西藏牦牛源肠出血性大肠杆菌毒力基因检测与进化分析

赵燕娟 王 刚 索朗斯珠

(西藏农牧学院 动物科学学院， 西藏 林芝 860000)

肠出血性大肠杆菌(EnterohemorrhagicEscherichiacoli, EHEC)是重要的食源性致病菌，人和动物都可成为其传染源。肠出血性大肠杆菌不仅能引起严重的胃肠道疾病[1]，感染严重时还可致命。肠出血性大肠杆菌病自1982年于美国首次发现以来，先后在英国、加拿大、瑞典等国家暴发和流行。我国首次于1986年在江苏省发现该病，随后蔓延到中部和东部地区[2]。肠出血大肠杆菌菌株的毒力特点有以下几点：一方面是可产生毒力较强的志贺毒素(Vero毒素)；另一方面是产生亲和素从而粘附到宿主细胞上，此外还可产生溶血素[3-5]。肠出血大肠杆菌菌株毒力特点是由多因子决定的，如：志贺毒素由Stx1基因和Stx2基因编码[5]；eaeA基因编码的外膜蛋白能产生亲和素；ehxA基因编码的溶血素等同样也是重要的毒力因素[6]。因此，通过PCR技术对样品进行毒力相关基因的检测不仅能作为该病特征性鉴定的一种手段，还可以对由这些基因编码导致的潜在致病性作出预测。

大肠杆菌O157∶H7是目前最常见的肠出血性大肠杆菌代表菌株[7]。该菌株除引起腹泻、出血性肠炎外，还可导致严重的溶血性尿毒症[2]。此外，还有O5、O26、O91、O111和O113等血清型，这些血清型菌株对公众健康造成的危害也不容忽视[3]。目前我国部分地区已经加强了对EHEC O157∶H7的监测，但是其他血清型病原菌的分离鉴定及其流行病学调查方面的研究还没有完整系统展开[8]。

已有研究表明EHEC主要的自然宿主是反刍动物，因此牛被认为是人感染EHEC的主要来源[9]。尽管很多国家都有关于EHEC在牛群中流行的报道[10-11]，然而在牦牛上还未见报道，本研究前期已做了有关西藏地区牦牛大肠杆菌毒力基因的检测[12]，本试验拟通过从西藏7个不同地区采集的牦牛腹泻粪便以及肠粘膜中分离肠出血性大肠杆菌菌株，后对这些分离菌株进行肠出血性大肠杆菌的相关毒力基因检测、分型和致病性试验等鉴定，旨在了解在西藏地区牦牛源肠出血性大肠杆菌的毒力和毒力基因分型情况，以期为研究西藏牦牛肠出血性大肠杆菌病的致病机理和防控技术提供依据。

1 材料与方法

1.1 细菌分布及分离培养

本试验牦牛源大肠杆菌菌株分别分离自西藏拉萨、林芝、阿里、那曲、日喀则、山南、昌都等7 市地区散养牦牛的腹泻粪便和病死牦牛的肠粘膜。细菌的分离培养方法见参考文献[13-14]。

1.2 生化试验

取本试验分离鉴定后的纯培养物分别进行糖发酵试验、 M-R、V-P、柠檬酸盐利用试验、硝酸盐还原试验等常规生化试验，并观察反应结果。

1.3 血清型试验

将本试验纯培养物分别接种于普通琼脂斜面培养基中，24 h后用0.5%石碳酸生理盐水清洗，随后于高压灭菌锅中高压2 h制成抗原。按中国兽医药品监察所提供的血清型鉴定说明书，先后进行平板凝集反应、试管凝集反应，最后鉴定出血清型。

1.4 试剂

Taq DNA聚合酶、PCR试剂、核酸染料Gel View 、克隆载体PMD18-T 购自TaKaRa公司；感受态细胞Trans5α由TaKaRa公司制作并保存；胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒由美国OMEGA Bio-tek公司生产；麦康凯培养基、琼脂糖、LB培养基均由北京陆桥公司生产。

1.5 仪器

高速离心机centrifuge5804由德国Eppendorf生产；PCR仪my cycleTM、电泳仪、凝胶成像系统均由美国Bio-Rad生产；移液器由德国Eppendorf生产；核酸蛋白测定仪由美国赛默飞世尔Thermo公司生产。

1.6 引物设计

从GenBank中检索已登录的肠出血性大肠杆菌毒力基因序列(Stx1、Stx2、eae、ehxA、saa、o157)及16SrRNA基因序列(P)信息，用DNA Star软件找出保守序列，然后采用Primer 5设计引物[15-16](表1)，由上海生物工程有限公司合成。

1.7 PCR检测

反应体系及反应条件参照参考文献[17]，反应结束后，取6 μL PCR产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳检测。

1.8 扩增产物的克隆测序

将扩增的目的片段进行纯化，纯化后在核酸蛋白测定仪上测定浓度，取胶回收纯化的DNA 4.5 μL，PMD18-T载体0.5 μL，Solution 5.0 μL，加水到10.0 μL的体系进行，按照试剂盒说明将连接片段转化到感受态细胞中，转化后挑取单个菌落接种在保存用平板上，并对单菌落做PCR检测。验证正确的即为阳性克隆，挑取验证正确的单菌落接种于LB细菌瓶中过夜培养，吸取足量阳性的克隆菌液送金斯瑞生物公司进行测序[12]。

表1 肠出血性大肠杆菌毒力基因及16S rRNA基因序列PCR扩增及测序所用引物Table 1 Primers used for the EHEC gene and 16S rRNA gene PCR amplification and sequencing

2 结果与分析

2.1 细菌的地理位置分布与培养结果

本试验分离菌株在麦康凯培养基上生长形态为中等大小、表面光滑、边缘整齐的红色菌落，在伊红美蓝培养基上生长为深紫黑色、光滑、湿润、带有金属光泽的圆形菌落，染色镜检结果为革兰氏阴性、短杆状、两端略圆[12]。经细菌分离培养、生化鉴定获得西藏牦牛源大肠杆菌149株，其中，西藏阿里地区13株、西藏那曲地区12株、西藏日喀则地区13株、西藏山南地区20株、西藏拉萨地区18株、西藏林芝地区77株、西藏昌都地区1株(图1)。

图1 149株大肠杆菌的地理位置分布及菌株数Fig.1 Geographical location distribution of the 149 strains of Escherichia coli

2.2 生化鉴定结果

149株分离菌经15项生化试验，结果见表2，由表可知本试验分离菌株的生化特性基本保持一致。

表2 生化试验结果Table 2 Results of biochemical test

2.3 血清学试验结果

被检测的149株大肠杆菌中O98、O8、O178、O104、O26等13 种血清型均有检出，其中O78、O148、O98、O8、O115和O178 检出率最高，分别占定型菌株的31.54%、7.38%、2.68%、2.01%、8.05%、 2.68%，共占定型菌株的54.34%，可见优势血清型为O78、O148、O98、O8、O115和O178(表3)。

2.4 肠出血性大肠杆菌的毒力分型鉴定

对149株牦牛源大肠杆菌进行6 对毒力基因检测，只有14株检出ehxA基因，检出的毒力基因菌株的分布情况为林芝市2株、日喀则市3株、昌都市1株、阿里地区8株；拉萨市、山南市和那曲地区未检出，检出率为9.40%，部分基因检测结果见图2。

2.5 16S rRNA基因克隆的鉴定

PCR产物连接、转化后获得阳性重组质粒，经相应的酶切，切出的各基因片段大小与目的基因片段和线性pMD18-T载体大小相符，部分菌株的16SrRNA基因序列阳性结果见图3。

表3 血清型鉴定结果Table 3 Results of serotype identification

M，DNA标记DL 2 000；1～14 ehxA基因；N，阴性对照M, DNA Marker DL 2 000; 1～14 ehxA gene; N, negative control图2 ehxA基因电泳图Fig.2 Electrophoresis map for PCR products of ehxA gene

M，DNA标记DL 2 000；1～6 16S rRNA重组质粒基因M, DNA Marker DL 2 000; 1～6 16S rRNA recombinant plasmid gene图3 16S rRNA基因重组质粒鉴定的电泳图Fig.3 Electrophoresis map for PCR products of 16S rRNA gene

2.6 肠出血性大肠杆菌16S rRNA基因序列的同源性分析

对14株牦牛源大肠杆菌分离株的16SrRNA基因片段进行克隆测序分析，发现PCR扩增片段长度约为1 500 bp，与GenBank中登录的16SrRNA基因序列大小一致。本次分离的牦牛源大肠杆菌16S rRNA核苷酸组内同源性为99%～100%，与GenBank中人源、牛源、禽源、猪源、羊源的部分菌株序列的同源性为99%～100%。采用邻接法设置bootstrap值1 000进行构建进化树[12]，所有菌株形成2个主要分支，本次分离的其中13株西藏牦牛源大肠杆菌与人源、牛源、猪源、禽源大肠杆菌形成一个大的分支；Pch1单独聚为1个分支而且可以看出其与GenBank登录的J01859.1和M2499.6同源性最近。系统发育树图片见图4。

2.7 肠出血性大肠杆菌毒力基因的同源性分析

通过系统发育分析发现牦牛源肠出血性大肠杆菌菌株内同源性达到99.9%左右，与GenBank中所录其他菌株的同源性达到99%。采用邻接法设置bootstrap值1 000进行构建进化树[12,18-19]，并与GenBank已登录的EHEC基因序列做了同源性比对并进行了系统发育分 析，所有菌株形成2个主要分支，本次分离的149株西藏牦牛源大肠杆菌属于ehxA类型的达到14株，与现有的2 893个ST序列相比，其中D1、D2、D4、D5、Dbo、Dch1、DR6与GenBank登录的EF204922和AF043471同源性最近，Dguo、D3、D6、DR1、DR2与GenBank登录的CP024291和km880130.1同源性最近。系统发育树见图5。

标尺表示遗传距离，标尺上的0.2指每个位点有0.2个氨基酸替换。The scale indicates genetic distance. Number 0.2 represents 0.2 aa substitutions per site.图4 16S rRNA基因序列进化树图状Fig.4 Phylogenetic tree graph of 16S rRNA gene sequence

标尺表示遗传距离，标尺上的0.5指每个位点有0.5个氨基酸替换。The scale indicates genetic distance. Number 0.5 represents 0.5 aa substitutions per site.图5 EHEC Gene基因序列进化树图状Fig.5 Phylogenetic tree graph of EHEC gene sequence

3 讨论与结论

从西藏7个不同地市分离到的149株菌株，根据它们的分离培养特性、染色镜检特征及生化反应特点显示都符合大肠埃希氏菌的基本特征，再结合16SrRNA基因序列鉴定及系统发育分析结果，也能说明149株菌株符合大肠埃希氏菌的特征，故可判断其为大肠杆菌。

大肠杆菌有很多种血清型，目前国内外已发现的血清型主要是O1、O2、O8、O35、O78、O86等[20-23]。本试验所分离菌株中 O98、O8、O178、O104等13 种血清型均被检出，其中 O78、O148、O98、O8、O115和 O178 检出率最高，分别占定型菌株的31.54%、7.38%、 2.68%、2.01%、8.05%、2.68%，共占定型菌株的 54.34%，可见优势血清型为O78、O148、O98、O8、O115和O178；O104、O142、O117、O86和O137、O158、O26均有检出。从中不难看出西藏不同地区其优势血清型存在差异，这与其他报道一致[22]。

利用6 对肠出血性大肠杆菌毒力基因引物进行PCR检测，检出ehxA基因，共检出1株含有ehxA基因的大肠杆菌，其在西藏的分布情况为：ehxA基因林芝市2株、阿里8株、日喀则3株、昌都1株；拉萨、那曲、山南未检出。因本次试验设计的引物是肠出血性大肠杆菌特异性引物，说明西藏林芝市、阿里地区、日喀则市、昌都市这4个地市的牦牛源大肠杆菌中存在EHEC，由于该病危害性较大，有感染养殖人员的可能性[24]，应引起当地的关注和重视，需制定合理的防控措施进行预防本病的发生，特别是阿里地区养殖户要对本病做好防范。本团队也会密切关注该病在当地的流行情况，给予长时间的监测，以掌握其流行规律，为当地养殖业的发展提供科学依据。

利用MEGA4.0软件对14株EHEC进行遗传进化分析，本次分离的14株EH.EC中D1、D2、D4、D5、Dbo、Dch1、DR6与GenBank已登录的肠出血性大肠杆菌菌株EF204922(O98∶H-)和AF043471(O8∶H19)同源性最近，Dguo、D3、D6、DR1、DR2与GeneBank登录的CP024291(O178∶H19)和km880130.1(O104∶H21)同源性最近。这说明此次分离的菌株大多数与国际流行的EHEC血清型O98∶H-、O8∶H19亲缘关系较近。其次是以O178∶H19、O104∶H21 2种血清型处在另一个分支上。

大肠杆菌O157∶H7是重要的肠出血性大肠杆菌代表菌株，通过本次血清型结果可以看出此经典血清型菌株在本试验中未曾检出，说明所分菌株均不是O157∶H7血清型菌株，本次试验中检出的O98 、O8、O178、O104、O26、O137、O142、O115、O117、O158、O148、O86、O78血清型菌株对西藏地区牦牛有一定的致病性，与报道对人致病的主要血清型中只有O104存在交叉，说明这种血清型的菌株对人及牦牛都有致病性，应引起重视。目前对该病的治疗尚无有效办法，最好的防控措施就是加强对该病的监测，防止宿主的感染[16]。