猪轮状病毒病的流行与防控措施

李天芝，于新友，李 峰

（1.山东绿都生物科技有限公司，山东 滨州 256600；2.山东省滨州畜牧兽医研究院，山东 滨州 256600）

轮状病毒（rotavirus, RV）是呼肠孤病毒科轮状病毒属成员[1]，病毒粒子无囊膜，大致呈圆形，具有双层衣壳，直径大小约65～75 nm。病毒对外界环境抵抗力强，可感染猪、牛、羊、兔、禽等多种动物[2]，也能感染人，是一种人兽共患病原体。轮状病毒分为10个群（RVA、RVB、RVC、RVD、RVE、RVF、RVG、RVH、RVI、RVJ），其中，RVA、RVB、RVC、RVE、RVH是引起猪轮状病毒病（porcine rotavirus disease, PRVD）的重要病原。各品种和日龄猪均可感染，7日龄内仔猪受到的危害严重，死亡率高。临床表现为水样腹泻、呕吐、脱水、厌食、迅速消瘦等，成年猪感染后症状轻微，可耐过，当混感大肠杆菌、魏氏梭菌等其他病原时症状明显严重，给养猪业造成一定的经济损失。1974年，英国首次报道了轮状病毒病，随后在北美洲、非洲和澳大利亚均有相关报道。1981年，我国首次分离到RV，目前猪轮状病毒病在全国范围均有发病和流行。本文对猪轮状病毒病的病原学、流行病学、国内猪轮状病毒病流行现状、现有商品化疫苗及防控措施等方面进行了较全面的阐述，以期为该病的防控工作提供参考。

1 病原学

RV是冠状病毒科冠状病毒属病毒，无囊膜，大致呈球形。病毒粒子直径大小约65～75 nm，有双层衣壳。基因组由11个正链RNA片段组成，编码6个结构蛋白VP1～VP4、VP6、VP7和6个非结构蛋白Nsp1～Nsp6[3]，其中VP1、VP2和VP3构成了病毒内衣壳，VP6构成了病毒中间衣壳，VP7和VP4构成了病毒内衣壳，Nsp4对病毒致病性起决定性作用[4]。病毒粒子在氯化铯密度梯度中的浮密度为1.36～1.38 g/cm3。RV血清型众多，不同血清型之间交叉保护力差。部分RV具有血凝活性，能凝集人O型、兔、鸡等多种动物红细胞。RV致病性强，90个病毒粒子可引起不吃母乳的仔猪发生腹泻和排毒，1 g病猪排出的粪便含有的感染性病毒粒子为1×1010个。RV对外界环境抵抗力强，室温下粪便中病毒7个月后仍有感染性[5]，可稳定存在于自然环境中。自然干燥不能彻底灭活病毒，56 ℃30 min病毒仍能存活。RV对1%甲醛消毒剂有一定耐受性，对卤素或酚类消毒剂敏感。轮状病毒体外分离培养时需要添加胰酶，能用于轮状病毒培养的细胞有恒河猴肾细胞、胰岛细胞、结肠腺癌细胞、猪肾细胞等。

2 流行病学

RV感染宿主广泛，包括人、猪、牛、羊、兔、禽等。PRVD在我国流行范围广，抗体阳性率最高可达95.7%，病毒阳性率最高可达68.4%，且在腹泻和非腹泻猪群中均可检测到[6]。仔猪感染后能否导致临床发病还取决于多种因素，如免疫状况、年龄、感染剂量和毒力，环境温度和卫生状况以及其他微生物的相互作用和饲养条件等。病猪和带毒猪是PRVD的主要传染源。病毒主要通过病猪粪便排出体外，污染饮水、饲料及圈舍环境，通过粪口途径感染其他健康猪。各日龄猪均可感染发病，哺乳仔猪病情最严重，尤其是7日龄内仔猪，死亡率可高达100%，保育猪混感或继发感染其他病原时，死亡率增加。肥育猪感染后死亡率低，呈一过性腹泻，但饲料转化率降低，影响日增重和料重比[7]。成年猪发病较轻，但可长期隐性带毒，康复猪可持续排毒1～2个月。病毒能长期稳定存在于环境中，暴发PRVD的猪场很难彻底根除，存在再次发病的风险。

3 临床症状和病理变化

哺乳仔猪感染后通常24 h内可出现临床症状。主要表现为精神萎靡，厌食，不愿走动，呕吐，水样腹泻，粪便呈黄白色、灰色或黑色，呈水样或糊状，仔猪迅速脱水，消瘦，眼窝深陷，肛门周围被粪便污染，最终衰竭死亡。剖检可见，胃内有凝乳块，小肠后部病变严重，肠壁变薄，呈透明状，肠黏膜脱落，肠内容物为水样、灰黄色[8]，肠系膜淋巴结肿大。

4 实验室诊断方法

目前，用于检测猪轮状病毒的方法很多，包括病毒分离培养鉴定、病毒电镜观察、酶联免疫吸附试验（ELISA）、免疫层析试纸条方法、分子生物学检测方法等。

病毒分离为实验室PRVD确诊的金标准，RV初次分离时需要添加胰酶，病毒分离操作繁琐、时间长，不利于疾病的快速诊断确诊。电镜观察为将仔猪粪便及肠道内容物等病料，磷钨酸负染后，置电镜下观察，能直观看到病毒粒子形状和大小，但电镜价格昂贵，观察时需要经验丰富人员，当存在多病毒混感时仅靠形态观察很难区分[9]。王振玲等[10]采集仔猪病料用Marc-145细胞培养，分离到1株轮状病毒，连续盲传至4代出现细胞病变，用Marc-145细胞进行病毒噬斑纯化，挑取单克隆病毒株扩大培养后，将病毒感染Marc-145细胞7 d后，应用Reed-Muench法计算轮状病毒TCID50为106.6/0.1 mL，用感染细胞超薄切片进行电镜观察，可见典型的晶格状排列的轮状病毒粒子。

ELISA是根据抗原与抗体结合原理来对PRVD进行诊断，可用于血清抗体的检测或病原检测，一次检测样品量大，灵敏度高，检测速度快。孟柳等[11]建立了检测RV的双抗夹心ELISA方法。结果表明，该双抗体夹心ELISA方法的最佳反应条件为：猪抗RV IgG包被浓度为4 μg/mL，兔抗RV IgG最佳工作浓度为3.5 μg/mL，样品反应时间为90 min，酶标抗体工作浓度为1∶8 000，以OD450nm≥0.161作为阳性判定标准。该ELISA的重复性变异系数小于10%，最低检测限为1.25 μg/mL，并与猪瘟病毒、猪伪狂犬病病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒、猪大肠杆菌和沙门氏菌等病原无交叉反应。免疫层析试纸条方法在临床应用较多，操作简便，10 min左右出结果，不需要仪器和设备。刘兆磊等[12]制备了一种检测猪RV抗原的胶体金免疫层析试纸条。结果表明，所制备的试纸条用于检测猪RV感染的MA104细胞培养物，在检测线处出现红色反应带，未感染病毒的细胞培养物在检测线处未出现反应条带，试纸条检出病毒培养液（TCID50是10～6.25/0.1 mL）的最低限为1∶32稀释，不与相关的腹泻病毒如猪传染性胃肠炎病毒、流行性腹泻病毒发生反应。

分子生物学检测方法是猪轮状病毒实验室诊断最常用的方法，主要包括常规RT-PCR方法、荧光RT-PCR和环介导等温扩增（LAMP）方法。常规RT-PCR方法是以病毒的RNA为模板进行反转录，再以PCR进行核酸扩增来检测病毒的方法，以其简便、迅速、灵敏等优点在动物疾病诊断上得到了广泛的应用，是早期病毒检测采用的方法，因具有检测时间长、敏感性低、容易产生气溶胶污染等原因逐渐被淘汰。荧光RT-PCR是最常用的猪轮状病毒确诊方法，敏感性高，特异性好，适合临床疾病快速检测。陈如敬等[13]根据GenBank中登录的猪轮状病毒VP6基因序列特征，设计特异性的引物和探针，建立了检测猪RV的TaqMan荧光RT-PCR方法，该方法敏感性高，对病毒的最低检测限度为192拷贝/μL，特异性强，对猪常见病原检测均为阴性，重复性好，扩增相关系数为0.999，其组内和组间变异系数分别为0.25%～1.26%和0.31%～1.49%。LAMP方法是一种恒温核酸扩增技术，具有操作简便、快速、高效等特点，适合在现场和基层部门应用。胡兴义等[14]据猪RV VP7基因保守序列，设计特异性引物，建立了猪RV的RT-LAMP检测方法。结果显示，当外引物与内引物浓度比为200 nmol/L∶2 400 nmol/L（1∶12）、Bst DNA聚合酶浓度为0.64 U/μL、Mg2+浓度为2.5 mmol/L、dNTP浓度为1.0 mmol/L，在恒温（60 ℃）条件下作用60 min，扩增效果出现明显“梯状”条带，与猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪瘟病毒等无交叉反应，具有良好的特异性，最低检测分子拷贝数为1.0×102拷贝/μL，具有极高的敏感性。

5 国内猪轮状病毒病流行现状

胡兴义等[15]2013—2015年从贵州省27个规模猪场采集203份猪粪便样本，进行病原核酸检测，结果显示，猪轮状病毒的阳性率为7.88%（16/203）。周玲等[16]对2016年1月至2017年4月从广东地区规模化猪场采集的273份腹泻病料样品进行检测，结果显示，猪RV阳性病料64份，总阳性率23.4%，并未检测到猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）阳性样品。乔成鹏等[17]利用巢式PCR方法对2015年1月至2016年10月从我国东北三省地区多个规模化猪场采集的108份仔猪腹泻病料和15份健康仔猪粪便样品进行分析。结果显示，黑龙江省猪RVA阳性率为47.4%，猪RVB未检出，猪RVC阳性率为5.3%。辽宁省猪RVA阳性率为51.5%，猪RVB阳性率为3.03%，猪RVC阳性率为6.1%。吉林省猪RVA的阳性率为21.1%，猪RVB阳性率为7.1%，猪RVC阳性率7.1%。2017年1—12月份，哈兽维科市场部检测实验室对收到来自全国24个省市325个规模猪场的病料样品进行检测，结果显示：猪RV阳性率为5.60%（20/357）。何启盖等2016年1—7月共检测来自全国不同省份的133家猪场腹泻样品1 195份，结果显示，猪RV阳性样品数为31份，阳性率为2.6%。2017年中科基因对河南、湖南、四川等全国主要养殖地区送检的病料样品进行病原检测，结果显示，猪RV的阳性率为8.89%（12/135）。秦世新等[18]利用荧光定量PCR技术对湘西州部分猪场的420份粪便样品进行猪流行性腹泻病毒（PEDV）、猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）、猪轮状病毒（RV）的检测。结果显示，RV的阳性率最高，为36.9%，PEDV和RV混合感染率为4.8%，不同日龄的猪均可感染。董波等[19]对2014—2017年间来自闽西地区规模化猪场的173份腹泻病例进行了猪轮状病毒的实验室诊断，结果表明猪轮状病毒病主要发生在冬季（4.05%），其次是在春季（2.89%）；2014—2017年猪RV的阳性率分别为22.22%、30.90%、23.80%、2.70%。

6 防控措施

实行自繁自养全进全出的饲养模式，不从疫区引进种猪，引种猪只要隔离观察1个月，方可混入大群饲养。加强后备母猪驯化，可以采用疫苗免疫或返饲驯化，激发母猪产生黏膜免疫抗体，通过乳汁将黏膜免疫抗体传递给仔猪，通过乳汁途径使仔猪获得免疫力。通过返饲驯化后备母猪，一定要保证病料中无其他病原，并且病毒量要足够。设卖猪台，并远离生产区。饲喂优质饲料，禁止饲喂霉变饲料，补充足量的维生素及微量元素。

猪舍粪便及时清扫，每天两次，并运送到指定地点，避免猪舍内撒漏。每天对猪舍的工具间、饲料间、隔栏等处进行打扫与除尘。定期用3%火碱水、生石灰、二氯异氰尿酸钠或0.5%过氧乙酸等消毒，每周至少两次，需要注意的是当用生石灰进行猪舍消毒时，应先在猪舍地面洒水，再均匀洒生石灰。也可以采用干粉消毒剂进行消毒，不但能杀灭环境中潜在的病原，还能保持猪舍干燥，并吸附氨气、硫化氢等有害气体。禁止无关人员进入猪场，猪场人员进场前至少隔离24 h，必须要在更衣、淋浴、消毒之后才能够进入到生产区。猪场门口设消毒池，池内消毒液配制浓度要合理，并定期更换，车辆进入场区前一定要全方位清洗和消毒，并对消毒效果检测，合格后才能允许通行。厂区内人员和车流分开，单向通行。饲养人员禁止串舍，初产母猪上产床前需全面冲洗，并消毒，初生仔猪及时吃饱初乳。

猪舍保持适宜的温度和空气湿度，寒冷易诱发仔猪腹泻，一般母猪最适温度在25 ℃左右，哺乳仔猪最适温度30 ℃左右，空气湿度大病毒存活时间长，干燥的猪舍易于防控猪腹泻疾病的发生。做好猪瘟、口蹄疫等其他常规疫苗的免疫接种工作，并做好免疫记录。猪场可对母猪接种疫苗预防轮状病毒病的发生，疫苗可选用猪传染性胃肠炎、猪轮状病毒病、轮状病毒（G5型）二联活疫苗（弱毒华毒株+弱毒CV777株+NX株），待产母猪产前免疫两针，猪场可酌情选择跟胎免疫或季节免疫，要定期监测猪群抗体水平，及时查漏补缺，进行补免和加免。

猪群发病时，要隔离病猪，无害化处理病死猪，疫情早期切断传播途径，防止病原扩散。全群紧急接种疫苗。母猪和仔猪全群紧急后海穴接种疫苗2头份，7日龄内仔猪直接淘汰，7日龄以上仔猪可提前断奶，发病仔猪可对症治疗，口服补液盐（氯化钠3.5 g、氯化钾1.5 g、碳酸氢钠2.5 g、葡萄糖20 g，加温水至1 000 mL）。提高猪舍内温度，舍内用干粉消毒剂消毒，并在母猪躺卧区和仔猪休息区投撒干粉消毒剂。提供充足干净温水供猪饮用，饮水中添加抗生素，防止细菌继发感染，饲养管理人员严禁串舍。