湖南湘潭某猪场保育猪链球菌分离鉴定及耐药性试验

王 文，范方程，邓瑞德，杨文江，董 伟

（湖南农业大学动物医学院，湖南 长沙 410128）

随着猪场生物安全防控措施逐渐完善与有效疫苗规范接种，猪场发生病毒性传染病的情况逐渐减少。但由于抗生素的不合理使用与养殖户对细菌性疾病防控的忽视，部分细菌性病原在我国猪场仍然十分常见。猪链球菌在临床上十分常见，该病原感染猪可导致患猪出现脑膜炎、关节肿大或败血症等[1]。此外，该病原也是常见的人畜共患性病原，部分血清型病原可通过伤口或黏膜等途径感染人，并引发严重的临床症状，如脑膜炎和败血症等[2]。近年来虽然人们对人畜共患性疾病的防控意识有较大提高，但猪链球菌感染人的案例仍有发生[3-4]。

目前对猪链球菌的初步鉴定主要是分析菌株在培养基的生长特性、革兰氏染色特性和生化特性等，但这些传统的手段无法对致病菌进行准确的种类鉴定，因此可采用PCR法对菌株16S rDNA基因序列进行扩增与分析，确定细菌种类。此外，根据荚膜多糖抗原差异可将猪链球菌分为35个血清型，其中可感染人的血清型有4种，分别为1、2、7和9型，也可以通过PCR法扩增不同血清型链球菌特异性序列，进而确定菌株的血清型[5-6]。

2019年8月，湖南湘潭某猪场部分保育猪突然发病，主要表现为关节肿大、败血症和神经症状（如划水状和转圈等），初步剖检可发现病畜淋巴结肿大、关节腔有积液、脾脏肿大和脑膜充血、出血等。为了确诊致病原，该场负责人采集死亡病猪病变组织（肺脏、脾脏和淋巴结等）送至湖南农业大学畜禽疾病检测实验室，工作人员对组织病理进行细菌分离鉴定及药敏试验，旨在为该场疫情的防控提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 病料来源

2头病死保育猪病料来源于湖南省湘潭某猪场，其中病料包括淋巴结、肺脏、肾脏和脑组织等。

1.2 主要试剂

PCR预混液、DL 2 000 DNA Marker等试剂购自于TaKaRa公司，胰蛋白胨大豆琼脂（TSA）和胰蛋白胨大豆肉汤（TSB）培养基购自于北京奥博星生物技术有限公司；药敏纸片购自于杭州微生物试剂有限公司。

1.3 细菌分离与革兰氏染色鉴定

严格按照无菌操作，用高温灼烧后的接种环蘸取少量病变组织液接种TSA培养基表面，在37 ℃恒温箱培养18 h后挑取单一菌落进一步纯化，挑取纯化的菌落于TSB培养基扩增，并将扩增菌液适当稀释后进行革兰氏染色鉴定。

1.4 细菌16S rDNA基因序列扩增

以DNA提取试剂盒提取细菌基因组DNA，根据参考文献合成细菌鉴定通用引物[5]。引物由湖南擎科生物技术有限公司合成，其扩增片段大小约1 200 bp，PCR反应体系（25 μL）包括PCR mix 12.5 μL、上下游引物各0.5 μL、DNA模板1.0 μL及双蒸水10.5 μL，反应条件为94 ℃预变性5 min，94 ℃变性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，共35个循环，72 ℃再延伸5 min。PCR反应结束后取5.0 μL PCR产物进行琼脂凝胶电泳，观察结果。

1.5 猪链球菌血清型鉴定

根据链球菌不同血清型基因组特异性，以及参考文献[7]合成链球菌1、2、7、9型对应PCR引物，预期扩增片段大小分别为444 bp、363 bp、590 bp和442 bp。PCR反应体系（25 μL）包括PCR mix 12.5 μL、上下游引物各0.5 μL、DNA模板1.0 μL及双蒸水10.5 μL。反应条件为94 ℃预变性5 min，94 ℃变性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共35个循环，72 ℃再延伸5 min。PCR反应结束后取5.0 μL PCR产物进行琼脂凝胶电泳，观察结果。

1.6 小鼠致病性试验

将12只5周龄雌性昆明小鼠随机分为2组，每组6只，其中试验组腹腔注射分离菌株100 μL（1×108CFU/mL），对照组腹腔注射等量生理盐水。每日观察各组小鼠临床及死亡情况，并对死亡小鼠进行剖检，观察组织病变情况。

1.7 药敏试验

采用药敏纸片扩散法对分离致病菌进行药敏试验，将细菌稀释至1×107CFU/mL，取200 μL稀释菌液涂布于TSA培养基表面，待菌液稍干，取不同药敏纸片贴在培养基表面，将培养基置于37 ℃恒温培养24 h后测定不同药敏纸片抑菌圈，根据相关判定标准对结果进行分析。

2 结果

2.1 细菌形态及革兰氏染色鉴定结果

将病料组织液接种于TSA培养基，发现培养基表面长有圆形、透明、水滴状菌落，进一步进行革兰氏染色，结果如图1所示，菌株属于革兰氏阳性菌，其形态特征主要为数个球状细菌排列为链状，可将其初步判定为猪链球菌。

图1 猪链球菌分离株革兰氏染色镜检结果

2.2 PCR扩增及序列分析结果

将分离菌株扩增后提取基因组DNA，用细菌通用引物对其16S rDNA基因序列进行扩增，凝胶电泳结果如图2（左）所示，该菌株16S rDNA基因序列PCR产物大小约1 700 bp，进一步测序分析结果发现该菌株序列与已知猪链球菌分离株（登录号：AF009476）同源性高于99%，提示本试验获得分离株为猪链球菌。用不同血清型鉴定引物对本试验获得猪链球菌进行分子鉴定，结果发现仅扩增出约330 bp条带（图2右），与猪链球菌2型PCR扩增目的条带基本相符，而其它血清型引物未扩增出条带，提示本试验获得菌株为猪链球菌2型。

图2 猪链球菌16S rDNA基因与血清型鉴别引物PCR扩增产物凝胶电泳结果

2.3 小鼠致病性试验

为进一步分析该分离株的致病性，以昆明小鼠为动物模型，对试验组小鼠腹腔注射菌液100 μL，对照组则注射生理盐水，结果发现，试验组小鼠接种细菌后均出现呼吸急促、精神萎靡和运动频率下降等症状，且试验组小鼠在24 h内均出现死亡，但对照组小鼠则健康。剖检结果表明死亡小鼠不同脏器均有出血症状，且从小鼠病变组织中也分离出该致病菌。

2.4 药敏试验

药敏试验结果如表1所示。本试验分离的猪链球菌2型分离株对氨苄西林、阿莫西林、头孢拉定、头孢唑林、头孢氨苄、头孢噻肟、青霉素、环丙沙星和克林霉素高度敏感，对红霉素和恩诺沙星中度敏感，但对链霉素、林可霉素和氟苯尼考耐药。

表1 猪链球菌对不同抗生素药敏试验判定结果

3 讨论

猪链球菌在我国养猪场较为常见，该病原也可以感染人，是一种对人畜危害很大的传染性病原。猪链球菌可分为多种血清型，但猪链球菌2型为主要流行的血清型，且该血清型病原致病力较高，甚至可导致患畜死亡[3，6]。本试验从湘潭县某猪场发病保育猪组织病料中分离出一例病原菌，形态学及分子生物学方法鉴定结果显示该菌为猪链球菌2型，且对小鼠具有较强的致病力。

由于猪场抗生素不合理的使用导致部分链球菌出现耐药情况严重，但不同地区或猪场流行的猪链球菌耐药情况差异较大。邓智丹等[8]研究表明，广东省某规模化猪场流行的2型猪链球菌对青霉素、阿莫西林、头孢类（头孢拉定、头孢噻呋等）和恩诺沙星等药物敏感，但对强力霉素耐药；杨春蕾等[9]调查结果发现2型链球菌天津分离株对阿米卡星、四环素和强力霉素等高度耐药。而本试验分离的菌株对链霉素、林可霉素和氟苯尼考高度耐药，但对头孢类、青霉素和环丙沙星等药物高度敏感，这与邓智丹等[8]和杨春蕾等[9]的研究结果有差异，同时也说明了对分离菌株进行药敏试验分析的重要性。根据药敏试验结果可筛选对该致病菌敏感的药物，从而有利于快速制定防控该病的有效措施。