鲜食甜玉米南方锈病抗性QTL定位分析

张金钰 蒲浩杰 刘鹏飞 陈青春 张姿丽 蒋 锋*

(1.仲恺农业工程学院 农业与生物学院，广州 510225;2.广东省云浮市 云城区农业农村和水务局，广东 云浮 527300)

玉米南方锈病(Southern corn rust)是一种气传病害，主要侵染玉米的叶片，影响产量[1]。南方锈病在我国多个玉米产区发生，上升为主要病害,并且南方锈病的发生有自南向北的趋势[2]。南方锈病爆发，轻则减产20%，严重时减产可达80%及以上，甚至绝收[3]。玉米南方锈病在高温高湿条件下病原菌以夏孢子传播。降雨是病害发生的重要影响因素，有利于病菌夏孢子萌发侵入和传播[4]；施肥的不合理，偏施、多施氮肥现象严重，有机肥施用量不足，加重了玉米南方锈病的发生[5]；此外，单一品种连续种植也是南方锈病爆发的主要因素之一[6]。改善田间排水、合理施肥、恰当的耕作制度可降低玉米南方锈病的危害。应用玉米抗南方锈病基因资源，选育抗病品种是南方锈病防治最为直接经济有效的方法。

已报道的抗南方锈病的基因多定位于玉米10号染色体上。Jines 等[7]定位了1 个抗南方锈病的 QTL，位于10号染色体上，在 SSR 引物 umc1380和 bnlg1451之间，能够解释83%的表型变异，是一个主效 QTL。Kitti等[8]定位了15 个 QTL，其中1 个位于1号染色体的主效QTL，能够解释41.8%的表型变异。王兵伟等[9]用自交系 S313 的玉米南方锈病抗性由主效单基因控制，其抗性表达强，受环境影响小，检测到的主效基因位于玉米10号染色体短臂约0.47 M 的区间内，区间包括了3 个与植物抗病性相关的候选基因。Chen等[10]将自交系齐319所携带的抗南方锈病单显性基因RppQ定位在 SSR 标记phi041和 AFLP 标记AF1之间，与这2 个标记的遗传距离分别为2.45和3.34 cM；刘章雄等[11]将材料 P25中抗病主效基因定位于10号染色体距离标记phi059相距5.8 cM 的地方。Zhang等[12]从自交系W2D中鉴定到与另外2 个抗病基因RppQ与RppP25之间紧密连锁的又一抗病单基因RppD，将其定位于10号染色体 bin10.01区域。

目前育种所用亲本材料普遍缺乏对南方锈病的抗性，为培育好的抗南方锈病材料，本研究以2个鲜食甜玉米自交系的杂交组合M5×M114的216个F2代单株作为试验材料，应用 BSA 群体分离分析法(Bulked segregant analysis)，结合自然发病分析F2家系对南方锈病的抗性表现，用复合区间作图法检测 QTLs，对玉米南方锈病抗性基因进行定位，以期为抗南方锈病的精细定位、主效基因克隆和抗南方锈病鲜食甜玉米品种选育提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

供试亲本材料为广东省鲜食玉米遗传育种工程技术研究中心提供的鲜食甜玉米自交系M5和M114。经多年田间试验鉴定，2个亲本对南方锈病的抗性差异显著(M5病斑面积比为6.85%±0.02%，M114病斑面积比28.22%±0.76%)。

田间试验在仲恺农业工程学院钟村教学农场进行。2014年秋以M5为母本、M114为父本杂交，得到F1代种子；2015年春，种植F1代及其亲本， F1代严格自交获得F2代种子；2015年秋，种植 F2群体及其亲本和F1代，播种3周后取新鲜叶片提取F2和两亲本基因组DNA。自然发病条件下，于乳熟期采收F2单株穗三叶，获得各F2单株抗病表型值。

1.2 方法

1.2.1抗病表型数据获取

自然发病下，于乳熟期采收各F2单株的穗三叶，用扫描仪进行扫描和图像采集。本研究参考陈趣[13]结合图像处理玉米小斑病的方法，将玉米叶片扫描之后，使用计算机图像处理软件Photoshop CS5进行病斑识别和病斑面积分割，分别得出叶片和病斑的像素值。以穗三叶病斑面积比作为衡量玉米植株对南方锈病的抗病指标，公式如下：

穗三叶病斑面积比=(穗上叶病斑像素+穗位叶病斑像素+穗下叶病斑像素)/穗三叶像素之和×100%

1.2.2DNA分子标记分析

采用CTAB法[14]提取鲜食甜玉米亲本和F2群体DNA。应用 BSA方法，分别挑选10株极端抗病F2单株和极端感病F2单株，找到与之对应的F2DNA，混合组成抗感DNA池。根据赵茂俊等[15]、Wang等[16]、于永涛等[17]、刘宗华等[18]和李永祥等[19]已发表过的玉米连锁遗传图谱设计引物，选用分布于玉米10个连锁群上的500对SSR引物对抗感DNA池进行多态性筛选，在多态引物所在4号和9号染色体上分别重新设计50对SSR引物，构建遗传连锁图谱。

SSR 引物序列来源于Maize GDB，由北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司合成。PCR体系、PAGE凝胶电泳和银染程序按照郭海林等[20]和武玉清等[21]的方法，最后进行银染带型统计。

1.2.3遗传连锁图谱构建和 QTL定位分析

用JoinMap 3.0软件对216个F2单株进行分子标记的连锁关系分析，构建分子遗传图谱。采用WinQTLCart2.0结合复合区间作图法(Composite interval mapping)检测玉米南方锈病抗性QTLs[22]。1 000次抽样模拟测试数据结果确定LOD阈值。QTL命名方法参照McCouch等[23]的方法，按照q+性状英文缩写+染色体编号+QTLs个数。

2 结果与分析

2.1 群体的抗南方锈病性状表现

通过Photoshop CS5软件进行叶片病斑识别和病斑面积分割，分别得出叶片和病斑的像素值(图1)。再结合在对F2家系进行抗性鉴定，得到穗三叶病斑面积比的统计数据(图2)。从统计参数来看，F2家系中病斑面积比的变幅为3.3～38.8，平均值为14.29，标准差为6.64，变异系数为46.43%,可见变异系数变异都比较大，因此，可以对这个性状进行QTL定位和分析。

(a) 识别前；(b) 识别后

图2 F2代穗三叶病斑面积比在F2群体中的分布情况

2.2 SSR 标记连锁图谱的构建

以鲜食甜玉米自交系组合M5(抗)×M114(感)的216个F2单株为遗传作图群体，应用BSA群体分离分析的方法，从均匀分布在鲜食甜玉米基因组的500对SSR引物的筛取选择出来2对在F2群体有抗病和感病的DNA池间多态的引物，分别定位到了4号和9号连锁群上。后在4号和9号连锁群上分别重新设计50对SSR引物，而后构建了有33个标记位点的遗传连锁图谱在这2条连锁群上，连锁图谱总长是241.2 cM，平均遗传距离是7.53 cM(表1，图3)。

表1 F2群体2个连锁群标记数目和长度

图3 SSR遗传连锁遗传图谱及玉米南方锈病抗性QTL的分布

2.3 QTLs定位分析

对F2代的家系抗南方锈病性状与结合分子标记连锁图信息，进行1 000次抽样确定LOD值阀值，采用复合区间作图法，结果显示：鲜食甜玉米抗南方锈病的抗性QTL集中在染色体4号和9号2条染色体上。检测到的QTLs的LOD值分布见(表2)。

检测到7个QTLs，定位于4号和9号染色体。其中有4个QTLs(qLBC-chr4-1、qLBC-chr4-2、qLBC-chr4-3和qLBC-chr4-4)定位在4号染色体上，分别位于标记区间umc1228—umc2082、umc1759—bnlg490、nc005—umc1808和bnlg1189—umc1051，LOD值为6.17、4.08、9.39和7.96，分别解释了12.1%、7.8%、18.2%和14.9%的表型变异。在9号染色体上定位了3个QTLs分别是qLBC-chr9-1、qLBC-chr9-2和qLBC-chr9-3，所在区间分别为 bnlg127—phi028、bnlg1191—bnlg292和umc1231—bnlg128，LOD值分别为9.17、6.17和7.57，贡献率为17.0%、13.3%和19.2%。

3 讨论与结论

3.1 南方锈病病斑图像处理及抗病性数据量化

病斑识别研究多基于颜色特征、纹理特征、形状特征。徐贵力等[24]利用彩色图像纹理识别技术对番茄缺素病的识别上成功有效，并提供了所需要的重要识别参数；为识别和辨别柑橘正常叶片、油斑病叶片、黑斑病叶片，Pydipati等[25]通过研究在实验室光照环境下，基于 HIS 颜色模型的色彩共生纹理分析法，识别准确率超过95%，该试验未考虑图像亮度因素，因此对大田环境光照强度变化较大的情况下不能重复识别；马晓丹等[26]提取病健组织边界清晰的大豆病斑面积等8个形状特征参数，用以描述病害症状，但对渐变色类病害不太适用。本次试验克服了传统抗性鉴定中只能获得分级间断型数据的缺点，克服了人为判断分级的主观干扰，使用图像分析软件，联合图像背景分割、健病叶识别、像素转换等统计方法，重新设计出可以相对精确统计玉米南方锈病抗性的鉴定方法，使得抗性数据呈现连续性、精确性、客观性。

3.2 南方锈病QTL定位

目前，国内定位抗南方锈病为显性单基因，多位于10号染色体的短臂上。陈文娟等[1]以感病自交系黄早四为母本、抗病自交系W456为父本构建的F2群体，共检测到6个控制南方锈病的QTL分别位于3、7、8、9和10号染色体上，其中8号染色体上有2个位点，标记区间长度在5～19 cM，单个QTL的表型贡献率为2.61%～24.19%。艾堂顺等[27]以玉米抗病自交系P178、感病自交系G41构建的BC2F5群体为材料，在玉米2，5，6和10号染色体上共鉴定出5个抗病位点，可以解释6.88%到45.31%的表型遗传变异。本研究以鲜食甜玉米自交系组合M5(抗)×M114(感)的216个F2单株为遗传作图群体，应用BSA群体分离分析的方法，2个基因池之间理论上应该主要在目标基因区段存在差异，降低了环境及人为因素的影响，研究结果更为准确可靠。BSA法克服了很多作物研究中难以得到近等基因系的限制，比近等基因系法省时省力，是一种非常实用的基因标记定位的方法。

本研究在4和9号染色体上检测到7个显著的南方锈病抗性QTLs，在4号染色体上定位了4个相互连锁的QTLs，分别能解释表型变异中的12.1%、7.8%、18.2%和14.9%。定位了3个显著的QTLs在9号染色体，分别能够解释17%、13.3%和19.2%表型的变异。7个QTLs中有qLBC-chr4-1、qLBC-chr4-3、qLBC-chr4-4、qLBC-chr9-1、qLBC-chr9-2、qLBC-chr9-3对表型的贡献率>10%，是南方锈病主效抗性基因。同时，本次试验测得的7个QTLs的 LOD 值较高，说明其可靠性较高。本研究结果可为抗南方锈病的精细定位、主效基因克隆和抗南方锈病鲜食甜玉米品种选育提供理论依据。