超高效液相色谱-串联质谱检测桃中吡唑醚菌酯和啶酰菌胺残留和消解

刘倩宇 ，刘颖超 ，董丰收 ，徐军 ，吴小虎 ，刘新刚 ，郑永权

（1.河北农业大学，河北省植物生理与分子病理学重点实验室，河北保定 071001；2.中国农业科学院植物保护研究所，植物病虫害生物学国家重点实验室，北京 100193）

桃（Prunus persicaL.）肉质鲜美，含有丰富的维生素、矿物质和果酸，具有很高的营养价值和医疗保健作用[1]。褐腐病是一种危害桃树的世界性病害，其传播快、分布广，成熟期发病最多，严重影响桃果产量和品质[2]。吡唑醚菌酯和啶酰菌胺对桃褐腐病具有良好的防效[3-4]。实际生产中，该药剂在桃树坐果期大量应用。因此，开展关于吡唑醚菌酯和啶酰菌胺在桃果中残留行为的研究具有重要意义。

吡唑醚菌酯（pyraclostrobin）是一种甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂，通过阻止细胞色素b和C1间的电子传递，抑制线粒体呼吸作用，从而破坏病原菌能量循环进而导致细胞死亡[5]。啶酰菌胺（boscalid）是一种烟酰胺类广谱杀菌剂，通过抑制病原菌有氧呼吸三羧酸循环中琥珀酸脱氢酶活性，干扰细胞分裂和生长，从而起到杀菌作用[6]。关于吡唑醚菌酯和啶酰菌胺的残留检测方法主要有气相色谱法（GC）[7]、气相色谱-质谱法（GC-MS）[8]、高效液相色谱法（HPLC）[9]和液相色谱-质谱法（LC-MS）[10]等。前处理方法有固相萃取[11]、液液萃取[12]、分散固相萃取[8]和QuECh-ERS[10]法。其中QuEChERS前处理方法结合LC-MS，灵敏度高，重复性好。关于吡唑醚菌酯和啶酰菌胺在草莓[10]、葡萄[11]和黄瓜[13]中的残留行为已有报道，但有关吡唑醚菌酯和啶酰菌胺在桃中的检测方法及残留研究未见报道。

目前，我国规定吡唑醚菌酯在桃上的最大残留限量（MRL）为1 mg/kg，未规定啶酰菌胺在桃上的MRL[14]，欧盟规定啶酰菌胺在桃上的MRL为5 mg/kg[15]。为评价吡唑醚菌酯和啶酰菌胺在桃果上的残留及消解水平，本研究建立UPLC-MS/MS快速检测吡唑醚菌酯和啶酰菌胺在桃中的残留分析方法，并开展吡唑醚菌酯和啶酰菌胺在桃上的消解动态研究，为其安全使用提供依据。

1 材料与方法

1.1 仪器和试剂

ACQUITY UPLC-TQD超高效液相色谱-三重四极杆质谱联用仪、ACQUITYUPLC BEHC18色谱柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm），Waters公司；CK-2000高通量组织研磨仪，托摩根生物科技有限公司；TG16-WS台式高速离心机，长沙湘仪离心机有限公司；Mili-Q超纯水仪，美国Milipore公司。

吡唑醚菌酯标准品（纯度98.6%），啶酰菌胺标准品（纯度98.6%），北京勤诚亦信科技开发有限公司；乙腈（色谱纯）、甲酸，北京北化精细化学品有限公司；N-丙基乙二胺（PSA）（40 μm）、Filter Unit滤膜（0.22 μm），天津博纳艾杰尔科技有限公司；乙腈、无水硫酸镁、氯化钠（分析纯），国药集团化学试剂有限公司；38%唑醚·啶酰菌水分散粒剂，巴斯夫（中国）有限公司。

1.2 田间试验设计

参照NY/T788—2018《农作物中农药残留试验准则》[16]，于2018年4—8月分别在北京市大兴区、山西省晋中榆次区、河南省济源市以及湖南省长沙市的桃园中进行38%唑醚·啶酰菌水分散粒剂在桃树上的残留消解动态试验。设置空白对照区和消解动态区，每个小区有桃树4株，每个处理重复3次，随机排列，处理间设保护带。在桃褐腐病发病初期，按推荐最高剂量有效成分用量253.3 mg/kg，制剂用量1 500倍液兑水茎叶喷雾1次。分别于施药后7、14、21、28、35 d采集桃样品，随机取样2 kg，缩分留样200 g，匀浆后-20℃低温冷冻保存待测。

1.3 分析方法

1.3.1 检测条件

色谱条件：ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）；柱温：30℃；流动相：0.1%甲酸水溶液、乙腈，流速：0.3 mL/min；进样量：3 μL；梯度洗脱条件见表1。

表1 梯度洗脱条件

质谱条件：电喷雾离子源，正离子电离模式（ESI＋）。毛细管电压3.5 kV，离子源温度150℃，去溶剂温度500℃，去溶剂气（N2）流量650 L/h，锥孔反吹气（N2）流量50 L/h。采用多重反应监测（MRM），具体参数见表1。

表2 多重反应监测（MRM）质谱参数

1.3.2 样品前处理

称取10.0g（精确到0.01 g）均质桃样品于含50 mL聚四氟乙烯的离心管中，加入5 mL超纯水，涡旋3 min后加入10 mL乙腈，2 000次/min振荡提取10 min，然后加1 g NaCl和4 g无水硫酸镁，2 000次/min迅速振荡5 min，再以4 000 r/min离心5 min后，移取1.5 mL上清液（乙腈层）至装有50 mg PSA和150 mg无水硫酸镁的2 mL离心管中，2 000 r/min涡旋1 min，5 000 r/min离心5 min后，上清液过0.22 μm有机滤膜，于-20℃贮存待测。

1.3.3 标准溶液配制及基质标准曲线绘制

用电子天平分别称取0.010 14 g吡唑醚菌酯（98.6%）和啶酰菌胺（98.6%）标准品，用色谱纯乙腈作溶剂配制100 mg/L储备液100 mL，于4℃避光保存。

用色谱纯乙腈梯度稀释，配制质量浓度分别为2.00、1.00、0.50、0.20、0.10、0.05、0.02、0.01 mg/L的系列标准品混合溶液；用空白桃样品提取液稀释，配制上述质量浓度的混合基质标准溶液，分别以吡唑醚菌酯和啶酰菌胺的质量浓度为横坐标，相应的峰面积为纵坐标绘制标准曲线。

1.3.4 添加回收试验

分别添加3个水平的吡唑醚菌酯和啶酰菌胺混合标准溶液于空白桃均质样品中，其添加水平分别为0.01、1.00、2.00 mg/kg。按1.3.1条件进行检测，计算添加回收率及相对标准偏差。

1.3.5 数据处理

吡唑醚菌酯和啶酰菌胺在桃中的残留量随时间变化，可用一级动力学方程表示。

式中：Ct为时间t时的农药残留量，mg/kg；C0为施药后的原始沉积量，mg/kg；k为消解系数，d-1；t为施药后时间，d。

通过式（1）得到的消解系数k，通过式（2）即可计算消解半衰期T1/2。

2 结果与分析

2.1 检测条件优化

为使吡唑醚菌酯、啶酰菌胺的测定达到最佳灵敏度和最佳分离效果，将0.1 mg/L吡唑醚菌酯和啶酰菌胺标准溶液在扫描范围100～500m/z直接进样，选择合适的离子源。在电喷雾离子源、正离子模式下，吡唑醚菌酯和啶酰菌胺均具有较好的电离效果，并获得特征离子峰［M＋H］。在此基础上优化监测离子、锥孔电压和碰撞能量等质谱参数，最终优化条件如1.3.1所述。进一步优化色谱条件，在流动相为乙腈-0.1%甲酸水溶液时，得到较好的灵敏度、重现性及峰形（图1）。

2.2 方法的线性范围、灵敏度

基质匹配外标法定量分析，结果表明吡唑醚菌酯和啶酰菌胺在0.01～2 mg/L的质量浓度范围内均呈现良好的线性关系。其回归方程和相关系数分别是：y=2 798.5x＋156 696，R2=0.990 9（吡唑醚菌酯）；y=434.84x＋6 166.7，R2=0.999 2（啶酰菌胺）。在0.01、1.00、2.00 mg/kg添加水平下，吡唑醚菌酯在桃中的平均回收率为89.8～96.9%，相对标准偏差为0.8%～5.4%；啶酰菌胺在桃中的平均回收率为81.1%～100.5%，相对标准偏差为3.3%～8.9%（表3）。吡唑醚菌酯和啶酰菌胺的定量限均为0.01 mg/kg。

图1 吡唑醚菌酯和啶酰菌胺标准品色谱图（0.01 mg/L）

表3 吡唑醚菌酯和啶酰菌胺在桃中的添加回收率及相对标准偏差（n=5）

2.3 吡唑醚菌酯、啶酰菌胺在桃中的消解动态

吡唑醚菌酯和啶酰菌胺在桃中的消解动态均符合一级动力学方程回归曲线Ct=C0e-kt，吡唑醚菌酯在北京、山西、河南、湖南等4个地区桃中的半衰期分别为15.8、7.8、13.1、7.2 d；啶酰菌胺在北京、山西、河南、湖南等4个地区桃中的半衰期分别为11.0、7.1、11.8、7.0 d，结果见表4。吡唑醚菌酯和啶酰菌胺在不同地区的消解动态曲线见图2，两者均在山西和湖南消解较快，在北京和河南消解较慢。

表4 吡唑醚菌酯和啶酰菌胺在桃中消解动态

图2 吡唑醚菌酯和啶酰菌胺在不同地区的消解动态

3 结论与讨论

本研究在QuEChERS方法基础上，建立了UPLCMS/MS测定桃中吡唑醚菌酯和啶酰菌胺的残留分析方法。在0.01～2.00 mg/L范围内，吡唑醚菌酯和啶酰菌胺的浓度与色谱峰面积均呈现良好的线性关系；在添加水平为0.01～2.00 mg/kg时，吡唑醚菌酯在桃中的平均回收率为89.8%～96.9%，相对标准偏差为0.8%～5.4%；啶酰菌胺在桃中的平均回收率为81.1%～100.5%，相对标准偏差为3.3%～12.1%。吡唑醚菌酯和啶酰菌胺在桃中的定量限均为0.01 mg/kg。与杨霄鸿等[10]建立的HPLC-MS/MS测定吡唑醚菌酯和啶酰菌胺残留方法相比，本方法的定量限更低，灵敏度更高，且操作快速、简便。

据报道，吡唑醚菌酯在草莓上的消解半衰期为4.8～6.0 d[10]，在辣椒上为5.1～7.0 d[17]，在花生上为10.3～11.2 d[18]；啶酰菌胺在草莓上的消解半衰期为5.1～11.0 d[10]，在黄瓜上为2.67～9.90 d[14]，在番茄上为7.6～11.7 d[19]。本研究结果表明，吡唑醚菌酯在桃上的消解半衰期为7.2～15.8 d；啶酰菌胺在桃上的消解半衰期为7.0～11.8 d。吡唑醚菌酯和啶酰菌胺在不同作物的消解半衰期差异不大，均属于易降解农药。本研究提供了吡唑醚菌酯和啶酰菌胺在桃上残留分析方法及消解动态数据，为吡唑醚菌酯和啶酰菌胺在桃上的安全使用提供参考。