MMP19基因在5个猪群体内的多态性分析

吴华莉，曹建国，张莺莺，涂尾龙，王洪洋，黄 济，谈永松

（1.上海市农业科学院畜牧兽医研究所，上海 闵行 201106；2.上海市种猪工程技术研究中心，上海浦东新区 201302）

MMPs（Matrix metalloproteinases,基质金属蛋白酶）是一类具有锌依赖性内肽酶同源结构域的蛋白水解酶，参与细胞外基质各种成分的降解和重建平衡，通过裂解作用释放生长因子、细胞膜结合蛋白和细胞因子而发挥生物学作用。MMPs家族基因参与胚胎发育、繁殖和组织修复等生理过程[1]。MMP19（Matrix metallopeptidase 19）是MMPs家族成员之一，参与生长发育和疾病的细胞外基质各种成分的降解过程[2-3]。人MMP19定位于12号染色体，mRNA在人体各种组织中广泛表达[4]。猪MMP19基因定位于5号染色体。猪MMP19全基因组长度6 340 bp，包含9个外显子和8个内含子，mRNA在猪肝脏表达量最高，在脾脏和卵巢组织等也有高表达量[5]。有研究发现猪MMP19基因第5外显子第203 bp处多态位点产生的不同基因型个体在生长指标、免疫指标以及眼肌高度差异显著[6-7]。杜洛克、长白、大白和梅山猪具有良好的繁殖性能和优良的肉用性能。申农猪是上海农业科学院畜牧兽医研究所用长白×（大白×二花脸）经横交固定、世代选育形成的母本新品系。目前关于猪MMP19基因多态位点检测报道较少。本试验检测MMP19基因第5外显子在上海地区5个猪群体中的多态性，期望为猪繁殖、生长指标和疾病的分子育种候选基因提供参考数据。

1 材料与方法

1.1 供试样品

试验于2019年7—10月在上海市农业科学院畜牧兽医研究所进行。采集样品品种包括杜洛克（92头）、长白猪（76头）、大白猪（153头）、申农猪（72头）、梅山猪（108头），总计501头；采用样品来源于上海祥欣畜禽有限公司、上海警备区富民农场和上海猪状元畜牧综合场；采集部位为耳组织块。PCR所用试剂Taq酶和MseⅠ酶购于宝生物工程有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 DNA提取 采用AXYGEN基因组试剂盒提取组织DNA，测定DNA浓度，稀释DNA，使每管浓度达到50 ng/mL，-20 ℃保存备用。

1.2.2 引物及PCR扩增 上游引物：5'-ACTCTG ACCGCCTTCCTC-3'；下游引物：5'-TCAAGCCC GAAGAGGTGC-3'[5]。PCR扩增条件为：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共32个循环；最后72 ℃延伸5 min。PCR产物由1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，要求目的条带单一明亮无杂带，符合条件的PCR产物进行酶切试验，采用2.0%琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果。

1.2.3 基因型分析 猪MMP19基因PCR扩增片段为354 bp，存在MseⅠ酶切位点，基因型判定标准见表1。

表1 MMP19基因酶切后基因型判定标准

2 结果与分析

2.1 PCR-RFLP检测

用琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果，目的条带大小与预期一致。图1显示，TT型为1条带，CC型为2条带，TC型杂合子为3条带。根据电泳检测结果统计每个个体的基因型。

图1 MMP19基因酶切检测

2.2 MMP19基因在5个猪群体内的基因型频率和等位基因频率

采用PCR-RFLP技术，MMP19基因在5个猪群体内的多态性检测结果见表2。由表2可见，MMP19基因第5外显子多态性在5个猪群体内的基因型频率和等位基因频率表现为：在杜洛克和长白猪群体内检测出CC型为主要基因型，杂合子TC基因型略少，只有少量TT基因型，C等位基因为优势等位基因；在大白猪和申农猪群体内占优势的是CC基因型和C等位基因；在梅山猪群体内TC型为主要基因型，CC基因型略少，只有少量TT基因型。本研究结果显示，MMP19基因在杜洛克、长白和梅山猪群体内检测出3种基因型，在大白和申农猪群体内检测出2种基因型。

表2 MMP19基因在5个猪群体内的基因型频率和等位基因频率

3 讨论

赵永贞研究结果表明，CC型个体平均日增重、滴水损失和眼肌高度显著高于TC型[5]。本研究检测MMP19基因在杜洛克、长白、大白和申农猪群体内CC型为优势基因型，其中在大白猪群体内CC型频率为0.97。这一结果暗示杜洛克、长白、大白和申农猪群体的生长性能良好。在5个猪群体内C等位基因占优势，这与唐中林检测C等位基因在长白和大白群体中占优势的结果是一致的[6]。猪MMP19基因第5外显子的TC型个体白细胞数、血红蛋白浓度和IgG2浓度高于CC型，是因为该区域存在与猪早期平均增长率相关数量性状基因座（QTL）以及与抗K88大肠杆菌的IgG2水平相关QTL[6]。有研究证实，鼠MMP19 mRNA在滤泡生长、排卵和黄体溶解过程发挥重要作用[7]。猪MMP19基因第5外显子T/C突变位点已被证实与平均日增重、肉质性状的滴水损失、嫩度和眼肌高度显著相关，并且与脂肪性状内脂率相关，与免疫指标白细胞数（WBC）和IgG2含量显著相关[8]。猪MMP19 mRNA在猪胚胎背最长肌表达量随发育时间增加而逐渐增加[6]。这些研究都表明，MMP19基因第5外显子的多态性与猪的生长指标、肉质性状和抗病性能有关，可作为猪育种的分子遗传标记加以深入探究。本试验结果显示，TC型频率在大白猪群体很低，在梅山猪群体达0.84，在杜洛克、长白和申农猪群体内TC型频率约为0.4，而TT型个体在杜洛克、长白和梅山猪群体检测频率很低，在大白和申农猪群体均未检测出TT型。赵永贞证实TC型个体白细胞数（WBC）和IgG2浓度显著高于TT型（P<0.05），TC型的WBC、血红蛋白浓度（HGB）和IgG2高于CC型，但未达到差异显著水平[5]。这说明除大白猪群体外，梅山猪、杜洛克、长白和申农猪群体内与免疫指标相关的TC型频率较高，进一步研究可测定这些猪群体的生长指标、繁殖性能指标以及免疫指标并进行相关分析，以期为分子育种提供参考数据。