喀斯特峰丛洼地不同森林类型土壤真菌群落结构及影响因素

时间：2024-05-24

陈惠君，莫雅芳，封红梅，王家妍，曾馥平，宋同清，彭晚霞*，杜虎，王枫

（1. 中国科学院亚热带农业生态研究所亚热带农业生态过程重点实验室，湖南长沙 410125；2. 中国科学院环江喀斯特生态系统观测研究站，广西环江 547100；3. 中国科学院大学，北京 100049；4. 广西国有高峰林场，广西南宁 530001）

中国西南喀斯特地区是世界上最大的连续喀斯特地区之一，以其独特的景观和丰富的生物多样性而闻名[1]。由于其特殊而复杂的土壤侵蚀过程导致该地区水土流失并形成石漠化，严重阻碍了区域生态平衡[2]。峰丛洼地是喀斯特地貌类型中面积最大的区域，也是喀斯特特有的地貌组合形态[3]，相对其他喀斯特地貌类型，水热条件较好，石漠化面积削减较快[4]。自退耕还林工程实施以来，西南喀斯特地区尤其是峰丛洼地的生态环境得到了极大的改善，植被覆盖度大大提升[5]。生态恢复在大尺度的范围内将农田转化为森林，使土壤有机碳储量及稳定性得到很大提升[6]，生态系统健康得到普遍提高。土壤微生物群落能够快速适应土壤条件变化，在喀斯特脆弱生态系统处于重要地位[7]，而目前在不同喀斯特森林土壤真菌群落组成与结构方面的研究尚少。

土壤微生物群落具有空间依赖性，对变化的环境高度敏感，其生物多样性驱动植物生长和土壤健康[8-9]。作为土壤微生物中重要的一员，土壤真菌参与生态系统中的物质循环和能量流动，是生态系统中的重要组成部分。土壤真菌能将复杂有机物降解与转化为可供其他生物吸收利用的简单化合物，还参与土壤腐殖化和矿质化过程，对腐殖质和土壤团粒结构的形成起着十分重要的作用[10]，其多样性及其群落结构组成是评价其所在生态系统健康稳定的重要指标之一[11]。并且，土壤真菌比细菌更容易受到森林转化的影响，在森林转变过程中，在地上与地下的联系及C、N和P循环中可发挥更重要的作用[12]。

土壤是真菌生长繁殖的天然基质，一方面真菌多样性受到土壤质地、植被特性、气候变化等多因素影响[13-14]，另一方面土壤真菌多样性研究也受到土壤理化性质的制约[15]。邵鹏帅等[16]探究了温带森林次生演替过程中地下微生物群落结构变化，提出土壤层次间理化性质的差异是微生物群落变化的原因。Ren等[17]认为真菌群落多样性在黄土高原森林发展后期变化更加敏感。杨泽良等[18]发现MBN、SOC和细菌数目是影响桂西北喀斯特不同植被演替阶段土壤微生物群落多样性分布的主要因子。而喀斯特不同森林生态系统的土壤真菌群落结构与土壤理化性质的关系仍然不清楚，本研究旨在探明影响喀斯特峰丛洼地不同森林土壤真菌群落结构的影响因素，为喀斯特森林生态系统恢复及潜力挖掘提供参考。

1 材料与方法

1.1 研究区概况

研究区位于广西环江毛南族自治县（107°51'～ 108°43'E，24°44'～25°33'N），属亚热带季风气候区，年平均气温19.3 ℃，年平均日照时数1 451.1 h，年平均降水量1 529 mm[19]。分别选择中国科学院环江喀斯特生态系统观测研究站的木连喀斯特试验站自然恢复区、下南乡古周生态恢复与重建试验示范区和木论国家级自然保护区作为喀斯特峰丛洼地灌木林、次生林和原生林的研究对象，3个区域相互距离≤80 km。

木连恢复区地形破碎，≥25°的坡面占62%，洼地土层较厚、湿度大[20]。遭受过严重的人为破坏，自1985年开始恢复，样地植被主要有黄荆（Vitex negundo）、八角枫（Alangium chinense）、小叶女贞（Ligustrum japonicum）等，属典型人为干扰自然恢复区。古周示范区石芽广泛出露，洼地平均土层深度约为100 cm[21]，以刀果鞍叶羊蹄甲（Bauhinia brachycarpa）、灰毛浆果楝（Cipadessa cinerascens）、菜豆树（Radermachera sinica）和香椿（Toona sinensis）为优势种，自2001年开始植被恢复。木论保护区是目前世界上同纬度地区仅存的原生性强、相对稳定的喀斯特森林生态系统，也是喀斯特区原生性森林分布面积最大的区域[22]，优势种有小果厚壳桂（Cryptocarya microcarpa）、栀子皮（Itoa orientalis）、罗伞（Brassaiopsis glomerulata）等。三个区域土壤均为石灰土。

1.2 样品采集

在上述3个典型研究区域各选择坡度（整体坡度35°）、坡向、土壤母质、土壤类型（石灰土）等立地条件基本一致的坡面和洼地连续体，从洼地向坡顶建立一块投影面积为200 m×40 m的动态监测样地。2020年7月沿样地从下至上每隔20 m（即中间样点）取样，同时用土壤参数仪TDR200测定采样点土壤温度和体积含水率。在每个样点周围20 m范围内，随机采取8个表层土壤样品（0～15 cm），混合后代表该样点土样，回驻地后过10目筛，去除根系和石头，取150 g左右现场密封后置于液氮罐保存带回实验室，用于土壤微生物的高通量测序；剩余的一部分测定土壤常规养分。

1.3 土壤DNA提取及高通量测序分析

每个土壤样品称取0.5 g鲜土，采用试剂盒Fast DNA®SPIN Kit for Soil，MP（Qbiogene Inc., USA）提取DNA，具体步骤参照操作说明书进行。核酸测定仪（Nanodrop ND-1000荧光分光光度计）用于检测DNA的浓度和纯度。光密度值OD230/OD260值在0.4～0.5之间，OD260/OD280值在1.8～2.1为宜。提取的DNA送往上海美吉生物技术有限公司进行Illumina Miseq高通量测序（PE300）。

高通量测序得到的原始数据用Usearch7.1软件进行过滤处理以得到优化后的有效序列。采用RDP classifier贝叶斯算法对97%相似水平的OTU代表序列进行分类学分析，并使用Silva数据库进行比对，得到每个OTU对应的物种分类信息。群落组成分析及多样性分析均在97%序列相似度的OTU水平上进行。

1.4 土壤理化性质测定

土壤样品分析方法采用鲍士旦[23]提出的方法：土壤pH采用电极电位法、有机碳（SOC）采用重铬酸钾氧化—外加热法、全氮（TN）采用半微量开氏法-流动注射仪法测定、全磷（TP）采用NaOH熔融-钼锑抗显色-紫外分光光度法、全钾（TK）采用NaOH熔融-原子吸收法、碱解氮（AN）采用碱解-扩散法、速效磷（AP）采用0.5 mol/L NaHCO3提取-钼锑抗显色-紫外分光光度法、速效钾（AK）采用NH4Ac浸提-原子吸收法，交换性Ca2+和Mg2+用原子吸收分光光度法测定。

1.5 数据处理与统计分析

在Excel软件中对原始数据进行初步整理，采用Sobs指数、Shannon-Wiener及Simpson多样性指数衡量土壤真菌群落α多样性。使用基于Bray-Curtis距离的非度量多维尺度（non-metric multidimensional scaling，NMDS）分析表征不同森林类型土壤真菌群落的β多样性，组间差异检验采用ADONIS分析。采用单因素方差分析和LSD多重比较分析不同森林类型的土壤理化性质差异，采用Wilcoxon秩和检验分析土壤真菌多样性指数差异。对相对丰度排名前50的属绘制热图并进行物种的层级聚类，分析各森林土壤真菌群落结构。通过LEfSe（LDA Effect Size）系统分析不同森林类型具有显著差异的物种，LDA值默认为4。真菌群落与各环境因子之间的相关性采用Pearson相关性分析，最后用基于Bray-Curtis距离的冗余分析（db-RDA）揭示影响真菌和细菌群落组成结构的主导因素。以上的数据分析均在R3.3.4中进行。

2 结果与分析

2.1 土壤理化性质分析

三类森林土壤pH均为中性（图1）。灌木林和原生林土壤有机碳（SOC）含量较高，均在30 g/kg以上。除碱解氮（AN）、碳磷比（C:P）、氮磷比（N:P）及含水率之外，其他土壤理化性质在三类森林均有显著差异。原生林的土壤温度显著低于其他两类森林，土壤含水率则略高于其他两类森林。其他土壤理化性质中除了全钾（TK）、速效磷（AP）、速效钾（AK）以及土壤碳氮比(C:N)之外，次生林的含量均显著低于其他两类森林。

2.2 土壤真菌群落组成

在本研究的所有土壤样品中，通过高通量测序分析得到有效序列2 013 410条，有效碱基数目 468 036 866个，平均序列长度232.46 bp，可分类OTU共9 677个，分属于18个门、59个纲、152个目、379个科、946个属、1 711个种（图2）。不同森林类型间OTU种类数目各不相同：灌木林为4 509、次生林为4 887、原生林为4 956。三种森林类型共同包含的OTU共有1 269个，占森林土壤总OTU的13.11%。灌木林、次生林和原生林中特有的OTU分别为1 900个、2 247个和2 124个，分别占总OTU数量的19.63%、23.22%和21.95%。

三种森林的土壤真菌类群在门分类水平上相对丰度各不相同，主要由5类真菌组成，分别为子囊菌门（Ascomycota）、担子菌门（Basidiomycota）、未分类真菌（unclassified Fungi）、被孢霉门（Mortierellomycota）和罗兹菌门（Rozellomycota）。其中，子囊菌门（49.24%～70.74%）和担子菌门（8.49%～ 32.81%）是三类森林土壤真菌的优势菌门，所占比例近80%（图3）。

子囊菌门是相对丰度最高的土壤真菌门类，主要由粪壳菌纲（Sordariomycetes，15.40%～33.34%）、子囊菌门未定纲（unclassified Ascomycota，19.78%～ 22.68%）、散囊菌纲（Eurotiomycetes，1.67%～6.72%）、古根菌纲（Archaeorhizomycetes，0.3%～7.75%）、座囊菌纲（Dothideomycetes，1.77%～5.18%）、锤舌菌纲（Leotiomycetes，2.29%～3.85%）6个纲组成（图3）。担子菌门是相对丰度仅次于子囊菌的门类，主要由伞菌纲（Agaricomycetes，5.18%～29.71%）和银耳纲（Tremellomycetes，1.80%～2.78%）组成。子囊菌门和罗兹菌门（1.04%～2.70%）相对丰度在三种森林中从多到少依次为灌木林、原生林和次生林。担子菌门和未分类真菌（9.51%～13.63%）的相对丰度在次生林中最高，被孢霉门（2.34%～9.32%）相对丰度在原生林中最高，而在次生林中最低。

在属水平上，子囊菌门未定属（unclassified Ascomycota，19.78%～22.68%）是三类森林主导的真菌类群，未分类真菌（9.51%～13.63%）和被孢霉属（Mortierella，2.28%～9.16%）相对丰度也较高，被孢霉属在原生林中相对丰度较高，而红菌属（Russula，7%）只存在于次生林土壤中（图4）。

2.3 土壤真菌群落多样性

三类森林的丰富度和多样性指数均没有显著差异（图5）。原生林的土壤真菌Sobs指数是三种森林中最大的，次生林的Simpson多样性指数数值近乎是其他两类森林的两倍。Shannon多样性指数表现为原生林>次生林>灌木林。原生林和灌木林的Shannon和Simpson多样性指数数值最为接近。

根据森林类型可将土壤真菌划分为三个聚集区，各森林类型各自聚为一类，表明三种森林类型下的土壤真菌群落结构存在差异（图6）。Stress(胁强系数)小于0.2，说明NMDS可以准确反映样品间的差异程度。综合分析，土壤真菌群落样本在NMDS2轴上分开，聚成两类，原生林和灌木林距离最近，其土壤真菌群落更为相似，而次生林土壤真菌群落组成与其余两类森林有明显差异。

2.4 土壤真菌群落结构和差异性分析

聚类分析表明，三类森林中土壤真菌群落可分为两个类群，它们具有独特的组成和丰度（图7）。原生林和灌木林具有更为接近的土壤真菌组成，而次生林则与它们具有明显的差别。热图表明，锤舌菌属（Leotia）、蜡壳耳属（Sebacina）、锁瑚菌属（Clavulina）和红菌属（Russula）的相对丰度在原生林和灌木林中极低，而在次生林中较为丰富。原生林和次生林的共同点则是葡萄孢属（Botrytis）、Toxicocladosporium和Sistotrema的相对丰度很低。

对三类森林土壤真菌群落在属水平上进行LEfSe分析，共发现13个差异种，且三类森林差异种各不相同，其中灌木林4个、次生林5个，原生林4个（图8）。灌木林中的差异种有粪壳菌纲（Sordariomycetes），散囊菌纲（Eurotiomycetes），散囊菌目（Eurotiales），丛赤壳科（Nectriaceae）；次生林的差异种是伞菌纲（Agaricomycetes），古根菌纲（Archaeorhizomycetes），未分类的伞菌纲（unclassified Agaricomycetes）；而未分类的伞菌目（unclassified Agaricales），丝盖伞科（Inocybaceae），丝盖伞属（Inocybe）则在原生林起关键作用。

2.5 真菌群落影响因子

由图9可知，土壤理化因子与土壤真菌类群（属水平）存在显著的相关关系。除AN和硝态氮影响稍弱外，其他土壤理化因子与土壤真菌丰度相关关系十分密切。但有一些真菌类群对土壤理化因子不敏感，如被孢霉属、Botrytis、镰刀菌属（Fusarium）、腐质霉属（Humicola）、丝盖伞属（Inocybe）、Sistotrema、Toxicocladosporium、木霉属（Trichoderma）、未分类真菌（unclassified Fungi）等。

进一步对三类森林土壤真菌属与环境因子进行基于距离的冗余分析（db-RDA），发现土壤理化因子能解释属水平上土壤真菌群落14.8%的变差，第一轴可以解释所有信息的8.33%，第二轴可解释6.47% (图10) 。第一主轴上土壤交换性Ca2+（P=0.001，R2= 0.810）和Mg2+（P=0.002，R2= 0.668）与属水平真菌极显著负相关，土壤TK（P=0.001，R2= 0.531）和温度（P=0.023，R2= 0.452）为显著正相关。说明土壤的交换性钙离子、镁离子、全钾、土壤温度对真菌群落的分布作用较大，是影响土壤真菌群落结构和分布的主导因子。

3 讨论

3.1 喀斯特不同森林土壤理化性质分析

森林类型对土壤理化性质有明显影响，且大部分因子之间的差异都达到显著水平（图1）。由于碳酸盐岩发育，加上高温多雨、水热匹配的气候特点，喀斯特地区土壤具有较高含量的钙镁。原生林的养分含量几乎是最高的，可能是因为原生林是石灰岩森林植被顶极群落，凋落物有利于积累养分。原生林土壤温度低，可能是因为其森林发育成熟，郁闭度较高。灌木林土壤具有最高的N∶P，说明其植物生长速率较快，与乔木相比，灌木具有更大的能力来增强土壤对环境压力的反应能力[24]，这可能是灌木林土壤养分高于次生林的原因之一。次生林TK含量较高，可能是因为次生林土层浅薄，采集的土壤集中在石沟石缝，而这些地方TK的移动能力较弱。刘淑娟等[25]指出次生林的粘粒含量显著高于原生林粘粒含量，可能是导致次生林全钾含量较原生林高的主要原因。

3.2 喀斯特不同森林土壤真菌组成及多样性

三类森林土壤真菌群落由子囊菌门、担子菌门、未分类真菌、被孢霉门和罗兹菌门组成，最主要的是两类菌门（子囊菌门、担子菌门）和其他森林生态系统一致，不同的是其他主要类群种类有所差异[26-28]。子囊菌门和担子菌门所占比例近80% （图3），这与在贵州喀斯特植被恢复区[27]和天山[28]的研究结果相近。贵州强度石漠化地区植被演替阶段中球囊菌门占比较高[27]，与我们的研究结果在纲水平种类差异也较大，而在属水平我们和刘雯雯等[27]的结果都是以子囊菌门未定属和未分类真菌为优势属，说明不同石漠化强度土壤真菌群落组成差异较大。子囊菌作为腐生菌其主要功能为分解植物残体和降解有机质，担子菌主要功能为分解木质化植被碎屑。原生林和灌木林有机质含量丰富，凋落物丰富，因而子囊菌含量丰富。次生林土被分布不均匀，基岩广泛出露，植被为灌木、藤本和次生乔木[29]，木质素含量高，加上潮湿的土壤，这为担子菌生长提供了良好的条件[30]。

红菌属喜弱酸性土壤，因此其在次生林相对丰度较高（图4）。三类森林都有较高丰度的木霉属和镰刀菌属（图7），这两类真菌可以分泌纤维素酶分解碳及参与土壤难溶性磷的溶解[27]。青霉属、裸节菌属都是溶磷微生物，其在灌木林的含量相对较低，因而灌木林的AP含量较低。次生林拥有较高丰度的蜡壳耳属和革菌属，这两类真菌属于菌根真菌，有利于促进生物固氮、加速土壤磷的风化，提高土壤溶液离子的有效性以及直接吸收等过程，影响氮、磷、钾、钙、镁等元素的无机循环，也有利于提高土壤团聚体的稳定性[31]。说明在缺磷的情况下，喀斯特森林土壤会有一部分真菌承担起溶磷的功能以促进整个生态系统磷元素的周转，而这些类群的种类和丰度则受到森林类型的影响。蜡壳耳属（Sebacina）、锁瑚菌属（Clavulina）和红菌属（Russula）都是外生菌根真菌，它们仅在环境条件最为恶劣的次生林中相对丰度含量较高（图7），结合次生林较低的土壤氮含量，可以发现次生林存在氮限制，说明次生林的土壤真菌可能在提升植物抗逆性及养分供给方面发挥着重要作用。

Peng等[32]发现坡度是喀斯特森林土壤微生物丰富度和多样性空间分布的主要驱动因素，本研究选取的三类森林坡度相近，因而土壤真菌多样性没有显著差异（图5）。另一方面，相差不大的植被覆盖度可能是三类森林土壤真菌多样性相差不大的原因[33]。有机质和全氮是真菌重要的碳源和氮源，我们发现有机质和氮含量较高的灌木林和原生林，其真菌的α多样性也是最高的。石灰岩为主的地区景观比其他生态脆弱区更加破碎[1]，因而具有多样的小生境，这些小生境又为土壤真菌的多样性发展提供了条件。次生林坡面的石隙和石槽中广泛发育有“石隙土”、“石碗土”等土体形式，土层相对较厚，由于周围岩石的分布，土壤水分及携带的营养物质输入较多[29]，这可能是导致次生林土壤真菌丰富度较高的原因。NMDS（图6）和层级聚类（图7）表明灌木林和原生林土壤真菌群落组成最为接近，一方面是因为这两类森林土壤理化性质十分接近，另一方面可能是因为次生林恢复时间最短，而森林发育后期对真菌β多样性的影响大于前期[16]。

三类森林中特有的OTU均占比近20%（图2），差异物种各不相同（图8），灌木林中的差异种有粪壳菌纲（Sordariomycetes）、散囊菌（Eurotiomycetes），丛赤壳科（Nectriaceae）；次生林的差异种主要是伞菌纲（Agaricomycetes）和古根菌纲（Archaeorhizomycetes）；而未分类的伞菌目（unclassified Agaricales）和丝盖伞菌（Inocybaceae、Inocybe）则在原生林起关键作用，说明森林类型显著影响土壤真菌群落组成。

3.3 土壤理化性质对喀斯特森林土壤真菌群落的影响

喀斯特地区的植物因特殊的母质和高温多雨的气候特征，都具有嗜钙性、耐旱性和石生性等特点[34]。在极端环境中，土壤中的微生物进化比植物更迅速地适应不利的环境。相关分析发现土壤理化因子与土壤真菌类群（属水平）存在显著的相关关系（图9），说明土壤理化因子显著影响土壤真菌群落相对丰度。部分类群受环境因子影响较小，如相对丰度较高的被孢霉属等，可能是由于其耐受性较高，这与高婷婷[35]的研究结果一致。基于距离的冗余分析发现，土壤的交换性钙离子、镁离子、全钾、土壤温度对真菌群落的分布作用较大，是影响土壤真菌群落结构和分布的主导因子。说明喀斯特地区特殊的土壤环境不仅塑造了植被群落，也参与了土壤真菌群落的塑造。另一方面，植被根系分泌物和气候条件等可能也对土壤真菌群落有一定的作用。

有学者提出气候因素对土壤真菌组成的影响可能比土壤养分的影响更明显[36]，但在喀斯特地区，土壤理化因子比气候因子的影响更为强烈，可能是因为复杂地形造成的养分分布不均直接影响到了土壤真菌的养分吸收和种间竞争。有学者发现TK是影响秦岭撂荒地土壤真菌群落组成的主要因子[37]，这与我们的研究结论一致。而在黄土高原的一项研究则认为，年均降水量、土壤pH以及SOC是塑造土壤真菌群落的主要因子[38]，我们的研究没有出现这种结果可能是因为喀斯特地区夏季降水丰沛，土壤真菌群落并未受到土壤水分的约束。Tang等[39]认为土壤钙驱动了喀斯特石漠化地区土壤真菌的反应机制，结合我们的研究结果，进一步说明了钙在塑造喀斯特土壤真菌群落中的重要作用。

真菌与植物关系密切，一方面植物凋落物可以为真菌提供养分来源，另一方面，菌根真菌与植物共生，加速土壤养分积累，促进植物生长。在亚热带森林演替过程中，菌根真菌和磷酸酶参与根际磷转化改善了植物营养[40]，Chen等[41]发现在有机土壤中，树木的种类是决定亚热带森林土壤微生物群落的重要因素，而林下植物区系α多样性指数也显著影响土壤真菌群落组成[42]。我们的db-RDA分析发现土壤指标只解释了不到15%的变异（图10），可能的原因是植被生物多样性和其他环境因子对研究区域土壤真菌群落可能有影响，我们没有考虑到。因此，今后应综合分析植被、土壤、地形、气候等因素对土壤真菌的影响。随着森林的演替，土壤微生物由受N限制转变为受N、P共同限制，优化土壤微生物功能多样性可能会提高土壤氮的有效性，通过优化土壤非生物环境、减少土壤微生物多样性的损失可能会提高土壤的多功能性。