猪源肠外致病性大肠杆菌的分离鉴定与药敏试验

丁建华，吕李明，周 磊，李泽伟，孙起荣，刘雪兰，李 郁

（1.霍邱县动物疫病预防与控制中心，安徽 六安 237400；2.安徽农业大学动物科技学院，合肥 230036）

已知多种动物均易被病原性大肠杆菌感染发生大肠杆菌病。在世界各地，大肠杆菌是猪群中很多疾病，包括新生仔猪腹泻、断奶仔猪腹泻、败血症、多发性浆膜炎、乳腺炎、尿路感染的一个重要原因。肠外致病性大肠杆菌（Extraintestinal Pathogenic Escherichia coli,ExPEC）是一组不同种类的大肠杆菌，不仅可正常定植于肠道，而且能侵入引起菌血症，并诱发败血症或局部肠道外感染，如脑膜炎、关节炎、肺炎、心内膜炎等[1]。临床上通常使用抗生素进行大肠杆菌病的治疗，但近年来随着抗生素的大量使用，多重耐药大肠杆菌菌株日益增多，给人和动物的安全带来了极大隐患；而ExPEC产生的抗生素耐药性明显高于其他菌群，50%以上的菌株为多重耐药，甚至许多菌株已演化成超级细菌，严重影响了选择有效的抗生素对该类细菌引起的疾病进行防治[2]。由于发病率、死亡率升高和体重降低的增加，以及治疗、疫苗和饲料添加剂的成本增加，ExPEC引起的猪大肠杆菌病导致的经济损失日益显著。

本试验对来自某集团公司家庭农场的病猪肠道外组织及其积液（包括肝脏、脾脏、肺脏、肠系膜淋巴结、关节积液、心包积液），进行常规的细菌分离培养、分离菌的致病性试验和药敏试验，进行ExPEC的分离鉴定及其对临床上常用抗菌药物的敏感性分析，从而为有效预防和控制该类大肠杆菌病流行提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 病料来源

试验时间为2018年3月至2019年3月。采样地点：安徽、江苏、山东、河北、广西。试验是在安徽农业大学动物传染病研究室进行的。本试验用病猪共计172头，来源于某集团公司家庭农场，发病猪至少包含高热、咳喘、关节肿大、皮肤发红、败血症、脑膜炎等临床症状中的一种。每头病猪均采集其肠道外组织及其积液（包括肝脏、脾脏、肺脏、肠系膜淋巴结、关节积液、心包积液）。

1.2 试剂材料

麦康凯琼脂培养基（MAC）、三糖铁琼脂培养基（TSI）、LB培养基、水解酪蛋白琼脂培养基（MHA）、蛋白胨水、葡萄糖蛋白胨水、枸橼酸盐培养基，革兰氏染色液，Kovac试剂、MR试剂、V-P试剂，抗生素药敏纸片等均购自杭州微生物试剂有限公司。体重为18～22 g、6～8周龄清洁级雌性昆明鼠购自安徽医科大学实验动物中心。

1.3 质控菌株

金黄色葡萄球菌（ATCC25923）和大肠杆菌（ATCC25922）购自中国药品生物制品检定所。

1.4 细菌分离培养

以无菌操作采集病猪的肝脏、肺脏、脾脏、肠系膜淋巴结、关节积液、心包积液，分别接种MAC并作四区划线，于37℃培养18～24 h。

1.5 肠外大肠杆菌鉴定

从1.4中MAC上挑取大肠杆菌的可疑菌落进行革兰氏染色镜检。将镜检结果符合大肠杆菌的菌株纯化后穿刺接种于TSI，37℃培养18～24 h。将培养结果符合大肠杆菌的菌株分别转种蛋白胨水、葡萄糖蛋白胨水和枸橼酸盐培养基，37℃培养18～24 h，进行吲哚试验（I）、甲基红试验（M）、乙酰甲基甲醇试验（Vi）、枸橼酸盐利用试验（C，简称 IMViC试验）。

1.6 肠外大肠杆菌致病性试验

自1.5中分离并鉴定为肠外大肠杆菌的菌株接种于5 mL LB液体培养基中，37℃培养18～24 h。采取麦氏比浊法，用灭菌生理盐水将肠外大肠杆菌培养菌液稀释至浓度为0.5～1.0麦氏单位。将经3 d观察并呈现健康状态良好的小鼠随机分组，分为试验组（若干组，根据分离菌株数确定试验组数量，每株分离菌为一个试验组）和对照组，每组5只；试验组小鼠接种不同分离菌培养液，接种方式为腹腔注射，接种剂量为0.2 mL/只，对照组小鼠以相同的方式和剂量接种LB液体培养基。接种后观察72 h，记录小鼠的发病和死亡情况。

对照组小鼠均健活，试验组小鼠表现精神萎靡、眼睛无神、嗜睡、行动迟缓或静止抱团不活动、食欲下降或不进食、被毛杂乱且无光泽度，最终死亡；并在无菌条件下将对照组和试验组小鼠的肺脏、肝脏、脾脏分别进行细菌分离鉴定，方法同1.3和1.4。试验组小鼠的分离菌与攻毒菌一致，对照组小鼠则无，表明肠外大肠杆菌具有致病性，鉴定为ExPEC。

1.7 ExPEC药敏试验

根据1.6确定的ExPEC，将其纯化并制成菌悬液，校正浊度至0.5麦氏单位，使用MHA培养基，采用纸片琼脂扩散法（K-B法）对ExPEC分离株进行药敏试验。22种抗生素包括青霉素（PEN）、阿莫西林（AMX）、氨苄西林（AMP）、头孢唑林（CFZ）、头孢氨苄（CA）、头孢曲松（CRO）、链霉素（STR）、庆大霉素（GEN）、卡那霉素（RAN）、丁胺卡那（AMK）、新霉素（NEO）、大观霉素（SPT）、四环素（TE）、多西环素（DX）、氟苯尼考（FFC）、甲氧苄胺嘧啶（TMP）、复方新诺明（SXT）、氧氟沙星（OFL）、恩诺沙星（ENR），环丙沙星（CIP）、多黏菌素B（PB）、多黏菌素 E（CT）。根据美国临床和实验室标准化研究所（CLSI）2018版执行标准判定结果。

2 结果

2.1 细菌分离与肠外大肠杆菌鉴定

自172头病猪中共分离到71株符合大肠杆菌的形态、培养和生化反应特性的菌株。在MAC上形成圆形凸起、不透明、粉红色、边缘整齐、表面光滑、直径2～3 mm的菌落；培养物涂片染色镜检结果呈革兰氏阴性、杆状、两端钝圆、散在或成对排列的菌体；纯化培养物在TSI中的结果为斜面和底面都变黄、产酸产气、不产硫化氢，IMViC试验结果为阳性、阳性、阴性、阴性，见图1、图2、图3和图4。

2.2 肠外大肠杆菌对小鼠的致病性

71株肠外大肠杆菌分别进行小鼠致病性试验，按照1.6，有54株肠外大肠杆菌具有致病性，鉴定为ExPEC。54株ExPEC分离自33头病猪，分离率为19.19%（33/172）；其中分离自肺脏的19株（35.19%），肠系膜淋巴结15株（27.78%），肝脏11株（20.37%），脾脏7株（12.96%），关节积液和心包积液各1株，分别占比1.85%。在54株ExPEC中，致小鼠100%死亡的 24株（44.44%），80%死亡的 11株（20.37%），60%死亡的6株（11.11%），40%死亡的8株（14.81%），20%死亡的5株（9.26%）。

2.3 ExPEC药敏试验结果

54株ExPEC对22种抗生素药敏试验结果见表1。100%的菌株耐受青霉素、多西环素，98%的菌株耐受甲氧苄胺嘧啶，复方新诺明，96%的菌株耐受阿莫西林、氨苄西林和四环素，85%的菌株耐受头孢氨苄，80%的菌株耐受氟苯尼考，76%的菌株耐受卡那霉素和链霉素，72%的菌株耐受头孢唑林，63%的菌株耐受庆大霉素，56%的菌株耐受头孢曲松，54%的菌株耐受新霉素和环丙沙星，52%的菌株耐受恩诺沙星，44%的菌株耐受氧氟沙星，28%的菌株耐受丁胺卡那，20%的菌株耐受大观霉素，而100%的菌株均对多黏菌素B和多黏菌素E敏感。

54株ExPEC对22种抗生素的耐药谱见表2。98.1%菌株耐5种以上抗生素，均为多重耐药。其中耐5～9种抗生素的菌株2株，占比3.7%；耐10种以上抗生素的菌株51株，占比94.4%。耐药谱有46种，其中PEN+AMX+AMP+CFZ+CA+CRO+STR+GEN+RAN+AMK+TE+DX+TMP+SXT的占比最大，为10.87%。

表2 54株ExPEC的耐药谱

3 讨论

当前影响我国生猪健康养殖的五大难题包括品种、疾病、饲料、设备和环境，其中疾病防制是养猪业发展的关键，与养猪业效益、食品安全息息相关。目前猪病的发生和流行的新特点表现在：疾病种类明显增多，多病原混合感染或继发感染显著增加；临床表现呈现一病多型、一病多症、一症多病；呼吸道病综合征的问题日益突出；免疫抑制性疫病危害深重；细菌性疾病的危害加大，对药物耐受性增强等。这些问题大大影响了生猪生产的稳定发展。

本试验从172头病猪的肠道外组织及其积液中分离到71株大肠杆菌，其中54株为ExPEC，分离自33头病猪，分离率为19.19%，与国内相关研究报道19.1%、18.5%类似[3-4]；分离株多源自肺部（35.19%），其次是肠系膜淋巴结（27.78%）、肝脏（20.37%）和脾脏（12.96%），此外还由关节积液和心包积液中分离出ExPEC，这也与国内相关研究报道类似[3，5-6]；表明猪源ExPEC流行较广，感染较普遍。本试验用病猪至少出现了高热、咳喘、关节肿大、皮肤发红、败血症、脑膜炎等临床症状中的一种，从病猪肠道外的多器官组织中分离的54株大肠杆菌对小鼠均具有致病性，其中致病力很强（致小鼠100%～80%死亡）的菌株占比64.81%。研究显示，大肠杆菌在高热综合征的发病过程中只起协同诱发作用[7]。而本试验中54株ExPEC在致猪发病过程中的作用如何？由于没有进行猪的攻毒试验，因而尚不能确定，有待于进一步试验探究。但该类菌对猪群健康产生的潜在危害性，应引起我们的高度重视。

药敏试验结果显示，本试验的54株ExPEC均为多重耐药，至少耐3种及以上受试药物，其中94.4%的菌株耐10种以上药物，同时存在46种不同的耐药谱，表明其耐药性强、耐药谱复杂多样。54株ExPEC对青霉素、多西环素、复方新诺明、甲氧苄胺嘧啶、阿莫西林、氨苄西林、四环素、头孢氨苄、卡那霉素、氟苯尼考、链霉素、头孢唑林的耐药率均在70%以上，对庆大霉素、头孢曲松、环丙沙星、恩诺沙星、新霉素、氧氟沙星的耐药率均在46%以上，存在向耐药性增强发展的趋势，与国内相关的报道有差异[3-6，8]，显示出时间上和地域性差异。不同地区、不同猪场，即使同一猪场在不同的时间，其用药方法都会存在一定的差别，而抗生素的选择压力会导致ExPEC分离菌对药物的敏感性不同。所幸的是，54株ExPEC对多黏菌素B和多黏菌素E均敏感。多黏菌素对多重耐药革兰氏阴性菌（如大肠杆菌、沙门氏菌）的抑菌效果良好，多年来在临床上得到广泛应用。我国是世界上多黏菌素农业使用量最高的国家之一。然而，近年来动物源性多黏菌素类药物耐药率趋高，与质粒介导的黏菌素耐药基因mcr-1有关。2015—2016年的调查显示，猪源大肠杆菌的mcr-1的流行率为68.86%[9]。

综上所述，某集团公司家庭农场的猪群中存在ExPEC一定程度上的流行，以肺脏分离率最高，多具有较强的致病性，耐药性强且相当普遍，耐药谱复杂多样且有增大的趋势。因此在临床生产实际中，应坚持不懈地进行猪群中ExPEC的监测工作，及时分析ExPEC对药物的敏感性，合理用药，有效控制ExPEC对猪群的威胁，降低ExPEC耐药性的产生和传播，以保证生猪生产的健康、稳定、持续发展。