雄激素和氢化可的松对山羊附睾头上皮细胞增殖的影响

栾兆进 范晓梅 宋慧子 栗瑞兰 张 通 张家新*

(1. 内蒙古农业大学 动物科学学院/内蒙古自治区动物遗传育种与繁殖重点实验室，呼和浩特 010018； 2.内蒙古医科大学 基础医学院，呼和浩特 010110)

附睾紧贴睾丸的上端和后缘，可分为头、体、尾三部分，精子离开睾丸进入附睾，在附睾转运过程中对精子的成熟起着关键作用[1]。精子在通过附睾腔时，与附睾上皮细胞合成分泌的蛋白相互作用来获得运动和受精的能力[2-6]。上皮细胞表达受激素和其他生物信号的调节，细胞体外培养是基因功能验证、调控机制和信号通路研究等相关试验的必要基础。许多功能基因在不同动物附睾中表现出不同的表达模式[7-9]。附睾头、体和尾部3个解剖区域的上皮细胞具有不同的生理功能和独特的蛋白质组，不同蛋白表达受到特定的转录因子系统的调控以协调功能的区域特异性[6]。

附睾对雄激素具有高度依赖性，雄激素在维持附睾结构和功能中发挥着重要调节作用，与雄激素结合蛋白(ABP)结合的睾酮可通过受体介导被附睾初始段和头部上皮细胞摄取[2]。氢化可的松可作用于糖皮质激素受体(GR)、核受体和免疫细胞部分基因的转录因子等多种受体[10-11]，在体外培养细胞中的作用不尽相同：研究表明氢化可的松能够抑制体外培养的软骨细胞[12]和成纤维细胞[13]增殖；对奶牛乳腺上皮细胞[14]、皮肤角质细胞[15]、角膜缘干细胞[16]和成熟脂肪细胞[17]的体外增殖有明显的促进作用,该激素已被用于人[6]和大鼠[18]附睾上皮细胞体外培养。目前，国内外已经开始重视对附睾功能的探究，但多利用附睾组织而非分离的上皮细胞进行基础研究，上述2 种激素对山羊附睾头部上皮细胞的增殖机理以及二者间是否存在互作的研究尚未见报道。本研究拟通过向体外细胞培养基中分别加入不同浓度的睾酮和氢化可的松，研究睾酮和氢化可的松对山羊附睾上皮细胞增殖的影响，进一步探究睾酮和氢化可的松之间是否存在互作及其可能机制，旨在为山羊附睾上皮细胞增殖机理和附睾功能的研究提供基础数据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

本试验于2016年6—10月在内蒙古自治区动物遗传育种与繁殖重点实验室进行，将10～12月龄被覆完整白膜的内蒙古绒山羊睾丸在超净台内划开白膜取出附睾头部组织，用于细胞体外培养。

1.2 试验仪器及主要试剂

NANODROP 2000紫外分光光度仪(Thermo)；MX3000P实时荧光定量PCR仪(Agilent)；酶标仪(Bio-Tek)；Imager A2 显微镜(蔡司)。

活性炭过滤胎牛血清 (Biological Industries)；睾酮(T6147，Sigma)；氢化可的松(H0888，Sigma)；CCK-8(TransGen Biotech)；雄激素受体拮抗剂Enzalutamide (EY0026，Amquar)；M-PERTMMammalian Protein Extraction Reagent (78503，Thermo)；TRIzol(TIANGEN)试剂盒；PrimeScript TMRT Master Mix kit(Tarkara)；TaqPCR Mastermix kit(TIANGEN)，ELISA 试剂盒(上海宝曼生物有限公司)。

1.3 试验方法

1.3.1附睾头部上皮细胞培养

10～12月龄被覆完整白膜的绒山羊睾丸在超净台内划开白膜取附睾头部组织，剪碎(大小1～3 mm) 呈糊状混合物，移入0.25% 胰酶中，37 ℃水浴震荡消化50 min，血清终止消化，再用0.1% 胶原酶Ⅳ(含CaCl20.36 mmol/L)震荡消化60 min，依次用100和200目不锈钢滤网过滤，滤过液加入等体积RPMI 1640培养基(100 mL/L胎牛血清、5 μg/mL 转铁蛋白、50 U/mL青霉素和50 μg/mL链霉素)，1 000 r/min离心5 min，去上清，调整细胞浓度为2×105个/mL进行培养。

1.3.2睾酮和氢化可的松对附睾头部上皮细胞增殖的影响

将生长状态良好的第2代附睾头部上皮细胞，用不含睾酮和氢化可的松的培养基制成适当密度的细胞悬液，以每孔100 μL细胞悬液(约含2 500个细胞)接种于96孔板， 37 ℃、5% CO2培养箱中培养12 h，待细胞贴壁，分别换不同浓度睾酮(0、50、100、200、1 000 nmol/L以及100 nmol/L睾酮 + AR阻断剂Enzalutamide，0.7%乙醇阴性对照组)或氢化可的松(0、20、200、2 000、20 000 nmol/L和0.7% 乙醇阴性对照组)的培养基继续培养，每个样本设置3个重复，培养基每24 h换1次，以不含细胞的培养基做空白对照孔。利用CCK法检测附睾头部上皮细胞增殖[19]，第5天(细胞处于增殖期)时每孔加入10 μL CCK-8溶液，37 ℃、5% CO2培养箱中继续孵育3 h。酶标仪检测450 nm波长处吸光度(A)值。

1.3.3附睾头部上皮细胞生长曲线制作

将第2代附睾头部上皮细胞用不含氢化可的松和睾酮的培养基制成适当密度的细胞悬液，以每孔100 μL细胞悬液(约含2 500个细胞)接种于96孔板，以不含细胞的培养基做空白对照孔，37 ℃、5% CO2培养箱中培养12 h，待细胞贴壁，分别换不同浓度激素的培养基(0、100 nmol/L睾酮、200 nmol/L氢化可的松、100 nmol/L睾酮+200 nmol/L氢化可的松)继续培养，分别在培养1、2、3、4、5和6 d后，每孔加入10 μL CCK-8溶液， 37 ℃、5% CO2培养箱中继续孵育3 h后，酶标仪检测450 nm波长处吸光度(A)值。每个样本设置3个重复，所有培养基每24 h换1次。

1.3.4睾酮/氢化可的松对雄激素受体(Androgen receptor，AR)的影响

用不添加激素的培养基培养的原代细胞消化成细胞悬液后接种于6孔板，待细胞贴壁后，分别换添加了100 nmol/L睾酮、200 nmol/L氢化可的松和100 nmol/L睾酮+200 nmol/L氢化可的松的培养基继续培养12 h，用于实时荧光定量法和ELISA法检测AR表达量，以不添加激素的培养基处理的细胞作对照组。

1.3.5总RNA的提取、cDNA的合成及PCR扩增(RT-PCR)

参照TRIzol(TIANGEN)试剂盒操作说明，分别提取添加100 nmol/L睾酮、200 nmol/L氢化可的松、100 nmol/L睾酮+200 nmol/L氢化可的松和不添加激素的培养基培养的第①代附睾头部上皮细胞总RNA；1% 琼脂糖凝胶电泳检测总RNA的完整性；使用PrimeScript TMRT Master Mix kit(Tarkara)试剂盒进行反转录合成cDNA；使用TaqPCR Mastermix kit(TIANGEN)试剂盒对AR基因和管家基因β-actin进行普通PCR扩增，循环条件为：预变性(95 ℃、5 min)，变性(95 ℃、30 s)，退火(62 ℃、30 s)，延伸(72 ℃、30 s)，35个循环后总延伸(72 ℃、10 min)；1% 琼脂糖凝胶电泳对扩增条带大小和亮度进行检测分析。引物序列和PCR退火温度见表1。

表1 AR和β-actin基因引物Table 1 Primers used for AR and β-actin

1.3.6实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析

使用SYBR Premix Ex TaqTMⅡ(Tarkara)对添加100 nmol/L睾酮、200 nmol/L氢化可的松、100 nmol/L睾酮+200 nmol/L氢化可的松和不添加激素培养基培养于6孔板中的细胞AR基因进行相对定量分析。每个待测样本设置3个重复，以β-actin为内参，采用2-ΔΔCt法计算分析数据。反应条件如下：95 ℃、10 min，95 ℃、30 s，62 ℃、30 s， 72 ℃、30 s，进行40个循环反应。反应体系为20 μL，包含10 μL SYBR Premix Ex TaqTM Ⅱ(2×)、1 μL cDNA、1 μL上下游引物、0.4 μL ROX、6.6 μL ddH2O(灭菌蒸馏水)。

1.3.7ELISA法检测附睾头部上皮细胞AR蛋白

将添加100 nmol/L睾酮、200 nmol/L氢化可的松、100 nmol/L睾酮+200 nmol/L氢化可的松和不添加激素培养基培养于6孔板中的细胞去除培养基，用PBS洗涤3次。150 μL蛋白提取剂添加1.5 μL PMSF，加入6孔板，轻晃10 min，移入1.5 mL离心管，14 000 r/min离心10 min，上清液用于ELISA法检测AR蛋白。严格按照山羊AR ELISA试剂盒操作说明进行，AR标准品浓度为：0、50、100、200、400、800 pg/mL。由于ELISA试剂盒测定AR浓度范围有限，试验样本均稀释5倍。

1.4 统计分析

本试验采用SAS 9.0软件中的ANAVO对试验结果进行单因素方差分析，采用Duncan法对不同浓度睾酮和氢化可的松作用于细胞增殖以及AR基因mRNA和AR蛋白表达量的主效应进行比较，P<0.01为差异极显著，P<0.05为差异显著。

2 结果与分析

2.1 睾酮对附睾上皮细胞增殖的影响

向细胞培养基中分别添加不同浓度睾酮、睾酮以及AR阻断剂Enzalutamide，并以0.7%乙醇作为阴性对照组，分为7个组检测睾酮对附睾头部上皮细胞增殖的影响。由图1可知，低浓度睾酮可明显促进附睾头部上皮细胞的增殖，其中，100 nmol/L睾酮组的促细胞增殖效应最佳，比对照组提高68.2%，差异极显著(P<0.01)；高浓度睾酮(1 000 nmol/L)对细胞增殖无显著促进作用，并与0 nmol/L对照组差异不显著(P>0.05)，表明睾酮对附睾头部上皮细胞增殖具有一定的促进效应，且该效应呈现出明显的浓度依赖性。100 nmol/L睾酮 + Enzalutamide处理组的细胞增殖与不含睾酮的对照组相比无显著性差异(P>0.05)，但与100 nmol/L睾酮组差异极显著(P<0.01)。0 nmol/L对照组与0.7%乙醇阴性对照组差异不显著(P>0.05)。

Ⅰ，0 nmol/L T；NC，阴性对照； Ⅱ，50 nmol/L T；Ⅲ，100 nmol/L T；Ⅳ，200 nmol/L T；Ⅴ，1 000 nmol/L T；Ⅵ，100 nmol/L T+雄激素受体阻断剂(Enzalutamide). **，差异极显著(P<0.01)，与Ⅰ组相比；##：Ⅲ组与Ⅵ组差异极显著(P<0.01)。Ⅰ，0 nmol/L T; NC, negative control; Ⅱ，50 nmol/L T；Ⅲ，100 nmol/L T；Ⅳ，200 nmol/L T；Ⅴ，1 000 nmol/L T；Ⅵ，100 nmol/L T+enzalutamide. **，extreme difference (P<0.01) compared with group Ⅰ; ##, extreme differences (P<0.01) between group Ⅲ and groupⅥ.图1 睾酮对附睾上皮细胞增殖的影响Fig.1 Effects of testosterone (T) on proliferation of epididymal epithelial cells

2.2 氢化可的松对附睾上皮细胞增殖的影响

通过向细胞培养基中分别添加浓度为0、20、200、2 000、20 000 nmol/L氢化可的松以及0.7%乙醇阴性对照组，分为6个组检测氢化可的松对附睾头部上皮细胞增殖的影响。结果由图2可知，与0 nmol/L 对照组相比，培养基中含200和2 000 nmol/L 氢化可的松可显著的促进附睾头部上皮细胞增殖(P<0.05)，其中，200 nmol/L时促增殖效果最佳，比对照组提高25.3%。0 nmol/L对照组与0.7%乙醇阴性对照组无显著性差异(P>0.05)。

Ⅰ，0 nmol/L H； NC，阴性对照；Ⅱ，20 nmol/L H；Ⅲ，200 nmol/L H；Ⅳ，2 000 nmol/L H；Ⅴ，20 000 nmol/L H。图2 氢化可的松对附睾上皮细胞增殖的影响 Fig.2 Effects of hydrocortisone (H)on proliferation of epididymal epithelial cells

2.3 睾酮和氢化可的松对附睾上皮细胞的生长曲线

为研究细胞培养基中同时添加睾酮和氢化可的松时是否可以对附睾上皮细胞增殖呈现出协同或拮抗效应，根据上述试验获得的培养液中所需睾酮和氢化可的松的最佳促增殖浓度依次检测了对照组、睾酮组、氢化可的松组和睾酮+氢化可的松组的生长曲线(图3)。结果表明各组的细胞生长曲线均近似“S”型，细胞培养的3～5 d均为细胞指数增长期；细胞培养的前4天，睾酮组和氢化可的松组的生长数据与对照组相比差异均无显著性 (P>0.05)，当细胞培养到第5、第6天时，睾酮组和氢化可的松组的细胞增殖显著高于对照组(P<0.05)；睾酮+氢化可的松组的细胞生长曲线从第3天开始即显著高于对照组(P<0.05)，且第6天的细胞生长与对照组有极显著差异(P<0.01)。

图3 睾酮和氢化可的松对附睾上皮细胞的生长曲线Fig.3 Interaction of testosterone (T) and hydrocortisone (H) on the growth curve of epididymal epithelial cells

2.4 睾酮和氢化可的松对AR表达量的影响

RT-PCR扩增结果如图4显示，引物特异性好，扩增的目的条带单一，且大小与设计一致，不同处理组的条带亮度有所不同，睾酮+氢化可的松组亮度最佳，睾酮组与氢化可的松组亮度区别不大，对照组亮度最弱。qRT-PCR定量结果见图5(a)，由添加了100 nmol/L睾酮的培养基培养的细胞的ARmRNA表达量较对照组有显著增加(P<0.05)，当培养基中只添加200 nmol/L氢化可的松时培养的细胞中ARmRNA表达量也较对照组有显著增加(P<0.05)，而当100 nmol/L睾酮与200 nmol/L氢化可的松共存时，ARmRNA表达量极显著高于对照组(P<0.01)，约是对照组的2.1倍。RT-PCR与qRT-PCR结果相一致，说明试验数据可信。

ELISA 试剂盒检测细胞AR蛋白水平，结果见图5(b)，培养基中只添加100 nmol/L睾酮或只添加200 nmol/L氢化可的松时，细胞中的AR蛋白表达量较对照组有显著的上调(P<0.05)，当睾酮与氢化可的松同时存在时，AR蛋白的表达量极显著高于对照组(P<0.01)，约是对照组的1.3倍。

图4 不同处理中AR 基因RT-PCR 扩增结果Fig.4 Detection of AR gene expressions after different treatments by RT-PCR

M，DNA分子量标记；1，100 nmol/L T+200 nmol/L H；2，200 nmol/L T；3，100 nmol/L H；4，对照组。M, DNA marker; 1, 100 nmol/L T+200 nmol/L H; 2, 200 nmol/L T; 3, 100 nmol/L H; 4, control group.图5 睾酮和氢化可的松对AR基因表达量的影响Fig.5 Effects of testosterone(T)and hydrocortisone(H) on the expression quantity of AR gene

3 讨论与结论

雄激素可直接或被转化为二氢睾酮(DHT)与AR结合，由AR介导，调节敏感基因的表达，还可经由膜相关AR激活多种信号传导通路介导发挥生理效应[20-21]。雄激素调控附睾特异性表达且与精子成熟相关的部分基因，如β-防御素18、19、20、39、41、42[22]，谷胱甘肽过氧化物酶5[23]，脂质运载蛋白5[24]和富含半胱氨酸的分泌蛋白1[25]。雄激素可以通过AR来诱导激活与前列腺基质细胞[26]、卵巢颗粒细胞[27]、前列腺癌细胞[28-29]和乳腺癌细胞[30]的增殖和存活相关的基因表达。本试验研究了培养液中含有不同水平的睾酮对附睾头部上皮细胞增殖产生的作用，结果表明，适当浓度的睾酮对附睾头部上皮细胞有显著的促增殖效应，且呈明显的剂量依赖性，该效应可以被AR阻断剂阻断，说明睾酮可以通过AR发挥对附睾头部上皮细胞促增殖作用，但是过高浓度睾酮(1 000 nmol/L)对细胞增殖无促进作用。此结论与王越[27]在卵巢颗粒细胞上的研究基本相符。

氢化可的松作为机体内源性糖皮质激素具有多种生理和药理作用，并作用于多种受体[10-11]。研究表明，软骨细胞的增殖能力[12]和成纤维细胞增殖及分泌胶原的过程均受到氢化可的松的抑制[13]。Bjornson等[31]在临床医学研究中发现血液中含有氢化可的松可以引起嗜酸性粒细胞的减少，并同时增多中性粒细胞。相关研究表明，氢化可的松可以明显提高奶牛乳腺上皮细胞[14]、角膜缘干细胞[16]及脂肪细胞[17]的体外增殖能力，并可抑制脂肪干细胞的脂肪分化，具有分解脂肪的活性[32]。氢化可的松还可促进小鼠β细胞的增殖[33]。该激素诱导细胞表面受体发挥生物学功能的分子机制不同可能导致了其在细胞增殖方面表现出不同效应。本试验研究了不同浓度氢化可的松对附睾上皮细胞增殖的影响，结果显示氢化可的松对附睾头部上皮细胞增殖起到一定的促进作用，且呈现出浓度依赖性，200 nmol/L为该激素的最佳促细胞增殖作用浓度。此结论与卫俊霞等[13]在皮肤成纤维细胞上的研究基本一致。

睾酮通过结合激活AR发挥功能，使AR识别并固定到目的DNA序列上以调控基因的表达[23-24]。Pearl等[34]研究发现GR可通过地塞米松的诱导与距离AR基因启动子上游小于10 KB的区域相结合，并显著上调AR基因表达量，进一步研究发现敲除GR基因可显著下调AR基因表达量，该试验表明GR对AR的上调是必需的。同为糖皮质激素的氢化可的松同样可通过GR发挥效应[35]，并可上调GR表达量[36]，固推测其可能通过诱导GR而导致AR基因上调。为了探究睾酮和氢化可的松同时存在时是否具有互作关系，本试验对对照组、睾酮组、氢化可的松组、睾酮+氢化可的松组中的附睾头部上皮细胞测定的增殖曲线结果显示，与对照组相比，睾酮和氢化可的松在细胞培养到第5天和第6天时均可显著的促进细胞增殖，而当这两种激素共同存在时对促进细胞增殖方面表现出显著的协同效应。为了探究该协同效应机制，进一步对不同激素作用后附睾头部上皮细胞的AR基因表达量进行了相对定量及ELISA检测。本研究中氢化可的松可显著上调附睾头部上皮细胞AR基因表达量，这与地塞米松可上调AR基因表达[34]的结果一致，而睾酮也可显著上调AR基因表达量，当氢化可的松和睾酮二者共存时AR基因表达量极显著上调，该结果表明睾酮可明显协同与氢化可的松作用于附睾头部上皮细胞AR基因表达量的增加，并与睾酮和氢化可的松共存时对附睾头上皮细胞增殖的显著协同作用相一致。因此，该协同作用可能是由于氢化可的松对AR基因表达量的上调，增强了睾酮通过AR来促进细胞增殖的效应，即表现为协同效应，此结果为进一步研究甾体类激素对山羊附睾功能调节提供理论依据。

综上所述，睾酮和氢化可的松在不同程度上影响着山羊附睾头部上皮细胞的增殖能力，二者对细胞增殖的促进效应均呈现出明显的浓度依赖性，当二者共存时可显著的协同作用于细胞增殖。睾酮通过AR发挥促细胞增殖效应，睾酮与氢化可的松协同促进AR表达，初步说明两种激素协同促细胞增殖效应可能与AR相关，但协同作用的调控机制仍需做进一步的探究。