山羊睾丸支持细胞分离培养及其氧化应激效果研究

王菊花 刘丹丹 刘 琦 王佳明 董 静 周 杰 薛秀恒

(1.安徽农业大学 动物科技学院，合肥 230036； 2.安徽农业大学 茶与食品科技学院，合肥 230036)

睾丸支持细胞(Sertoli cells，SC)不仅为生精细胞的成长提供不可缺少的营养因子和激素[1]，也是血睾屏障的重要组成部分，进而为精子的发育和成熟提供免疫豁免的功能微环境[2]。SC被广泛应用于组织工程、器官移植及促进共移植细胞生长等临床方面的研究[3-5]，在用于这些研究时，需对SC进行体外培养增殖。而体外细胞培养是一个静态过程，各种化学反应常会产生大量的活性氧(ROS)[6]。在培养液中ROS的过量聚集会导致细胞受到氧化应激的影响，从而造成DNA链断裂、蛋白质损伤及细胞死亡[7]。因此，体外培养SC时，也会面临同样的问题。

ROS是由一系列氧气来源的不同结构的小分子自由基组成，其中一些羟自由基非常不稳定，而其中过氧化氢(H2O2)性质相对稳定，容易获得，且能够自由扩散[8]，已有研究利用H2O2对多种细胞建立了氧化应激模型，并对其进行抗氧化相关研究[9,10]，H2O2已成为国内外研究氧化应激的重要诱导剂[11]。但目前国内外关于SC在体外培养时的氧化应激状态及其抗氧化性能的研究报道很少。因此，为了探究体外培养SC时的氧化应激效果，本研究拟首先体外分离纯化和培养山羊睾丸支持细胞(GSCs)，并对其进行鉴定，再用不同浓度H2O2处理GSCs，使细胞处于不同的氧化应激状态，研究GSC氧化应激模型建立的优化条件，以期为体外长期培养GSCs并维持其稳定增殖奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验动物

山羊睾丸组织取自健康状况良好且繁殖性能正常的2 只40 日龄雄性波尔山羊，山羊饲养于安徽博大羊场。

1.2 试剂

DMEM高糖液体培养基、胎牛血清(FBS)购自Hyclone公司；0.25% 胰酶-EDTA、DPBS溶液购自Gibco公司；DMSO、MTT购自Biosharp公司；H2O2、青霉素、链霉素、20 mmol/L Tris-HCl溶液购自Sigma公司；秋水仙素购自北京索莱宝科技有限公司；兔抗-GATA4抗体、山羊抗兔IgG-R购自购自Santa Cruz (USA)。

支持细胞培养液：DMEM培养液+10% FBS+1% 双抗(100 IU/mL青霉素+100 mg/mL链霉素)+0.1%β-巯基乙醇。

1%的油红O染液：油红0.1 g，60% 异丙醇 100 mL，将溶液加热至60 ℃，持续5 min并搅拌，趁热过滤，待冷却后再过滤一次，保存于4 ℃冰箱待用。

1.3 GSC的分离培养

参考于磊等[12]的方法并稍作调整，术部用75%酒精消毒后切开山羊阴囊，摘除睾丸置于预温的含5%双抗的DPBS溶液中，运回试验室后，用含5%双抗DPBS溶液冲洗5遍，去除白膜后暴露生精小管，将生精小管剪成约1 mm3大小的碎块，加入0.25% 胰蛋白酶37 ℃消化15 min，用支持细胞培养液终止消化，800 r/min离心3 min去除间质细胞及胰蛋白酶，再加入37 ℃预热的2 mg/mL胶原酶Ⅳ和25 μg/mL的 DNaseⅠ于37 ℃水浴中震荡消化30 min，用支持细胞培养液终止消化，200目网过滤，1 200 r/min离心3 min，弃上清，加入支持细胞培养液调整细胞浓度为5×106个/L后于培养皿中，置37 ℃、5%的CO2饱和湿度的培养箱中培养24 h后，吸去培养液中悬浮的死细胞和生殖细胞，再加入20 mmol/L Tris-HCl处理2.5 min，吸去残余的生殖细胞，加入培养液继续培养，每隔一天全量更换培养液，显微镜观察其生长状态[13]。

1.4 GSC活性检测(MTT法)

将纯化后GSCs调整细胞密度为1.0×105个/mL，接种于96孔板中，用MTT法检测培养第1～8天共8组细胞活性，每组6个重复，各组细胞每24 h半量换液，以确定GSCs活性最强的时间点。

在氧化应激试验中，取GSCs活性最强的时间点的细胞，制成细胞悬液，以同样浓度接种于96孔板中，试验分为6组，分别加入不同浓度的H2O2(0、50、100、200、500、1 000 μmol/L)，0 μmol/L组不加H2O2，用等量的支持细胞培养液代替，每组6个 重复，边缘孔用无菌DPBS填充。将接种好的96孔板放入CO2培养箱中培养，培养至细胞达 80%～90% 融合度时，用MTT法检测GSCs活性。

1.5 GSC流式细胞鉴定

将GSCs培养至第5天达到 80%～90% 融合时，用0.25% 胰酶消化后，支持细胞培养液阻止消化，1 200 r/min 室温离心3 min 后弃上清后，加入4% 的多聚甲醛(PFA)固定15 min。冷DPBS冲洗细胞2遍，每次5 min；用0.1% Triton-X 100 DPBS通透细胞膜30 min，用冷的DPBS冲洗2次，每次5 min ，再用1% BSA的DPBS 阻断特异性抗原30 min；处理后的细胞加入一抗兔抗羊-GATA4抗体(1∶200)，在4 ℃孵育过夜后，用DPBS冲洗2次，每次5 min，避光滴加1% BSA的DPBS稀释的二抗羊抗兔IgG-R(1∶200)，室温下避光孵育1 h。用DPBS冲洗2次，每次5 min，将细胞密度调至1× 106个/mL，将悬液转移至流式上样管中，每个样品3个重复，同时以IgG荧光标记处理的细胞为阴性对照，4 ℃避光保存，48 h 内上机检测。

1.6 GSC油红O染色鉴定

取生长至第5天的GSCs，用0.25% 的胰蛋白酶消化后制成1×105个/mL的细胞悬液，种植于24孔 培养皿中，置37 ℃、5% CO2培养箱中培养。当细胞生长至 70% 融合时，用DPBS冲洗细胞3次， 每次5 min，加入4% PFA固定1 min，油红O染色液染色10 min，蒸馏水冲洗3次，每次1 min，流水冲洗，显微镜下观察。

1.7 GSC氧化应激水平的测定

将生长至第5天的GSCs，分为6组，每组6个重复，分别加入不同浓度的H2O2(0、50、100、200、500、1 000 μmol/L)后，置于培养箱处理4 h后，分别采用试剂盒检测脂质过氧化产物丙二醛的含量和超氧化物歧化酶的活性，实验步骤按照说明书进行。

1.8 不同浓度H2O2处理后GSC的DNA倍体检测

将生长至第5天的GSCs，分别加入不同浓度的H2O2(0、50、100、200、500、1 000 μmol/L)置于CO2培养箱中处理4 h 后，0.25% 胰酶消化细胞成单细胞悬液，收集GSCs至离心管中，调整细胞总数在5×105～1×106之间，1 000 r/min离心5 min，弃上清后加入1 mL DPBS将细胞吹打均匀后，转移至流式上样管中，离心后弃上清。按照细胞周期分析试剂盒步骤处理细胞，通过流式细胞仪记录488 nm激发波长处的红色荧光，软件Modfit分析计算出G0/G1，每个样本重复3次。DNA指数(DI)=(样本G0/G1期细胞峰的平均荧光道数)/(对照组G0/G1期细胞峰的平均荧光道数)；异倍体判定标准：DI> 1.1或DI<0.9表明出现明显的异倍体峰[14]。

1.9 统计分析

数据分别采用SPSS17.0软件的One-way ANOVA方法进行均值差异显著性分析，用“平均数±标准差”表示。若P值小于0.05，则表示差异水平显著。

2 试验结果

2.1 山羊支持细胞的形态学观察

GSCs原代培养24 h后，细胞贴壁，用Tris-HC1处理之后，细胞形状呈多角状且仍存在小而圆的生精细胞(图1(a))。培养48 h后，大部分生精细胞随着培养液的更换被去除，且睾丸支持细胞有多个突起，细胞形态不规则(图1(b))。培养96 h 后，以单层细胞形态逐渐铺满平皿，细胞相互交织在一起，生长状态良好(图1(c))。

(a) 培养24 h；(b) 培养48 h； (c) 培养96 h。(a) 24 h after culture; (b) 48 h after culture; (c) 96 h after culture.图1 山羊睾丸支持细胞的原代培养 (标尺= 100 μm)Fig.1 Primary culture of GSCs (Scale bar=100 μm)

2.2 MTT法检测培养GSC的活性

MTT法检测支持细胞活性的结果如图2所示，在培养1～5 d时，山羊支持细胞随着培养时间的延长而活性增强，至第5天时细胞活性最强；至6～8 d 时，细胞活性随培养时间延长而活性逐渐下降。所以，培养至第5天时，GSCs可用于后面试验中的各项检测。

2.3 GSC流式细胞鉴定

将培养至第5天，GSC通过特异性抗GATA4标记后，通过流式细胞分析见图3，GATA4阳性细胞可达88.27±3.29%。支持细胞纯度较高，达到后续试验的要求。

图2 不同培养时间山羊睾丸支持细胞的活性Fig.2 GSC activity in different times of culture

M1，阴性细胞百分比；M2，阳性细胞百分比。M1,percentage of negative cells; M2, percentage of positive cells.图3 山羊睾丸支持细胞流式细胞鉴定Fig.3 GSCs assay by flow cytometry

2.4 GSC的油红O染色鉴定

油红O染色后，在显微镜下观察到多数细胞内均含有红色的脂滴，悬浮状聚集或存在于睾丸支持细胞胞质的两极或散布于核的四周(图4)，由此表明培养的细胞多数为支持细胞，可以用于后续试验研究。

2.5 培养液中添加不同浓度的H2O2对GSC细胞存活率及MDA含量和SOD活性的影响

将支持细胞培养至第5天时，用不同浓度的H2O2处理细胞4 h，用MTT法检测细胞的存活率如图5(a) 所示，分别为99.19±0.35%、98.43±0.88%、 94.89±3.61%、67.5±6.18%、27.12±2.90% 和24.04±5.13%。当H2O2浓度分别为200、500、1 000 μmol/L时，细胞存活率明显降低，与对照组相比差异均显著(P<0.05)， 且在H2O2浓度为200 μmol/L时，细胞存活率开始出现最明显的降低；添加50 μmol/L和100 μmol/L H2O2后，细胞活度与对照组相比均没有显著性差异(P>0.05)。不同浓度的H2O2处理GSCs 4 h后，检测各组GSC的MDA含量如图5(b) 所示，当细胞分别用100、200、500、1 000 μmol/L H2O2浓度处理时，MDA含量分别与对照组相比，均具有显著性差异(P<0.05)；50 μmol/L H2O2处理时，MDA含量与对照组没有显著性差异(P>0.05)。SOD活性检测结果如图5(c) 所示，培养液中添加100、200、500、1 000 μmol/L的H2O2作用4 h后，SOD活性均与对照组有显著性差异(P<0.05)， 且在添加100 μmol/L 的H2O2后，开始对细胞造成损伤，随着添加的H2O2浓度增加，对细胞的损伤程度也增加。

(a) 放大20×; (b) 放大 40×。(a) 20× magnification; (b) 40× magnification.图4 山羊睾丸支持细胞油红O染色Fig.4 GSCs assay by Oil Red O staining

* 表示与对照组相比较差异显著(P < 0.05)。* indicates significant differences compared with the control (P < 0.05).图5 不同浓度H2O2对GSC存活率、MDA含量和SOD活性的影响Fig.5 Effect of various concentrations of H2O2 on the viability, content of MDA and SOD activity of GSCs

2.6 不同浓度的H2O2对GSC DNA倍体的影响

不同浓度的H2O2处理GSCs 4 h后，采用流式细胞仪检测GSC的细胞周期，结果表明： 当培养液中添加50 μmol/L H2O2时，细胞DI为1.08±0.01，介于0.9与1.1之间，未出现异倍体；当H2O2浓度分别为100、200、500、1 000 μmol/L时，细胞DI分别为1.15±0.02、1.20±0.03、1.26±0.03、1.32± 0.01，均>1.1，细胞均有异倍体产生。说明培养液中添加100 μmol/L的H2O2作用4 h后，开始对细胞倍体产生了影响，之后随着添加的H2O2浓度增加，对细胞倍体变化的影响程度也增加(表1)。

表1 不同浓度H2O2处理后的GSC的DNA指数Table 1 DNA index of GSC treated with H2O2 at different concentrations

3 讨 论

3.1 GSCs分离纯化

睾丸支持细胞的分离纯化培养效果会影响到后续试验和临床应用效果，所以已有的研究一般采用不同方法对支持细胞进行分离、纯化和培养。邱志群等[13]选用未成年大鼠，利用胰蛋白酶和胶原酶2步酶消化法，结合低速离心分离支持细胞，培养48 h 后，用低渗处理培养细胞去除生殖细胞，处理后的支持细胞纯度达95%；也有研究者采用1步消化法分离支持细胞进行培养后，再用Tris-HCl处理细胞，分离纯化的大鼠支持细胞纯度达到90% 以上[15]；用联酶消化新生牛睾丸再低速离心后去除睾丸间质细胞，然后通过差异贴壁将生殖细胞和支持细胞分开，得到的支持细胞纯度约为90%[12]。王帅等[16]分离培养和鉴定了新生和田羊睾丸支持细胞，也取得好的效果。在本研究中选用未成年山羊睾丸作为分离支持细胞的供体材料，是由于这时期动物处于性成熟前，生精细胞处于相对静止期，而支持细胞在卵泡刺激素的作用下已基本发育成熟，与成年动物睾丸组织相比较，结构更为简单，有利于支持细胞的分离与培养增殖[13,17]。为了纯化支持细胞，利用支持细胞的体积大，易下沉的特点，先用酶初步消化睾丸组织块，分离间质细胞后，采用低速离心去除悬浮间质细胞，再用第2步酶消化生精小管成细胞悬液，悬液中多数为支持细胞和生精细胞，将混合细胞培养后，再通过低渗处理而消除生精细胞，可提高支持细胞纯度[13]，所以本研究参考已有研究结果，采用2步酶消化后，再利用Tris-HCl低渗处理进一步去除生殖细胞，达到纯化GSCs目的。通过流式细胞分析发现纯化率达到88.27%，纯度较高，该方法可用于后续研究。

3.2 GSCs鉴定

油红O染色具有简单快速易分辨的优点，可以定性鉴定支持细胞。在本研究中睾丸支持细胞经油红O 染色后，胞质中散在有大小不一的脂质红褐色颗粒。通过此方法鉴定含有红褐色空泡结构的细胞均为睾丸支持细胞。这与前面研究结果一致[13,18]。为了进一步鉴定支持细胞纯度，本研究通过流式细胞定量分析鉴定支持细胞数量。GATA-4属于转录因子家族，是睾丸支持细胞的特异表达标志物，但在生精细胞上不表达[19]。已有研究发现，公猪、绵羊、出生后小鼠和初情期前公牛睾丸的支持细胞均有GATA-4表达，因此，可通过GATA-4免疫检测来鉴定支持细胞[20]。本研究以GATA-4作为山羊睾丸支持细胞标记物，检测到支持细胞纯度达到88.27%，由此推断支持细胞中仍混有间质细胞或管周细胞等。

3.3 GSCs氧化应激模型建立

细胞在氧化应激状态下，SOD的活性降低，导致脂质过氧化物裂解，从而使MDA的含量增加，MDA可损伤细胞内的蛋白质结构，诱导细胞发生凋亡[21]。本研究中，随着培养液中H2O2浓度的增加，GSCs的存活率和SOD活性逐渐降低、MDA含量逐渐增加、染色体损伤和异倍体逐渐明显，表明GSCs的氧化应激损伤程度增加。当H2O2的浓度为100 μmol/L时，GSCs的存活率>70%。当使用较高浓度的H2O2(500、1 000 μmol/L)处理细胞后，测得的GSCs的存活率均低于50%，大量GSCs死亡。而在200 μmol/L H2O2浓度处理GSCs后，细胞内SOD活性显著降低，MDA含量显著增加，并出现了明显的异倍体，说明细胞发生了一定程度的氧化损伤，同时，GSC的存活率为68%。常小洁等[9]利用250 μmol/L H2O2成功构建了人胎盘滋养细胞的氧化应激模型；也有研究利用100 μmol/L H2O2处理心肌细胞，成功构建了的氧化应激模型[22]；Erdei等[10]利用150 μmol/L H2O2成功构建了干细胞的氧化应激模型。这些模型中，H2O2的浓度差异可能和试验条件、培养基成分有关，也与不同类型细胞对H2O2敏感度不同等有关。本研究中得出，200 μmol/L H2O2浓度是后期建立GSCs氧化应激模型的最适H2O2浓度。

4 结 论

本试验通过2步酶消化法分离GSCs，并对其进行纯化和培养；进而利用不同浓度的H2O2处理GSCs后，研究H2O2对GSCs产生的氧化应激效果，200 μmol/L H2O2浓度处理GSCs可以达到较好的应激效果，为后期建立GSCs氧化应激模型提供理论依据。