柿雄花表型及花粉形态多样性研究

索玉静 孙 鹏* 韩卫娟 刁松锋 傅建敏 李芳东

(1. 国家林业局泡桐研究开发中心，郑州 450003；2.中国林业科学研究院 经济林研究开发中心，郑州 450003)

柿(DisopyroskakiThunb.)为柿科(Ebenaceae)柿属(Diospyros)植物，原产我国，是一种具有近万年历史的传统木本粮食树种，由野生驯化为栽培柿也有近2 000多年的历史[1]。柿果实汁多味甜，富含多糖、黄酮、酚类及维生素C等多种营养物质，深受人们喜爱；柿叶和柿果还富含单宁类物质，在食品、保健、化工和医药等领域具有广阔的开发价值和应用潜力[2-4]。据联合国粮农组织(FAO)统计，2014年我国柿栽培面积约93.72万hm2，年产量高达380.36万t，均占世界第一。

柿树单性结实力很强，长久以来由于人们对柿果实的追求，野生雄株被人为的砍伐或改接，造成了绝大多数柿品种只开雌花，少量雌雄同株，完全雄性资源罕见的现状[5-6]。虽然生产上一般无需配置授粉树，但在种质创新和良种培育方面，雄性种质作为授粉父本的育种价值不容忽视[7-8]。本研究团队对柿分布区进行了广泛的野生雄性资源调查，结果发现在秦淮以南多地发现野生柿自然居群和柿野生完全雄性种质资源。这些新发现的野生资源、尤其是野生雄性资源的分类学地位尚不清楚，对其进行表型形态特征及遗传多样性评价，是柿雄性种质资源高效利用的基础。王丽媛等[9]利用SSR分子标记技术，对193份柿雄性种质资源及主栽甜涩柿品种和近缘种进行了遗传多样性分析；而若想对这类资源进行种质鉴定及综合评价，还需对其表型指标进行评价。此外，花粉微观形态特征在植物种质鉴定中被广泛应用[10]，但目前关于柿雄性种质花粉微观形态的研究多集中在少数柿属植物代表种之间[11-12]，关于柿种内雄性资源间花粉微观形态指标的差异尚未见报道。

目前，已颁布的《柿种质资源描述规范和数据标准》[13]和《柿新品种特异性、一致性和稳定性测试指南》(2010)两项标准中均缺乏柿雄性资源表型，尤其是雄花表型特征的相关描述，为柿雄性种质资源的评价和新品种选育造成困难。因此，本研究旨在通过对柿雄性种质资源的雄花表型形态特征进行评价，填补目前柿种质资源描述标准中关于雄性资源表型特征描述的空白，以期为后续柿雄性种质资源的评价及新品种选育提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 植物材料

以柿及其近缘种共计93份雄性种质资源为试验材料，其中来自广西、湖北、江西、江苏、湖南、河南、陕西、贵州、台湾等省份的柿雄性种质资源63份，包括各地野生资源、主栽品种及农家品种；此外，还包括日本起源的各类型(甜涩)柿雄性种质共计22份，油柿、浙江柿、美洲柿、君迁子等近缘种共计8份。江西野柿、江苏野柿、湖南野柿、湖北罗田野柿和富有F1的种子于2011年收集，2012年播种于原阳试验基地，于2016年花期采集本研究所需雄花，其余试验材料采集于各资源的起源地或西北农林科技大学园艺学院国家柿种质资源圃，详见表1。

表1 试验材料类型、来源及采集地Table 1 Material types, origins and collecting zones

表1(续)

表1(续)

表1(续)

1.2 表型测定

每份资源选取刚开放的雄花10朵，测定其花筒直径、花筒高、雄蕊数、最短雄蕊长、最长雄蕊长、雄蕊宽、萼片长、萼片宽、萼片数量、花托高、花托宽、花柄长和花柄宽等13个表型指标。收集其中33份雄性种质资源的花粉，将鲜样用双面胶粘在金属台上，经HITACHI E-1010型离子溅射仪喷金、镀膜，置于HITACHI S-3400N型扫描电镜中观察和拍照。

1.3 数据分析

采用SPSS.20.0软件包(SPSS.inc.，USA)计算各资源13个表型指标的均值和标准误。利用单因素方差分析法，对不同来源地和不同类型(甜涩)的资源分别进行组内和组间显著性差异分析，如果存在显著性差异，则用Tukey HSD法进行多重比较(P<0.05)；利用相同方法对种间资源表型及33份资源花粉长度、宽度和表面条纹长度进行差异显著性分析。最后利用主成分法和系统聚类法进行降维和聚类分析[14]。

2 结果与分析

将85份柿种内雄性资源根据其来源地及甜涩类型，划分为10个类别，即广西、木兰山、云架山、江西、江苏、湖南和罗田等野柿雄株，及常见甜柿、涩柿和‘富有’与‘赤柿’杂交F1代类别。通过对85份柿种内雄性资源及8份柿近缘种雄性资源的13个雄花表型指标进行测量和统计分析，研究柿属种间和柿种内各类别资源雄花表型指标的差异。部分资源雄花表型见图1。

图1 部分柿及其近缘种资源的雄花表型图Fig.1 The male flower phenotype of some persimmon and its related species

2.1 种间资源的雄花表型指标比较

对柿及其近缘种间雄性资源雄花表型指标进行比较分析，结果表明：柿与油柿、美洲柿、浙江柿、君迁子等近缘种在雄花最长雄蕊长、萼片长和花柄长等表型指标上存在显著差异；其中，柿的最长雄蕊长显著高于油柿，萼片长显著高于浙江柿和君迁子，花柄长均显著高于4个近缘种。此外，油柿的萼片宽和花托高均显著高于美洲柿，而与其他种间的差异未达到显著水平(表2)。

2.2 不同来源地和类型内部资源间雄花表型指标差异显著性分析

对10个类别的柿种内雄性资源雄花表型进行测量统计，分析不同来源地和类型内部资源间雄花表型指标的差异程度。从表3可以看出，广西各资源间花筒直径不存在显著性差异；木兰山资源间雄蕊宽和萼片数量不存在显著性差异；江西野柿资源间花筒高、雄蕊数、花序柄长、花柄长和不存在显著性差异；江苏野柿雄蕊数不存在显著性差异；湖南野柿间花筒直径、雄蕊数、最长雄蕊长、萼片长、花托高、花序柄长和花柄粗不存在显著性差异；罗田野柿间花筒高、最短雄蕊长、最长雄蕊长、雄蕊宽不存在显著性差异；常见甜柿雄株资源间花托宽不存在显著性差异；常见涩柿雄株资源间雄蕊数不存在显著性差异；富有F1资源间雄蕊宽不存在显著性差异。除此之外，各指标间均存在显著性或极显著性差异，说明各类型资源内部单株间雄花表型存在丰富的变异。

2.3 不同来源地和类型间资源的雄花表型指标比较

比较10个类型间柿雄性种质雄花表型之间的差异程度，结果如表4所示，除雄蕊数和萼片数量不存在显著差异外，其余11个指标在不同来源地和类型间均表现出不同程度的差异，其中以萼片宽、花托高和花托宽变异程度最大。广西雄性资源的花筒直径、花筒高、最长和最短雄蕊长值均最小，湖北木兰山野柿雄株的萼片宽、花托高和花托宽值最小；而江西野柿雄株的最短雄蕊长、萼片长、花托高和花托宽值最大，以及常见甜柿雄性资源的花筒直径、花筒高、最长雄蕊长、萼片宽和花柄长均值最大。此外，江苏野柿雄株的雄蕊数最多，最高达19枚/朵；罗田野柿雄株的花柄最粗，‘富有’ב赤柿’杂交F1代雄株的雄蕊宽值最大。

2.4 各类型资源雄花表型的主成分分析

对93份雄性资源雄花的13个表型指标进行主成分分析，前4个主成分的累积贡献率达到77.876%，因此选取前4个主成分作进一步分析。如表5所示，成分1主要代表花筒直径、花筒高、最短雄蕊长、最长雄蕊长、雄蕊宽；且花筒表型与雄蕊指标呈正相关，即花筒越大、雄蕊也越大。成分2主要代表萼片长、萼片宽、花托高、花托宽；萼片与花托表型也呈正相关。成分3主要代表萼片数量；成分4主要代表雄蕊数。分别选取2个主成分对93份雄性资源进行聚类分析，以判断各资源雄花表型特征。

表5 旋转后的成分矩阵Table 5 The component matrix after rotation

以成分1为横坐标，成分2为纵坐标绘制散点聚类图，横坐标的值增加代表花筒直径、花筒高、最短雄蕊长、最长雄蕊长、雄蕊宽增大；纵坐标的值增加代表萼片长、萼片宽、花托高和花托宽增大。图2中各资源被分为5类，第Ⅰ类包括江西野柿雄3和江苏野柿1-19，具有花筒、雄蕊小，但萼片、花托大的特点；第Ⅱ类包括湖北云架山8、江西野柿雄1、江西野柿雄4、太秋、耀县五花柿和小八胡等，这些资源的花筒和雄蕊较小，萼片和花托较大；第Ⅲ类包括江苏野柿2-9和47A(4)(甘秋芽变)，这类资源的花筒、雄蕊大，萼片、花托和花柄也较大；第Ⅳ类包含33份资源，表现出花筒和雄蕊、萼片、花托和花柄都较小的共同特点；第Ⅴ类包含50份资源，这些资源的花筒、雄蕊较大，但萼片、花托较小。

图中编号对应资源名称详见表1，下同。The number corresponding to the resource in the figure is shown in Table 1. The same below.图2 93份雄性种质资源以成分1和2为坐标的散点聚类图Fig.2 Scatter plot of 93 male germplasm resources with components 1 and 2 as coordinates

以成分1为横坐标，成分4为纵坐标绘制散点聚类图，横坐标的值增加代表花筒直径、花筒高、最短雄蕊长、最长雄蕊长、雄蕊宽增大；纵坐标的值增加代表雄蕊数减少。由图3可知，93份雄性资源被分为6类，其中第Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ类资源的雄蕊数都较低；第Ⅰ类资源的花筒和雄蕊最小，而第Ⅲ类资源花筒和雄蕊最大；第Ⅳ和Ⅴ类资源的花筒、雄蕊大小分别与第Ⅰ和Ⅱ类资源相似，而雄蕊数较多；第Ⅵ类资源包括广西51和油柿，其花筒、雄蕊小于其他资源，但其雄蕊数最多。

图3 93份雄性种质资源以成分1和4为坐标的散点聚类图Fig.3 Scatter plot of 93 male germplasm resources with components 1 and 4 as coordinates

以成分3为横坐标，成分2为纵坐标绘制散点聚类图，横坐标的值增加代表萼片数量增加；纵坐标的值增加代表萼片长和宽、花托高和宽增大。由图4可知，93份资源被分为4类，其中第Ⅰ类资源包括江西野柿雄3、江苏野柿1-19、47A(4)(甘秋芽变)和耀县五花柿，这些资源萼片数量较少，但萼片长和宽、花托高和宽最大；第Ⅱ类资源包括86份，都表现出萼片数较少，萼片长和宽、花托高和宽也较小的特点；第Ⅲ类资源为湖北木兰山24，其萼片数量偶有5瓣，萼片长和宽、花托高和宽都很小；第Ⅳ类资源包括广西51和广西2，其萼片数量偶有5瓣或6瓣。

图4 93份雄性种质资源以成分3和2为坐标的散点聚类图Fig.4 Scatter plot of 93 male germplasm resources with components 3 and 2 as coordinates

2.5 花粉表型变异

对29份柿种内雄性资源及其4个近缘种的花粉进行电镜观察，观察各雄性种质花粉形态、粒表面纹饰及萌发沟(图5)，并测量花粉长、宽及其表面条纹长度。结果表明，5个种间资源的花粉长和宽均存在极显著性差异(P<0.01)，表面条纹长存在显著性差异(P<0.05)。由表6可知，美洲柿花粉最大，其次为柿，两者的花粉长和花粉宽显著高于君迁子、浙江柿和油柿，而后三者之间差异不显著。此外，油柿的花粉表面条状纹饰最长，浙江柿最短。

图5 部分柿及其近缘种花粉电镜观察图Fig.5 Electron microscopic observation of the pollen of some persimmon and its related species

表6 柿及其近缘种间花粉形态指标比较Table 6 Comparison of pollen morphology between persimmon and its interrelated species μm

柿种内29份资源间花粉长存在显著性差异(P<0.05)， 云架山5号和老尖山5号资源的花粉最长，罗田野柿雄株的花粉最短。花粉宽和表面条纹长在29份资源间均存在极显著性差异(P<0.01)，Tukey’s多重比较发现木兰山43花粉显著宽于木兰山11、耀县五花柿和青化雄株；木兰山1号和江苏野柿2号的花粉表面纹最长，华柿1-1最短，变异系数为28.93%，说明花粉表面条纹长度在29份柿雄性资源间存在丰富的变异(表7)。此外，对花粉长、宽和表面条纹长进行Pearson相关性分析，结果表明花粉长和花粉宽之间的相关系数为0.767，呈极显著性正相关(P<0.01)。

表7 柿种内29份雄性资源花粉形态指标比较Table 7 Comparison of pollen morphology between 29 male resources in persimmon μm

表7(续)

此外，经扫描电镜显微观察，柿及其近缘种的花粉表面结构均呈线性条纹状，除条纹的长短在各资源间存在显著性差异外，各资源花粉表面条纹的深浅和交错程度也存在差异。条纹较浅的资源有11份，包括木兰山16号、木兰山44号、江苏野柿1号、正月、平顶山涩柿、什样柿、兴义水柿、青化雄株、君迁子、浙江柿和油柿，剩余22份资源花粉表面条纹较深。条纹交错程度低、方向较为一致的资源有6份，即木兰山1号、木兰山7号、木兰山16号、木兰山44号、江苏野柿1号和正月；剩余27份资源花粉表面条纹纵横交错程度较高。此外，柿及其近缘种的花粉萌发沟内呈现出颗粒状凸起，各凸起的直径为0.3～0.6 μm。

3 讨 论

3.1 柿及其近缘种间雄花表型及花粉微观形态多样性

本研究对比了柿与其4个近缘种间雄性种质的雄花表型差异，在13个表型指标中，只有5个指标在种间有显著差异，说明柿属植物种间雄性资源表型变异程度较弱。就花粉粒大小而言，美洲柿最大，其次为柿，而君迁子、浙江柿、油柿较小；由于美洲柿与柿均为六倍体，而君迁子、浙江柿、油柿为二倍体，所以呈现出花粉体积随着倍性增加而增加的规律，这与张永芳[12]的报道一致。

3.2 柿种内雄花表型及花粉微观形态多样性

本研究发现柿种内不同来源地和类型间雄性资源的雄花表型变异程度较强，13个表型指标中，除雄蕊数和萼片数量在柿种内10个类别间不存在显著差异外，其余11个指标均表现出不同程度的差异，其中萼片宽、花托高和花托宽等指标的变异程度最大；常见甜柿雄性资源在多个表型指标中均表现出优于其他类型资源的特点，这可能与长期的人为选择有关。此外，柿种内10个类别内部资源雄花表型也存在较强变异，尤其是云架山野生雄性资源，其13个表型指标在不同单株间均存在极显著差异；木兰山野生雄性资源除雄蕊宽和萼片数量外，其余指标在不同单株间也均存在极显著差异，这与王丽媛等[9]发现的湖北木兰山和云架山来源的雄性资源遗传多样性最高一致。但是，湖南野柿雄性资源在花筒直径、雄蕊数、最长雄蕊长、萼片长、花托高和花柄粗等6个指标中无显著差异，罗田野柿雄性资源也有4个指标无显著差异，推测可能与这2个类别的样本数量较少有关。

3.3 柿雄性种质资源的评价与鉴定

对于收集保存的种质资源进行评价和鉴定，是对种质资源充分利用的基础。表型是生物遗传变异的表征，植物居群的表型特征与其生境密切相关，其多样性水平是遗传多样性与环境异质性的综合体现，在适应和进化上具有重要意义[15]。因此，对植物表型形态特征进行评价和鉴定，是种质资源评价的基本而必要的内容。柿作为一种栽培历史悠久的经济林树种，长期以来，人们对柿果实的追求严重影响了柿雄性种质的生存与利用，从事柿育种的研究者曾认为柿严重缺乏雄性资源，故而目前颁布的《柿种质资源描述规范和数据标准》[13]和《柿新品种特异性、一致性和稳定性测试指南》(2010)2项标准中均缺乏关于柿雄性资源，尤其是雄花表型的相关描述。本研究对收集保存的柿及其近缘种雄性种质资源雄花表型和遗传变异进行了综合评价，填补了2项标准的空白，为后续柿雄性种质资源的高效利用，以及柿雄性新品种的选育提供了理论依据。