猪ADAMTS1基因的多态性与产仔数性状的关联分析

刘林清，李庆岗，王重龙

（安徽省农业科学院畜牧兽医研究所，畜禽产品安全工程安徽省重点实验室，安徽 合肥 230031）

ADAMTS1是一种具有血栓反应基序的分解素和金属蛋白酶，为ADAMTS家族的成员之一，目前ADAMTS家族共发现19个成员[1-2]，主要参与生物体内受精过程、炎症反应等[3]。ADAMTS1（含凝血酶敏感蛋白模体的去解联金属蛋白酶）基因被靶向失活会导致雌性动物不孕和发育迟缓[4-6]。Shindo等[7]研究发现，人绒毛膜促性腺激素（hCG）注射到小鼠4 h后可检测到ADAMTS1基因的表达，并且在卵泡破裂12 h后其表达量达到高峰，表明ADAMTS1在卵泡破裂过程中发挥着关键作用。这些研究结果进一步暗示了ADAMTS1基因在排卵过程后都发挥着作用。

为此，本研究建立了ADAMTS1基因的PCRPvuⅡ-RFLP分型技术，并在淮猪新品系Ⅱ猪群中进行多态性分型，检测该位点的多态性及其与产仔数性状进行关联分析，以期为提高猪产仔数提供一个有用的分子标记。

1 材料与方法

1.1 材料

试验动物及组织采集 试验开展时间和地点：于2021年8月在安徽省农业科学院畜牧兽医研究所开展的试验；试验样本采集的地点和时间：于2014年7月在安徽省科鑫养猪育种有限公司采集85头淮猪新品系Ⅱ系猪的耳组织放置于75%酒精的离心管中，-20 ℃保存备用。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取 采用苯酚-氯仿抽提法，TE溶解，-20 ℃冷冻保存。

1.2.2 引物的设计与合成 根据ADAMTS1基因DNA序列，应用Premier 5.0软件在多态位点（第7外显子）两侧，设计一对引物，突变位点可用限制性内切酶PvuⅡ识别，引物由上海生工生物公司合成。引物信息如下：ADAMTS1基因的上游引物：5'-TGGGGAGATTGTTCCAGAAC-3'，下游引物：5'-CTGCAGAACGAAGAAGTAGCC-3'，片段长度为413 bp，退火温度为65.0 ℃。

1.2.3 PCR扩增 PCR反应体系为25 μL，其中PCR 2×Taqmix 12.5 μL，10 mmol/μL的引物各0.5 μL，DNA模板1 μL（DNA约100 ng），加ddH2O至25 μL。PCR反应条件为第1步95 ℃变性5 min；第2步95 ℃变性45 s；第3步65.0 ℃复性40 s；第4步72 ℃延伸40 s；重复第2至第4步35个循环，之后再72 ℃延伸10 min，最后降温至4 ℃保存。PCR扩增产物用浓度为1.5%的琼脂糖凝胶电泳，核酸染料染色，凝胶成像系统中观察，可见到片段大小为413 bp的清晰条带。

1.2.4 限制性内切酶酶切（RFLP） ADAMTS1基因的PCR产物用PvuⅡ内切酶酶切，反应体系为：10×Buffer 1 μL，PvuⅡ酶0.30 μL（10 U/μL），加PCR产物至10 μL；37 ℃反应8～12 h；然后，酶切产物在1.5%琼脂糖凝胶中电泳，核酸染料染色，凝胶成像系统中观察。

1.3 数据处理分析

1.3.1 统计分析的软件 采用SAS 8.0统计软件（SAS Institute Inc, Version 8 Edition）的GLM程序进行标记方差分析，并进行显著性检验。

1.3.2 基因效应统计分析模型 依据Liu等[8]所述方法建立的单标记回归统计模型，除了猪个体为随机效应以外，其他因素均为固定效应。所采用模型如下：Y=平均值+基因型+胎次效应+残差，其中Y为性状表型值。

2 结果与分析

2.1 猪ADAMTS1基因的多态位点检测

PCR扩增片段长度为413 bp，经PvuⅡ酶切后产生3种基因型（图1）。当多态位点为BB基因型时，则造成了PvuⅡ酶切位点，PCR产物经PvuⅡ消化后产生2个片段（316 bp+97 bp），记为等位基因B；当多态位点为AA基因型时，则酶切位点消失，PCR产物经PvuⅡ消化后产生1个片段（413 bp），记作等位基因A。

图1 猪ADAMTS1基因PvuⅡ酶切分型结果

2.2 猪ADAMTS1基因在淮猪新品系Ⅱ系猪群体中的基因型和等位基因的频率分布

由表1可见，ADAMTS1基因PvuⅡ酶切位点在所检测的猪群中，发现B等位基因占优势。

2.3 猪ADAMTS1基因PvuⅡ多态位点基因型与猪产仔数性状的关联分析

应用基因效应统计分析模型，采用SAS统计软件的GLM程序在淮猪新品系Ⅱ系猪群体中进行猪ADAMTS1基因PCR-PvuⅡ-RFLP多态位点与产仔数性状的关联分析。

在淮猪新品系Ⅱ系猪群体中，所有胎次产仔数均呈现AB＞BB＞AA的趋势。其中，AB型个体的所有胎次产仔数显著高于BB型个体0.665头（P＜0.05），详见表2。统计结果显示，AB型和BB型母猪具有较高的产仔数，B等位基因为优势等位基因。

表2 ADAMTS1基因PCR-Pvu Ⅱ-RFLP基因型与淮猪新品系Ⅱ产仔数性状的统计分析

3 讨论

淮猪新品系Ⅱ是以安徽省优良地方品种淮猪为母本，以国外优质瘦肉型品种长白猪、大白猪为父本，经过杂交育种组建基础群，然后运用标记辅助选择BLUP估计育种值进行群体继代选育的。ADAMTS1是一种具有血栓反应基序的分解素和金属蛋白酶，为ADAMTS家族的成员之一，在卵泡发育、排卵过程中，ADAMTS1都发挥着重要作用，这与乐凯[9]的研究结果是一致的。在组织和细胞水平分析了猪ADAMTS1基因的表达模式，发现猪ADAMTS1基因受促性腺激素的诱导，在排卵前卵泡颗粒细胞中瞬时表达，也验证了ADAMTS1在排卵前发挥着重要作用。

本研究发现，ADAMTS1基因PvuⅡ酶切位点在淮猪新品系Ⅱ系猪群体中检测发现B等位基因占优势，并且在所有胎次产仔数呈现AB＞BB＞AA的趋势。其中，AB型个体的所有胎次产仔数显著高于BB型个体0.665头（P＜0.05）。以上结果表明，AB型和BB型母猪具有较高的产仔数，B等位基因为优势等位基因。这与其他研究者报道是一致的[10]。同时ADAMTS1基因存在于第7外显子72 bp上的C/G突变，该突变导致622位的精氨酸变成了脯氨酸，表明可能脯氨酸的改变会提高了母猪卵泡发育和排卵能力，从而提高母猪的产仔数。而在淮猪新品系Ⅱ系猪群中B等位基因达到较高水平，因此在今后选育中可适当提高B等位基因的频率。