然后用于制作冻精，2种稀释液分别用DMA和DMSO做抗冻保护剂。

1.1.2主要试剂

Trizol购自Invitrogen公司；反转录试剂盒购自Promega公司；其余试剂未作特殊说明均购自Sigma公司。

1.1.3抗冻保护剂配方

抗冻保护剂Ⅰ：谷氨酸钠0.867 g，D-果糖0.5 g，磷酸二氢钾0.065 g，磷酸氢钾1.27 g，乙酸钠0.26 g，六水氯化镁0.03 4 g，柠檬酸钾0.064 g，用水补至100 mL，pH=7.4，终质量浓度含6%DMA。

抗冻保护剂Ⅱ：谷氨酸钠1.4 g，葡萄糖0.7 g，D-果糖0.2 g，一水合柠檬酸钠0.14 g，聚乙烯吡咯烷酮0.1 g，硫酸鱼精蛋白0.02 g，无水磷酸氢钠0.98 g，无水磷酸二氢钠0.21 g，用水补至100 mL，pH=7.4，终质量浓度含10%DMSO。

1.2 方法

1.2.1精液的程序化冷冻及解冻

将采集得到的鲜精分别与抗冻保护剂Ⅰ和抗冻保护剂Ⅱ按1∶1稀释处理，5 ℃平衡30 min，用2种保护剂再次稀释，使终稀释比例为1∶3，5 ℃平衡30 min后，通过程序化冷冻仪(CL-8800i型，上海京灿精密机械有限公司上海)，制备鸡细管冻精。冷冻程序为从5 ℃至-35 ℃，速率为7 ℃/min，-35 ℃至-120 ℃，速率为9 ℃/min，最后投入液氮保存，冷冻7 d后进行后续研究。精液解冻时将冷冻保存的精液在37 ℃水浴解冻40 s。

1.2.2精液活力和活率的检测

精液的活力通过伟力精子分析仪进行精液活力的检测(WLJY-9000型，伟力彩色精子质量检测系统，北京伟力新世纪科技发展有限公司，北京)。每个样品重复测量3次，取均值代表样品精子活力。活率的检测利用伊红-苯胺黑染色方法。精子冷冻-解冻后置于1.5 mL离心管中，滴加1～2滴伊红染色液，混匀，放置30 min。滴加苯胺黑染色液3滴，混匀，放置30～60 s制成精液-伊红-苯胺黑染色液。滴加精子-伊红-苯胺黑染色液1滴于载玻片，制成涂片，晾干后在40倍油镜下进行统计，对载玻片的两端及中间部位分别计数，每次计数200个精子，共600个精子，求出平均数。未着色的精子为活精子。

1.2.3总RNA的提取、质量检测和纯化

将2组冻精解冻后的各18支精液随机分为3组，等量混匀，然后采用密度梯度离心法进行纯化。纯化后的精液去除缓冲液，并至于冰上30 min使用体细胞裂解液处理。

按照Trizol试剂盒的说明书，采用Trizol法提取精液中的总RNA。RNA的纯度使用OD260/OD280值、OD260/OD230值和1%的凝胶电泳评估。使用分光光度计检测总RNA的浓度。使用脱氧核糖核酸酶Ⅰ去除总RNA中的DNA。测得RNA的OD260/OD280值在1.8～2.0，OD260/OD230值在2.0～2.2。满足Affymetrix公司全基因表达谱芯片使用标准的RNA进入下一步试验。

1.2.4芯片杂交

采用Affymetrix公司鸡全基因表达谱芯片(购自北京博奥晶典生物技术有限公司)，共包含38 535个探针。纯化后的总RNA经反转录合成first strand cDNA和second strand DNA后，形成双链DNA。以second strand cDNA为模板，利用T7 Enzyme Mix合成cRNA，掺入生物素Biotin。使用磁珠纯化cRNA，除去盐、酶等杂质，并对cRNA进行定量。将cRNA片段化成适宜杂交的大小以备杂交使用。根据Affymetrix公司相应试剂盒，将cRNA与芯片进行杂交。并进一步对芯片进行清洗、染色和扫描。使用AGCC软件将芯片的荧光扫描图像保存分析。

1.2.5qPCR结果验证

为了验证表达谱芯片数据的准确性，选择了5个 DEG进行qPCR检测。采用AriaMx G8830A qPCR系统(美国安捷伦科技公司)并按照制造商的说明，使用TransStart®Top Green qPCR SuperMix(TransGen Biotech，北京)进行qPCR验证。采用Primer Premier 5.0软件设计引物，引物序列见表1。引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。使用甘油醛-3-磷酸脱氢酶(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH)基因作为内参，使用2-ΔΔCt方法计算基因的相对表达水平。

1.2.6数据分析

使用Expression Console软件(Affymetrix)将文件的图像信号转化为数字信号，即每个探针的荧光信号强度。使用RMA算法将数据进行背景校正和归一化。使用SAM R程序包分析DEG，DEG的筛选标准为：q-value≤0.05且Fold change≥2或≤0.5。使用Molecule Annotation System对DEG进行基因功能(Gene ontology, GO)和KEGG通路富集分析，显著的阈值为P≤0.05。验证结果使用SPSS版本10.0(IBM Corporation，NY) t-test进行对不同组之间的精子活力进行差异显著性分析。P<0.05表示在两组之间差异显著。

2 结果与分析

2.1 不同抗冻保护剂冻后精子活力检测

由表2 得知，保护剂Ⅰ组的精子活力27.05±1.22高于保护剂Ⅱ组20.65±1.50，且差异显著(P<0.05),而且，保护剂Ⅰ组的精子冻后活率47.65±5.89明显高于保护剂Ⅱ组35.15±5.15。表明保护剂Ⅰ的冷冻效果明显高于保护剂Ⅱ，更适合海兰褐种公鸡精液冷冻保存。

2.2 不同抗冻保护剂冷冻解冻后精液差异表达基因分析

为了研究不同抗冻保护剂对鸡精液冷冻-解冻后基因表达的情况，本研究采用鸡全基因组表达谱芯片鉴定保护剂Ⅰ和保护剂Ⅱ中精子的基因表达情况(每组3个重复)。经扫描分析信号后，38 535个探针被检测到在鸡精液中表达，其中的73.73%注释到鸡的基因上。对鸡精液基因表达进行主成分分析(PCA)发现，保护剂Ⅰ和保护剂Ⅱ的样本被明显的区分开(图1)。通过解冻后两组间的比较，发现了1 604个基因在两组中显著差异表达(|log2(FC)|>1;q-value<0.05)，与保护剂Ⅱ相比，在保护剂Ⅰ组中高表达1 380个基因，低表达224个基因(图2)。

表1 本研究中的引物信息Table 1 Information of primers in the study

表2 不同抗冻保护剂组间精液冻后活力活率Table 2 Sperm viability after freezing in different cryoprotectants groups

图1 不同样本间基因表达水平的PCA分析Fig.1 PCA analysis of gene expression levels among different samples

图中横坐标表示样品间的差异倍数对数值，纵坐标表示2个样品的-lg(FDR)值。红色表示保护剂Ⅰ相对于保护剂Ⅱ表达量上调的基因，绿色表示表达量下调的基因，蓝色表示没有差异的基因。The abscissa represents the logarithm of the difference between the samples, and the ordinate represents the -lg (FDR) value of the two samples. Red indicates up-regulated genes in cryoprotectant Ⅰ compared with cryoprotectant Ⅱ, green indicates down-regulated genes, and blue indicates no difference.图2 差异表达基因的火山图Fig.2 Volcano map of differentially expressed genes

2.3 差异表达基因功能分析

为了解DEG涉及的生物学功能，使用超几何检验的方法对DEG进行GO(Gene ontology)和KEGG (Kyoto encyclopedia of genes and genomes)通路的功能富集分析。富集GO条目的结果显示，在生物学过程、细胞组分和分子功能3个方面共发现622个显著富集的GO条目(q<0.05)。主要参与核糖体合成、线粒体组成及功能调节、蛋白质结合、微管蛋白活性、蛋白质靶向翻译和mRNA分解代谢等过程(表2)。对DEG进行KEGG通路功能富集分析，共鉴定出18个显著的通路，其中包括内质网应激通路、氧化磷酸化、蛋白质泛素化、核糖体调控以及线粒体呼吸调控等通路(图3)。

富集因子：参与通路的DEG数与该通路总基因数的比值。Enrichment factor: the ratio of the number of DEG involved in the pathway to the total number of genes in the pathway.图3 DEG富集的显著通路Fig.3 The pathways involved by differentially expressed genes

2.4 qPCR验证差异表达基因

通过对芯片结果的相关分析，再结合相关文献的研究进展，从差异表达基因中挑选了CIRBP、CCND1、RHOA、HSP90和HSP70这5个基因，并对其进行qPCR的验证。由图4可知，目的基因的qPCR检测结果虽然与表达谱芯片的检测结果数值上有些差异，但是整体趋势是完全一致的。经过qPCR的验证对比可知，表达谱芯片的检测结果基本可靠，所筛选出来的差异表达基因基本符合其真实表达情况。

3 讨 论

随着养禽业的快速发展,鸡人工授精技术得到广泛应用。作为人工授精技术发展的重要环节,鸡精液抗冻保护剂直接影响该技术的应用。该技术水平的高低直接影响优良种公鸡的利用效率和养鸡生产的经济效益。用于精液冷冻保存的抗冻保护剂本质上有助于在冷冻过程中和冷冻后维持精子的结构和功能[7]。很少有研究比较抗冻保护剂间在鸡精液冷冻过程中的效果。抗冻保护剂Ⅰ已广泛应用到鸡冷冻精液中，而抗冻保护剂Ⅱ在松鸡外的其他家禽中很少报道。因此本研究比较了这2种抗冻保护剂冻后精液的差异基因的表达情况，筛选出更为合适的海兰褐种公鸡精液抗冻保护剂，并阐明其抗冻机制。

能量代谢直接影响精子的冷冻保存[8]。已经发现精子线粒体是冷冻保存过程中受损最严重的细胞器之一，很可能是由于冻融后运动力和生育力丧失，而通过上调线粒体呼吸链调节酶的活性，可以增强精子活力[9]。本研究通过对2种抗冻保护剂DEG进行KEGG通路功能富集分析，发现了一些与能量代谢相关的途径，如线粒体呼吸调控，氧化磷酸化，内源性大麻素信号通路，与之相关的基因包括NADH脱氢酶(NADH dehydrogenase)，泛醇-细胞色素c还原酶(Ubiquinol cytochrome C reductase)，ATP合酶(ATP synthase)，细胞色素b(Cytochrome b)和琥珀酸脱氢酶(Succinate dehydrogenase)等。这些基因的差异表达可能是导致了2种保护剂间精子活性差异的重要因素。本研究发现，冻融处理影响了鸡精子线粒体呼吸链酶的表达，进而减少了ATP的生成，从而阻断了精子运动的能量来源，其背后的具体调节机制值得进一步研究。

表3 差异表达基因最显著富集的GO条目Table 3 GO entries with the most significant enrichment of differentially expressed gene

图4 表达谱芯片与qPCR中各基因差异表达情况Fig.4 Different expression of each gene in expression profile chip and qPCR

精子发生是一个高度复杂而独特的分化过程。细胞周期调节基因在精子发生中起重要作用。细胞周期蛋白及其依赖细胞周期蛋白激酶CDK是细胞周期的关键调节因子[10]。细胞周期蛋白D1(CCND1)在细胞周期G1/S转换过程中发挥特定作用。对小鼠精原细胞的研究发现，PI3K-AKT和MAPK信号通路在CCND1的调控中发挥重要作用[11]。在本研究中，在细胞周期途径中显著富集了17个DEG，包括CCND1、CDK4、CDK6和CDKN1B等。结果表明，这些基因不仅参与细胞周期调控，而且选择性的保留在成熟精子中，并且可能与精子的抗冻结能力有关。细胞周期调控基因水平的降低是否会导致冻融后鸡精子活力的下降，尚需进一步研究。

HSP90和HSP70同属于HSPs(热应激蛋白)家族。70 ku热休克蛋白(HSP70)在生殖系统发育和功能调节中具有重要作用[12]。70 ku热休克蛋白2(HSPA2)已被证明对小鼠精子发生过程中生殖细胞分化的进展至关重要[13]。最近研究发现，同样在雄性生殖系统中高度表达的HspA1L作为丝氨酸/苏氨酸激酶MAPKAP激酶2(MK2)的底物，通过P38 MAPK信号通路在精子的发生中发挥重要作用[14]。90 kDa热休克蛋白(HSP90)已发现其位于所有检查物种的精子尾巴中，并在精子繁殖力中起关键作用[15]。Casas等[16]研究表明,在猪精液冷冻保存前进行低温平衡、添加保护剂过程时，抗冻组的公猪HSP90基因的表达量显著高于不抗冻组，这可能是精子在适应冷应激所做出的反应。同样，王红等[17]研究表明，HSP90蛋白的含量与冻后牛精子的活力、质膜完整性、顶体完整性之间存在一定的正相关，可能与冷冻过程中相关抗冻蛋白的降解有关。本研究发现，HSP90和HSP70的mRNA水平在2种抗冻保护剂冻后表现出显著差异，而且冻后精子活力高的保护剂Ⅰ中HSP90和HSP70较保护剂Ⅱ显著上调，提示保护剂Ⅰ具有更好的抗冻保护效果，可以更好的应用到海兰褐种公鸡精液的冷冻保存中。然而HSP90蛋白改善解冻后精子活力和活率的潜在机制仍有待进一步研究。

冷诱导RNA结合蛋白(CIRBP)，是冷休克蛋白的一种，参与细胞功能所需的多种信号转导途径。CIRBP高表达时维持正常的生精功能，而在精子冷冻后显著下调，导致有丝分裂或减数分裂紊乱，生精细胞过度凋亡，引起各种机能紊乱[18]。本研究发现，与保护剂Ⅰ相比，冻融处理后保护剂Ⅱ中CIRBP的mRNA水平显著下降，这表明抗冻保护剂Ⅰ更适合海兰褐种公鸡精液的冷冻保存。不过由于相关研究报道较少，具体原因还有待进一步研究。

综上所述，本研究发现抗冻保护剂Ⅰ更适合海兰褐种公鸡的精液保存，并通过采用表达谱芯片技术，筛选出不同抗冻保护剂冻后精子的差异表达基因1 604个，主要参与线粒体调节、氧化磷酸化、核糖体调节和细胞周期循环等生物学过程和物质能量的新陈代谢、信号传导、细胞增殖与凋亡等通路。这些差异表达基因(如CCND1、HSP70、HSP90、RHOA和CIRBP)的变化可能影响不同抗冻保护剂的抗冻效果，为鸡精液抗冻保护剂的选择及其抗冻机制的研究奠定基础。