黄体期和卵泡期小尾寒羊KiSS-1与RFRP-3组织表达研究

安雪姣 潘章源 赵生国 李春艳 田志龙 狄 冉 刘秋月 胡文萍 王翔宇 张效生 张金龙 蔡 原* 储明星*

(1.中国农业科学院 北京畜牧兽医研究所/农业部动物遗传育种与繁殖重点实验室，北京 100193； 2.甘肃农业大学 动物科学技术学院，兰州 730070；3.临沂大学 农林科学学院，山东 临沂 276005；4.天津市畜牧兽医研究所，天津 300381)

动物的季节性繁殖是由内分泌系统和中枢神经系统调控的复杂生理过程, 主要依靠下丘脑—垂体—性腺轴(HPG)的相互调节来实现[1]。研究发现编码RFamide家族神经肽类的基因KiSS-1与RFRP-3可能是动物季节性繁殖活动的重要调控因子。KiSS-1基因是Lee等[2]从人黑色素瘤细胞中分离得到，其翻译产物Kisspeptin是由145个氨基酸组成的亲水性蛋白，具有分泌神经肽的特点[3]；KiSS-1/GPR54 系统对哺乳动物的繁殖起中枢调控作用，它通过调节下丘脑促性腺激素释放激素(GnRH)的释放，来影响促卵泡素(FSH)和促黄体素(LH)的分泌[4-5]。Kisspeptin通过下丘脑通路激活GnRH 神经元来促进促性腺激素的分泌[6]，也可诱导体外培养的大鼠下丘脑中GnRH 的释放[7]。Kisspeptin直接作用于下丘脑—垂体—性腺轴，能促进GnRH 释放和LH含量上升，从而调控绵羊的季节性繁殖[8-9]。RFRP是在2000年从鹌鹑大脑中提取出来的可抑制垂体GnRH分泌的十二肽，并命名为促性腺激素抑制激素(GnIH)[10]。在哺乳动物中RFRP基因由2 条编码生物活性的短肽RF酰胺相关肽-1(RFRP-1)和RF酰胺相关肽-3 (RFRP-3)，其中，RFRP-3 对生殖系统的调控有抑制作用[11]。小鼠的RFRP-3细胞纤维体与大部分GnRH 细胞直接接触,对GnRH神经元有直接的抑制作用[12-13]。在哺乳动物中, RFRP-3也能抑制LH的合成与分泌。虽然KiSS-1和RFRP-3都是RFamide家族神经肽，但它们在动物季节性发情中的作用却相反，并且相互协调共同控制动物的季节性繁殖活动[14]。目前，对于不同繁殖状态下小尾寒羊下丘脑—垂体—卵巢生殖轴上各组织表达规律的研究很少。本研究以常年发情的小尾寒羊为研究对象，分别采集其卵泡期和黄体期生殖轴上的10 种组织，用荧光定量PCR方法检测KiSS-1和RFRP-3在不同繁殖状态下小尾寒羊不同组织中的表达差异，初步分析这2个基因在小尾寒羊发情状态转换中的作用，有助于进一步揭示绵羊季节性发情分子调控机制。

1 材料与方法

1.1 试验样品及主要试剂

随机选择来自山东郓城的身体健康、营养状况良好、体重一致的2～3岁经产空怀小尾寒羊母羊6只， 饲养于天津市畜牧兽医研究所试验羊场，保证所有羊只的饲养管理方式、饲料配方和环境一致。放置孕酮阴道栓(CIDR)并注射5～6 mL维生素AD以保护阴道内膜。放栓12 d后撤栓，撤栓当天记为1 d， 撤栓时刻记为0 h。撤栓后用腹腔镜观察卵泡发育和排卵情况来确定卵泡期采样时间，用公羊试情确定母羊发情状态及时间。连续试验2个情期后在撤栓后45 h(卵泡期)和10 d(黄体期)进行屠宰，每个时期各3只，屠宰后迅速采集下丘脑、垂体、松果体、大脑、小脑、卵巢、子宫、输卵管、肾脏、肾上腺共10种组织。分别装入2 mL的RNase-Free冻存管中，并立即放入液氮中，带回实验室转移到-80 ℃冰箱保存备用。

动物组织总RNA提取试剂盒(天根生化有限公司，北京)，反转录试剂盒(PrimeScriptTMRT Reagent Kit，TaKaRa公司，大连)，荧光定量染料(SYBR®Premix ExTaqTMⅡ，TaKaRa公司，大连)，EP管、96孔板、枪头等耗材均为RNase-Free产品。

1.2 总RNA提取

利用Trizol(Invitrogen，美国)和动物组织总RNA提取试剂盒(天根，北京)提取各组织总RNA。用NanoDrop2000检测所提取RNA的浓度和OD值(A260/A280为1.8～2.1)，用1%的琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性，检测合格后暂存于-80 ℃冰箱。

1.3 定量引物设计

根据GenBank公布的绵羊KiSS-1和RFRP-3基因mRNA序列(登录号分别为：NM_001306104.1和NM_001127268.1)，利用Primer Premier 5.0软件进行跨外显子引物设计，以β-actin(登录号：NM_001009784)为内参基因。引物由北京天一辉远生物科技有限公司合成。引物具体信息见表1。

表1 荧光定量引物信息Table1 Information of primers for Real-time PCR

1.4 cDNA合成

使用反转录试剂盒(PrimeScriptTMRT Reagent Kit)反转录合成cDNA，反应总体积为20 μL。反应条件为：37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s。全程在冰上操作。反转录产物进行5倍稀释后，用内参基因β-actin进行PCR检测，符合标准后-20 ℃保存。

1.5 实时荧光定量PCR

1.5.1标准曲线建立

取每个组织的cDNA样品2 μL混匀，按1∶2浓度梯度稀释，分别获得8个浓度梯度(1、1/2、1/4、1/8、1/16、1/32、1/64、1/128)的cDNA样品。用这些cDNA作为模板对目的基因和内参基因进行荧光定量PCR，以浓度梯度的对数值(10为底数)为横坐标，以检测所得Ct值为纵坐标，绘制目的基因和内参基因标准曲线，确保引物扩增效率为95%～105%。

1.5.2实时荧光定量PCR体系和程序

利用罗氏480Ⅱ型荧光定量PCR仪检测不同时期小尾寒羊在繁殖相关组织中KiSS-1和RFRP-3基因的表达，β-actin作为内参基因，每个样品做3个重复。反应体系总体积为20.0 μL，其中SYBR Premix ExTaqⅡ 2.0 μL，上下游引物各0.8 μL，cDNA 2.0 μL，RNase-Free ddH2O 6.4 μL。qPCR程序：95 ℃预变性5 s，95 ℃变性5 s，60 ℃ 30 s，45个循环。

1.5.3数据统计

采用2-ΔΔCt法[15, 16]计算目的基因的相对表达量，用统计学软件SPSS 19.0进行单因素方差分析， 最终结果用平均值±标准误(X±SEM)来表示。

2 结果与分析

2.1 总RNA提取及cDNA合成

用1%琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性，发现RNA电泳条带明亮清晰、完整、无拖尾(图1)。用Nanodrop 2000检测各组织RNA的提取结果，发现浓度均在100 mg/μL以上，A260/A280均为1.80～2.10。 经反转录合成的cDNA通过β-actin内参基因检测后发现，产物干净单一，表明RNA没有基因组DNA污染(图2)。说明提取的RNA和反转录后的cDNA可用于后续的荧光定量PCR反应。

2.2 KiSS-1和RFRP-3在不同时期小尾寒羊各组织中的表达

使用荧光定量PCR技术对卵泡期和黄体期的小尾寒羊10 种组织KiSS-1和RFRP-3基因的表达水平进行了研究，结果见图3和图4。

KiSS-1基因在2个时期小尾寒羊的10种组织均有一定表达，但在卵泡期子宫中的表达量很低。黄体期和卵泡期下丘脑KiSS-1基因表达量显著高于其他组织(P< 0.05)；卵泡期下丘脑和松 果体KiSS-1基因表达量显著高于黄体期(P<0.05)。

RFRP-3基因在2个时期小尾寒羊的10种组织中均有一定表达，但在黄体期子宫及卵泡期垂体和松果体中表达量很低。黄体期和卵泡期下丘脑和卵巢RFRP-3基因的表达量显著高于其他组织(P<0.05)；卵泡期RFRP-3基因在下丘脑和卵巢之间表达差异显著(P<0.05)；黄体期卵巢RFRP-3基因表达量显著高于卵泡期(P<0.05)。

1～8：大脑、小脑、下丘脑、垂体、松果体、子宫、卵巢和输卵管。M：DL2000 DNA分子标记。1-8，brain, cerebellum, hypothalamus, pituitary, pineal body, uterus, ovary and oviduct. M，DL2000 DNA Marker.图1 小尾寒羊 RNA电泳检测Fig.1 Electrophoresis of the RNA in Small Tail Han sheep

1～10：大脑、小脑、下丘脑、垂体、松果体、子宫、卵巢、输卵管、肾脏和肾上腺。M：DL2000 DNA分子标记。1-10：Brain, cerebellum, hypothalamus, pituitary, pineal body, uterus, ovary, oviduct, kidney and adrenal gland. M：DL2000 DNA Marker.图2 小尾寒羊10种组织中β-actin持家基因RT-PCR扩增产物Fig.2 RT-PCR amplification products of housekeeping gene β-actin in Small Tail Han sheep 10 different tissues

*表示差异显著(P<0.05)，下同。* represents significant difference at P<0.05. The same below.图3 KiSS-1基因在小尾寒羊不同时期各组织中的表达Fig.3 Expression of KiSS-1 gene in Small Tail Han sheep at different periods

图4 RFRP-3基因在小尾寒羊不同时期各组织中的表达Fig.4 Expression of RFRP-3 gene in Small Tail Han sheep at different periods

3 讨 论

3.1 KiSS-1基因表达

KiSS-1基因在动物季节性发情调控中起着关键的作用，在阿勒泰羊下丘脑、垂体、卵巢和甲状腺等组织中均检测到了KiSS-1基因的表达，其中下丘脑的表达量最高[17]。在济宁青山羊和辽宁绒山羊下丘脑、垂体、松果体、肾、卵巢、脂肪和甲状腺等组织中均检测到了KiSS-1基因的表达，下丘脑与垂体的表达量显著高于卵巢(P<0.01)[18]。梅山猪和长大二元母猪下丘脑KiSS-1基因的表达量极显著高于垂体和卵巢(P<0.01)[19]。在初情期母猪下丘脑中成功克隆KiSS-1基因并检测到该部位有高水平表达[20]。本研究对KiSS-1基因在小尾寒羊上的表达情况进行了研究，在下丘脑、垂体、卵巢、松果体等组织中均检测到了KiSS-1基因的表达，下丘脑中的表达量显著高于其他组织(P<0.05)，这与已有研究结果一致。但是，本研究中小尾寒羊垂体和卵巢中KiSS-1基因的表达量很低，与黄冬维等[18]和朱碧泉等[19]的研究结果不同，可能是由于不同物种在垂体中的表达存在差异所致。

哺乳动物促性腺激素的释放完全依赖于GnRH的分泌，在繁殖季节或者发情期绵羊下丘脑的GnRH 神经元会急剧增加[21]，而Kisspeptin的繁殖激活功能主要作用在GnRH神经元上。动物下丘脑弓状核以及视前区的KiSS-1神经元轴突末梢可直接投射到GnRH 神经元胞体上，建立突触连接[22-23]，并且其受体GPR54 在大多数GnRH 神经元上表达[24]。因此，Kisspeptin 被认为是GnRH 最有力的激活者。研究发现小尾寒羊下丘脑KiSS-1基因的表达量在不同的发情阶段存在显著差异，其中发情盛期最高，极显著高于发情前期、后期和间情期(P<0.01)[25]。发情启动后阿勒泰羊下丘脑中KiSS-1基因的表达量逐渐下降，其中发情盛期高于发情末期，都显著高于间情期(P<0.05)，极显著高于乏情期(P<0.01)[17]。季节性繁殖动物绵羊在短日照时(发情)KiSS-1基因mRNA表达量高于长日照时(休情)，其KiSS-1基因主要在情期表达[26-29]。Abadeh母山羊在繁殖季节卵泡期下丘脑上的Kisspeptin神经元明显多于黄体期和休情季节[30]。与本研究发现小尾寒羊下丘脑卵泡期表达量显著高于黄体期的结果一致。

松果体是动物机体“生物钟”的调控中心，能将昼夜明暗循环和季节性温度变化等周期信号转导成激素信号, 从而调整机体的生理机能[31]，其中褪黑素是松果体中最重要的产物。褪黑素可能通过Kisspeptin和RF 酰胺相关肽参与调控动物的季节性繁殖[32]。在发情期前对母鹿埋植褪黑素，可使其体内 FSH的浓度提高，促进卵泡的发育；同时能显著提高LH的浓度，进一步促进排卵，从而达到使母鹿超排的效果[33]。本研究中卵泡期小尾寒羊松果体KiSS-1的表达量显著高于黄体期。上述结果表明Kisspeptin 在小尾寒羊卵泡期和黄体期中的差异可能是由于褪黑素分泌模式的改变而引起的，并且松果体分泌的褪黑素对短日照繁殖动物的生殖活动起促进作用，通过Kisspeptin参与调控黄体期到卵泡期的发情状态转换。

3.2 RFRP-3基因表达

RFRP-3基因在母猪子宫、卵巢及眼等组织中度表达，在下丘脑高表达[34]。RFRP-3基因在母绵羊下丘脑等中枢神经系统和卵巢等生殖系统的表达量较高[35]。在幼龄绵羊延髓、眼、卵巢、子宫、下丘脑等组织中均检测到了RFRP-3基因的表达，其中延髓表达量最高，眼、卵巢、脊髓、子宫和下丘脑等组织次之，内脏组织最低[36]。天府肉鹅和新西兰白兔GnIH 前体基因主要表达于下丘脑[37-38]。济宁青山羊和辽宁绒山羊RFRP基因主要在下丘脑、大脑皮层、小脑和卵巢中表达[18]。本研究用荧光定量PCR的方法检测到RFRP-3基因在小尾寒羊下丘脑、卵巢、肾脏、大脑、小脑、肾上腺、输卵管中均表达，且在下丘脑和卵巢中高表达。不同物种之间RFRP-3基因的表达存在一定的差异，这可能是由于物种的特异性引起的。但是RFRP-3基因在小尾寒羊下丘脑和卵巢中高表达说明该基因在绵羊发情和繁殖中都发挥着重要作用。

不同动物RFRP-3基因在季节性繁殖中的作用有所不同。注射RFRP-3可以抑制绵羊GnRH神经元的活性[39]；在褪黑素的控制下RFRP-3可以促进叙利亚仓鼠GnRH的释放[40]。RFRP-3基因在处于长光照(16L∶8D)绵羊下丘脑的表达要高于短光照的绵羊[41]。繁殖期的绵羊RFRP-3基因在PVN和DMH中的表达量下降，与GnRH神经元接触的细胞数量也减少[42]；同时发现，长日照下的季节性繁殖绵羊与短日照的个体相比其RFRP的表达和投射增加[41]；Abadeh母山羊在繁殖季节卵泡期下丘脑中的RFRP神经元明显低于黄体期和休情季节[30]。这些研究结果支持了本试验中小尾寒羊下丘脑RFRP-3基因表达量黄体期高于卵泡期的研究结果，表明RFRP-3基因对绵羊的生殖活动起抑制作用。

本研究还发现RFRP-3基因在小尾寒羊卵巢中表达很高，黄体期显著高于卵泡期(P<0.05)。猪RFRP-3主要在发情前期和发情期的颗粒细胞以及发情后期和间情期的黄体细胞中表达[35]。研究表明RFRP-3基因在卵巢水平发挥局部作用，因为该基因在人的颗粒细胞中表达，同时能够减少促性腺激素的释放和孕激素的合成[43-44]。小鼠卵巢中的RFRP-3与GnRH的表达密切相关， GnRH-RFRP-3系统对整个排卵周期中的卵泡发育和闭锁起着重要作用[45]；RFRP-3在一定程度上影响促卵泡素的分泌与合成，参与调控卵泡的发育和闭锁[46]。本研究中RFRP-3基因在黄体期显著高于卵泡期，说明该基因在调控发情的时候主要在卵巢中实现功能，可能直接作用于卵泡的发育和闭锁。但其在卵巢中具体的功能和调节机制还需进一步研究。

4 结 论

KiSS-1基因在小尾寒羊卵泡期下丘脑和松果体的表达量均显著高于黄体期，提示其可能在小尾寒羊黄体期到卵泡期发情状态转换中起促进作用。RFRP-3基因在黄体期下丘脑表达量高于卵泡期，说明其可能在小尾寒羊发情状态转换中起抑制作用。RFRP-3基因在不同时期卵巢差异表达的研究结果暗示，RFRP-3基因在调控发情的时候主要在卵巢中实现功能，可能直接作用于卵泡的发育和闭锁。本试验结果为深入研究KiSS-1和RFRP-3基因在绵羊季节性发情方面的作用奠定了基础。