马铃薯StTrxF基因的克隆与功能分析

陈新红 叶玉秀 王永俊，2 陈许兵, 3 牛 远 周 青 王飞兵*

(1.淮阴工学院 生命科学与食品工程学院，江苏 淮安 223003；2.西北农林科技大学 农学院，陕西 杨凌 712100；3.扬州大学 农学院，江苏 扬州 225009)

马铃薯是继水稻、玉米和小麦之后我国第四大粮食作物[1]，其面积和产量仅次于小麦、水稻和玉米[2]，属弱耐盐性作物，对水分亏缺和盐非常敏感，盐害不利于其生长，对产量影响极大，目前生产上广泛种植的品种耐盐性均不是很高[3]。我国是马铃薯生产大国，盐胁迫下作物吸水困难，使细胞组织的水分外渗，种子萌发和幼苗的生长受到抑制；由于作物体内水分亏缺，进而光合作用下降，能耗增加，衰老加速，生长量降低，甚至导致植株大面积死亡[4]。但是，由于马铃薯组织与细胞培养技术成熟、植株再生较容易，遗传转化的各种手段均可采用，又可以通过块茎无性繁殖将转基因的特性传递给后代而无需经纯化或多代选育[5]。所以，在全球干旱、盐渍化环境严重以及我国“马铃薯主粮化”战略背景[6]下，研究马铃薯相关基因对盐胁迫的耐受机制具有重要意义。

硫氧还蛋白Thioredoxin(Trx)是一类高度保守的低分子量蛋白质[7]， 广泛分布于植物、细菌、酵母和动物中。根据氨基酸序列的不同，Trx 分为家族Ⅰ和家族Ⅱ 2个家族[8]，Trx具有调节细胞的生长、抑制细胞凋亡及调节基因转录等功能，并且它与硫氧还蛋白还原酶(TrxR)和烟酰腺嘌呤二核苷磷酸(NADPH)共同构成生物体内重要的硫氧还蛋白系统，对维持体内稳定的氧化还原状态具有重要的作用[9]。硫氧还蛋白(Trx)还具有抗旱、耐热、抗氧化胁迫和对抗逆基因的表达进行调控的能力[10]，因此，设想可否将Trx通过转基因技术克隆并导入到模式植物体中观察其表现，验证其功能，进而用以改良物种的遗传性状，这对提高植物耐盐抗逆性将发挥积极作用。

随着分子生物学理论研究的深入以及相关实验设备和产品的不断升级换代，实验技术的不断发展，植物耐盐性的研究取得很大的进展和突破，将会有越来越多的耐盐基因及信号转导途径被揭示[11]。这对于耐盐作物的培育、发展和土壤盐碱地的科学防控治理将具有重大现实意义。通过对马铃薯转基因技术在植物耐盐性及耐盐相关生理指标之间关系的深入探索研究，可为耐盐作物在生物基因工程方面的新探索与研究提供更多参考依据。

关于Trx蛋白调控植物耐盐性的研究尚未见报道或鲜有报道。本研究旨在通过StTrxF基因的克隆与功能分析，以期揭示StTrxF基因的过表达在植物拟南芥中的耐盐生理机制，同时为转基因技术在植物耐盐能力方面的应用提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

马铃薯(Solanumtuberosum)品种中薯5号由淮阴工学院生命科学与食品工程学院江苏省植物生产与加工实践教育中心实验室保存。

拟南芥(Arabidopsisthaliana)的种子经过质量浓度为2.5% CaClO2消毒后种植在黑土：蛭石：珍珠岩(体积比1∶1∶1)的混合基质中，22 ℃， 16 h光照，8 h黑暗，冷光源培养2周。

大肠杆菌(Escherichia coli)DH5α由淮阴工学院生命科学与食品工程学院江苏省植物生产与加工实践教育中心实验室保存。克隆载体PMD-18T、各类限制性内切酶、Taq聚合酶、连接酶、dNTP、10×PCR buffer和DNA marker购自宝生物工程大连有限公司。所有的化学试剂都从美国西格玛化学公司和上海国药化学试剂公司购买。

1.2 StTrxF基因的克隆及序列分析

取中薯5号无菌苗展开叶叶片约2.0 g，在液氮中研磨成粉状，加入10 mL离心管中，用Applygen Technologies Inc，Beijing公司的植物RNA提取试剂盒提取总RNA，方法参照说明书。利用QIAGEN Oligotex Mini mRNA Kit (QIAGEN，GmbH，Germany)从总RNA中纯化mRNA。纯化所得mRNA符合试验要求，用于马铃薯StTrxF基因cDNA全长的克隆。

在NCBI网站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)上选择BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)分析StTrxF的全长cDNA序列。使用DNAMAN软件对NCBI检索的StTrxF和TrxF同源物的氨基酸序列进行多重序列的比对分析。使用Prot-Param工具(http://Web.expasy.org/protparam/)计算理论相对分子质量和等电点(pI)。使用InterProScan(http://www.ebi.ac.uk/Tools/pfa/iprscan/)软件分析StTrxF的结构域[12]。

1.3 StTrxF基因转化拟南芥及检测分析

植物表达载体构建的方法参照Wang等[13-14]，用HindIII和EcoRI分别对质粒pCAMBIA1301和质粒pBI121双酶切，将后者gusA编码序列连同CaMV35S启动子和NOS终止子片段反向插入pCAMBIA1301多克隆位点，构建pCBGUS载体参照许红梅等方法[15]，通过农杆菌介导法使用蘸花法转化拟南芥，获得拟南芥拟转基因植株。

用CTAB 法[16]提取转基因植株和对照植株的基因组DNA。用常规方法进行PCR 检测，所使用的hptII基因引物为：hptII-F：5′-ACAGCGTCTCCG-ACCTGATGCA-3′和hptII-R：5′-AGTCAATGACC-GCTGTTATGCG-3′。在0.2 mL Eppendorf 离心管中加入10×PCR buffer 2 μL、dNTP(10 mol/L dNTP浓度是10 mmol/L)1 μL、引物(10 μmol/L)均为1 μL、 模板DNA(50 ng/μL) 2 μL、Taq DNA聚合酶 0.25 μL，加ddH2O至总体积20 μL。反应程序为94 ℃ 预变性5 min，94 ℃变性30 s，55 ℃复性30 s，72 ℃ 延伸2 min，共35个循环。

以表达StTrxF基因转基因拟南芥植株和野生型植株为试验材料。使用Applygen植物RNA提取试剂盒(Tiangen Biotech, Beijing, China)提取这些植物叶片总RNA，利用反转录试剂盒(Tiangen Biotech, Beijing, China)进行第一链cDNA合成。利用Primer 5.0 设计基因特异性引物StTrxF-F：5′-GTCAGTGGTATGCGTTGCAG-3′和StTrxF-R：5′-CCTGTCCTACCGTCACAGTC-3′。内标基因选用拟南芥AtActin基因，AtActin-F：5′-GCACCCTGTTCTTCTTACCGA-3和AtActin-R：5′-AGTAAGGTCACGTCCAGCAAGG-3′。每个样品均做4个平行管。PCR 热循环仪为ABI 7500(Applied Biosystems)，操作软件为7500 software V2.0.1，荧光染料为SYBR Green PCR Master Mix(Tiangen Biotech, Beijing, China)。

1.4 转基因植株耐盐性鉴定

参照Wang等[13]的文献，将转基因拟南芥和野生型种子，消毒灭菌后播种继代培养于200 mmol/L NaCl的1/2 MS培养基上，胁迫培养2周后，观察拟南芥植株的生长状态和生根情况。

基于Wang等[17]的方法，将转基因拟南芥和野生型种子在1/2 MS培养基上培养2周后，将植株移栽到盆中培养2周后，进行盐胁迫处理。用含有300 mmol/L NaCl的1/2 Hogland营养液每隔2 d灌溉1次，每次200 mL，处理4周，观察植株生长情况。

1.5 转基因植株的SOD/MDA/Pro的测定

盐胁迫处理后，按试验方法称取定量转基因拟南芥的新鲜叶片对超氧化物歧化酶(SOD)活性、丙二醛(MDA)含量和脯氨酸(Pro)含量等生理指标进行测定。SOD活性的测定[18]。丙二醛含量的测定采用TBA比色法，参照李合生等[19]的方法。

1.6 数据分析

原始数据的处理采用Excel软件，统计分析采用SPSS 17.0软件进行方差分析和显著性检验；生物学信息分析采用DNAMAN软件进行分析。P<0.05 或P< 0.01被认为在统计学上有显著或极显著的差异。

2 结果与分析

2.1 StTrxF基因的克隆与序列分析

使用RT-PCR技术从马铃薯中克隆得到StTrxF基因：以马铃薯cDNA为模板，利用基因特异引物进行PCR扩增，扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测得到预期大小的片段(图4)，将目的片段连接到PMD18-T载体后送样测序，得到StTrxF基因的CDS序列。该基因开放阅读框(ORF)549 bp，编码182个氨基酸多肽，结果显示其预测蛋白质分子量为44.17 ku和理论等电点(pI)为5.23。 利用InterProScan分析表明，StTrxF蛋白中含硫氧还蛋白F型结构域。BLASTX检索数据结果表明氨基酸StTrxF序列与SlTrxF1(番茄，Solanumlycopersicum，XP_004239649)，AtTrxF1(拟南芥，Arabidopsisthaliana， NP_186922.1)，CsTrxF1(亚麻荠，Camelinasativa，XP_010485595.1)，PeTrxF(山杨，Populuseuphratica，XP_011011425.1)，NaTrxF(烟草，Nicotianaattenuata，XP_019263-400)，BrTrxF(芜青，Brassicarapa，XP_009118514.1)，AtTrxF2(拟南芥，Arabidopsisthaliana，NP_197144.1)，CaTrxF(辣椒Capsicumannuum，XP_016573859)，NsTrxF(烟草樟子松Nicotianasylvestris，XP_009784813.1)，EgTrxF1(赤霞珠，Erythrantheguttata，XP_012834827.1)，SiTrxF1(芝麻Sesamumindicum，XP_011077155.1)氨基酸同源性分别为96.02%，84.17%， 84.04%，83.26%，82.36%，82.11%，81.65%， 81.23%，79.06%，67.03%和59.28%(图1)。进化关系分析显示，StTrxF与SlTrxF和CaTrxF的亲缘关系最近(图2)。

图1 StTrxF氨基酸序列与其他物种氨基酸序列比对Fig.1 StTrxF amino acid sequence and other species amino acid sequence comparison

方框标注基因为所研究目标基因。The box labeled gene is the target gene of interest.图2 StTrxF氨基酸序列与其他物种氨基酸序列的进化关系树Fig.2 StTrxF amino acid sequence and other species of amino acid sequence evolution relationship tree

2.2 转基因拟南芥植株的获得

构建植物表达载体pCAMBIA1301-StTrxF，通过根癌农杆菌介导法将StTrxF基因导入到拟南芥中，并通过Hgy抗性筛选获得T3拟南芥转基因植株，命名为A1～A6。通过CTAB法提取T3拟南芥转基因植株和野生型植株的基因组DNA。PCR检测扩增结果见图3。从图中可见，转化pCAMBIA1301-StTrxF的拟南芥拟转基因植株和阳性对照扩增出591 bp的目标条带，表明StTrxF基因已经整合到拟南芥的基因组中，并证明这些再生植株为转基因植株；野生型拟南芥植株没有扩增出591 bp的目标条带。转基因植株为后续功能分析。

M为Maker； W为阴性对照； P，质粒pCAMBIA1301-StTrxF阳性对照； WT，野生型拟南芥，泳道A1～A6：pCAMBIA1301-StTrxF的转基因拟南芥植株。下同。M， Maker； W, ddH2O； P，positive control；WT，wild type； A1-A6，transgenic Arabidopsis plants for transformation of pCAMBIA1301-StTrxF. The same below.图3 转基因拟南芥植物的PCR分析Fig.3 PCR analysis of transgenic Arabidopsis plants

2.3 转基因拟南芥植株耐盐性分析

qRT-PCR分析结果表明，StTrxF基因在转基因拟南芥植株中得到不同程度的表达，而在非转基因植株中未表达，并且在转基因株系A2和A3的表达量最高(图4)。因此，选取转基因株系A2和A3用于进一步离体鉴定和盆栽鉴定。

* 和 ** 分别表示P<0.05和P<0.01水平的差异显著。下同*and ** indicate significant differences at 0.05 and 0.01 level, respectively. The same below.图4 转基因拟南芥植株的qRT-PCR分析Fig.4 Analysis of transgenic Arabidopsis plants by qRT-PCR

转基因拟南芥株系(A2和A3)的植株生长明显优于野生型拟南芥植株(WT)：转基因拟南芥植株的叶片更大、颜色更绿，根长势也更好，说明转StTrxF基因植株的耐盐性相较野生型有大幅度的提高(图5 (a))。经盐胁迫处理4周后，转基因拟南芥株系(A2和A3)的生长状态明显优于野生型拟南芥植株(WT)，转基因植株的存活率表现更好，野生型拟南芥植株褐化死亡。这表明StTrxF基因的过表达能显著增强转基因拟南芥植株的耐盐性(图5 (b))。

2.4 转基因植株耐盐生理指标的测定

测定转基因株系(A2和A3)和野生型植株(WT)于200 mmol/L NaCl盐胁迫培养2周后，转基因拟南芥植株SOD活性和游离脯氨酸含量显著高于野生型植株，而MDA含量显著低于野生型植株(图6)。这表明SOD活性增强、游离脯氨酸含量提高和MDA含量积累降低，植物耐盐性增强；脯氨酸含量的增加，有利于维持细胞的渗透压，同时，可保护酶和膜系统完整性免受毒害，从而缓解胁迫压力，转基因拟南芥植株具有比野生型植株更加耐盐(图6)。

这些结果表明，过量表达StTrxF基因的拟南芥植株耐盐性明显增强，在盐胁迫下StTrxF的过表达影响SOD活性、MDA和游离脯氨酸含量等耐盐胁迫生理指标合成，而StTrxF对其的调控机制存在差异，但相互之间存在关联，综上，马铃薯StTrxF基因在提升植物耐盐性上具有重要调控作用。

正常条件为室温25 ℃条件下不用NaCl处理。Normal conditions were not treated with NaCl at room temperature 25 ℃.图5 转StTrxF基因拟南芥植株耐盐表型鉴定(a)，根长测定(b)和盆栽试验(c)Fig.5 Identification of salt tolerance phenotype of transgenic StTrxF gene Arabidopsis thaliana plant (a), root potted (b) and potted test (c)

图6 转基因拟南芥植株SOD活性(a)， MDA(b)和脯氨酸含量(c)的测定Fig.6 Determination of transgenic Arabidopsis plant SOD activity (a)， MDA content (b) and proline content (c)

3 讨 论

StTrxF基因广泛存在于各类生物的细胞中，我们为更加深入地了解该基因的功能，对稳定转化株系进行了功能分析。为验证马铃薯基因的功能，本研究以拟南芥作为首选转化对象。通过盐胁迫离体鉴定和盆栽鉴定，在盐胁迫条件下，转StTrxF基因拟南芥株系的耐盐性较野生型植株强。从某种程度上，可解释为StTrxF基因的过表达降低各类胁迫对植株造成的伤害，转入的StTrxF基因激发拟南芥的抗逆信号途径发生作用，从而提高转基因植株的耐盐性。

越来越多的研究表明[20]，Trx可以通过多种途径参与植物抗氧化胁迫：Trx是重要的氧化还原剂；Trx基因的表达常常与活性氧的增加有关。在植物的活性氧(ROS)清除酶系统中，SOD 作为ROS清除系统的关键酶，迅速将过氧化物歧化为O2和H2O2，其活性的大小反映植物对逆境胁迫的适应能力[21]。当植物遭受逆境胁迫时会启动自身的防御酶系统以抵御逆境胁迫带来的伤害[22]。以上这些研究为Trx基因在植物耐盐改良上的应用提供重要的理论参考。本试验对转StTrxF基因拟南芥的研究表明，转基因植株的SOD活性都显著高于野生型植株，转基因植株具有更高的耐盐能力。

Trx蛋白具有强的抗氧化作用，在较低量的条件下即可达到饱和状态[23]。本试验对转StTrxF基因拟南芥植株研究表明，野生型拟南芥植株的MDA含量较转基因植株的含量更高，且转基因植株具有较好的耐受能力。

游离脯氨酸的分配对植物的自我保护起着重要的作用，各组织中脯氨酸含量的多少，直接关系到其抗逆性的强弱[24]。本研究结果表明，在同一盐浓度处理下，转基因拟南芥植株叶片的Pro含量显著高于野生型植株，从而增强了转基因拟南芥植株的耐盐性。

4 结 论

从马铃薯中成功分离并克隆StTrxF基因。StTrxF基因的过量表达使得转基因拟南芥在盐胁迫条件下的萌发率、植株存活率和根长都有增加，促进植株的生长。本试验通过对转基因拟南芥植株的离体鉴定、盆栽鉴定及SOD、MDA和脯氨酸等耐盐生理指标的测定，证实TrXF通过改变SOD和MDA等生理指标能增强植物耐盐性，在植物的抗逆反应中发挥重要作用。